Ce travail a été financé par le NIH subvention accordée à CA113734 F Yull et le ministère des Affaires des anciens combattants (TS Blackwell).

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par les soins des animaux Vanderbilt University institutionnel et Use Committee. 1. Préparation des souris transgéniques <ol><li> Chez les souris femelles, positifs pour le journaliste NGL (N F-KB-G FP-L uciferase) transgène (décrit précédemment 1) sont utilisés pour cette procédure. Lorsque les femmes sont au moins 6 semaines d&#39;âge, les accoupler avec un mâle de type sauvage FVB. Harem reproduction peut être utilisé (jusqu&#39;à 4 femelles dans une cage avec 1 mâle). (S&#39;il vous plaît noter: des souris de souche FVB ont été utilisés pour l&#39;étude des souris de souche comme les plus sombres C57BL6 peuvent aussi être utilisés, mais ces souris doit être rasée avant l&#39;imagerie.). </li><li> À partir de 15 jours après l&#39;accouplement, les femelles vérifier régulièrement les signes de la grossesse (grande circonférence en saillie). Chaque femelle doivent être séparés une fois enceinte et le mâle retiré de la cage d&#39;élevage une fois que la dernière femelle devient enceinte. </li><li> Regardez les femelles séparés d&#39;uned notez la date de naissance lors d&#39;une litière apparaît. Une portée de 6 chiots au moins est nécessaire pour la lactation adéquate. Huit jours après la naissance de la litière, procéder avec le protocole (voir la figure 1 pour un schéma chronologique). </li></ol> 2. Préparation pour injection <ol><li> Dissoudre le E. LPS coli dans du PBS à une concentration finale de 0,1 ug / ul. 50 ul de cette solution, soit un total de 5 ug, sera injecté dans la glande mammaire. Préparer un second tube de PBS seul à être utilisé pour le contrôle d&#39;injection. </li><li> Mise en place d&#39;un microscope à dissection et de l&#39;équipement anesthésie à l&#39;isoflurane. Un appareil ogive doit être fixé au stade de la portée de dissection où la souris sera placé. Une bonne source de lumière, qu&#39;il s&#39;agisse du champ d&#39;application lui-même ou de projecteurs supplémentaires devraient également être préparés. </li><li> Une fois que l&#39;installation est terminée, démarrez la machine isoflurane et le débit d&#39;air. </li></ol> 3. Injection intra-canalaire de LPS <ol><li> Chargez la seringue à aiguille courte avec 50 ul de la solution de LPS. Mettre cela de côté. </li><li> Anesthésier la souris pour être injecté en plaçant d&#39;abord la femelle dans une boîte remplie isoflurane et puis une fois que la respiration est ralentie, la déplacer sur la scène et placez son nez dans le ogive. Utilisez un pincement de l&#39;orteil pour confirmer la souris est totalement anesthésié. Surveiller la respiration de la souris tout au long de la procédure et ajuster le niveau de l&#39;isoflurane en conséquence. La cage contenant la portée de chiots que la femelle a été prise à partir devraient être soigneusement mis de côté jusqu&#39;à ce que le barrage peut être retourné après la procédure. </li><li> Utilisez une petite goutte d&#39;éthanol à 70% pour rendre la couche à plat et pour aider à visualiser le mamelon attachée au droit n ° 4 glande mammaire inguinale sur le bas-ventre de la souris. </li><li> Faites la mise au microscope à dissection pour une vue optimale sur le mamelon. Soigneusement utiliser un ensemble de pinces fines pour mieux tirer sur le mamelon de la peau, mais ne pas percer ou de blesser le mamelon en aucune façon. Lapince ne doit jamais être étroitement serrées ensemble lors de la manipulation des tissus, mais utilisé avec une tenue légère qui exige le minimum de stress sur le mamelon. </li><li> Utilisez la pince à la main gauche pour tenir doucement le mamelon en place. Ramenez lentement la seringue préremplie dans le champ de vision avec la main droite. La seringue doit être maintenu de façon qu&#39;aucun repositionnement doit se produire afin d&#39;injecter du contenu. </li><li> Lorsque la seringue est en vue, viser soigneusement à la petite ouverture canalaire dans le centre du mamelon, et insérez la seringue. </li><li> Sans repositionner la main, injecter le contenu de la seringue et retirer l&#39;aiguille de la tétine. </li><li> Chargez une seconde seringue avec 50 ul de PBS pour l&#39;injection de commande. Repositionner la souris sur la scène et de la meilleure vue de la gauche N ° 4 mamelon glande mammaire inguinale de l&#39;autre côté du bas-ventre de la souris. Répétez les étapes 3,4 à 3,7 à l&#39;aide de la seringue PBS-chargé. </li><li> Une fois que les injections sont complEté, cesser l&#39;anesthésie et déplacez la souris dans une cage de récupération. Surveiller la femelle afin d&#39;assurer qu&#39;elle devient mobile dans les 5 min. Laissez la souris pour rester dans la cage de récupération pendant 1 heure. Après 1 heure de récupération, placez le dos femelle dans la cage avec sa portée de chiots. Les souris doivent être surveillés régulièrement pendant 6 heures après l&#39;injection avant de procéder à l&#39;imagerie. Dans notre expérience, pas de conséquences indésirables ont été observés dans les deux la femelle ou les chiots pendant la période entre l&#39;injection et l&#39;imagerie. Cependant, si les signes de détresse sont observées chez la femelle (par exemple une posture voûtée, mordre ou de gardiennage du site d&#39;injection, léthargie générale) ou les petits (pas de mouvement, la couleur bleutée de la peau), l&#39;expérience devrait être abandonnée. </li></ol> 4. Bioluminescent d&#39;imagerie pour visualiser l&#39;activité de NF-kB <ol><li> Une fois que les souris ont été transportés à l&#39;établissement d&#39;imagerie, commencer la procédure d&#39;imagerie en ouvrant le logiciel et l&#39;initialisation de la machine. Allumez l&#39;estMachine oflurane et du débit d&#39;air, en sorte que l&#39;anesthésie est fluide à la fois le boîtier et la chambre d&#39;imagerie. </li><li> Placez la souris sous anesthésie à l&#39;isoflurane dans la zone de l&#39;anesthésie clair. Une fois que la respiration s&#39;est ralentie, utilisez un pincement de l&#39;orteil pour confirmer la souris est totalement anesthésié. Puis, injecter 100 ml de substrat luciférine dans la souris par injection rétro-orbitale 5 à l&#39;aide d&#39;une seringue stérile. </li><li> Transférer immédiatement la souris vers la chambre d&#39;imagerie et de placer son nez sous l&#39;isoflurane ogive qui s&#39;y trouvent. La souris doit être en position couchée. Fixez chaque pied de la scène avec du ruban adhésif. </li><li> Entrée des paramètres appropriés pour le logiciel IVIS de prendre à la fois une image de lumière blanche et d&#39;une image photographique de l&#39;activité bioluminescente. Le temps d&#39;exposition doit être de 10 sec. Acquérir l&#39;image. </li><li> Une fois que les images ont été acquises, permettent de récupérer la souris, puis placez le dos dans la cage avec ses chiots et de surveiller périodiquement. </li><li> La photographie et luminescentles images sont automatiquement superposées et affichées sur l&#39;écran, comme dans la figure 2. Analyser les images acquises par la mise région d&#39;intérêt ROI &quot;ou&quot; cercles de taille égale sur chaque côté du bas de l&#39;abdomen de la souris (une au-dessus de la glande PBS-injectée et une sur la glande LPS-injecté). Réglez la lecture à des photons. Un certain nombre devrait s&#39;afficher, indiquant la luminescence détectée à l&#39;intérieur de chaque ROI (voir la figure 2B). Utilisez ce numéro dans l&#39;analyse statistique. </li><li> Pour afficher une image optimale, ajuster encore le seuil du signal affiché. Cela ne modifie pas la luminescence totale de lecture, mais vous permettra de retirer signal de fond et de visualiser les différences entre le contrôle et la LPS-traitée glande. Diminuer la quantité de luminescence montre jusqu&#39;à ce que la glande PBS-injecté est exempt de bruit de fond. Cela devrait laisser le signal accrue dans la glande LPS-traitée encore visible dans l&#39;image, comme le montre la figure 2. </li><li> Additionaanalyse l, y compris les protéines et les analyses de l&#39;ARN, peut être complété par des tissus mammaires de la femelle recueillies post-mortem 6. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Pour obtenir des résultats interprétables par ces méthodes, le LPS (ou PBS) doit être perfusé uniquement dans les canaux galactophores, laissant intacts les tissus adjacents. L&#39;injection dans le tissu sous-cutané entourant le mamelon se traduira par une inflammation due à une blessure plutôt que l&#39;infection simulée. L&#39;injection de colorant bleu trypan dilué dans du PBS est utile lors de l&#39;apprentissage de la technique. Figure 3A montre une glande injecté avec succès infusé avec 100 pi de bleu trypan dans du PBS. Comme le montre, seul l&#39;arbre canalaire doit être rempli avec la solution injectée, et il ne devrait pas être bolus au site d&#39;injection. Un «bolus» dans ce contexte est une accumulation de liquide injecté au niveau du mamelon ou dans le tissu qui entoure le mamelon sans perfusion dans l&#39;arbre canalaire. C&#39;est shpropres à la figure 3B. S&#39;il vous plaît noter que les injections pratique montre la figure 3 ont été achevés en une femme au jour 21 de la lactation. Au plus fort de la lactation (jour 8-10, le stade auquel le LPS est injecté à l&#39;aide du protocole actuel), le lait est abondant et il est difficile de visualiser les conduits et déterminer si l&#39;injection a été effectuée correctement. Par conséquent, les points plus tard, le temps de l&#39;allaitement sont meilleurs pour la pratique des injections. Injection réussie de LPS dans les résultats des conduits mammaires chez augmenté l&#39;activité de NF-kB dans la glande. Cela devrait être évident chez la souris journaliste sur IVIS imagerie, et la glande LPS-injecté devrait avoir sensiblement plus forte activité luciférase (mesurée par comptage de photons) que la glande PBS-injecté, comme le montre la figure 2 (en moyenne, la glande LPS lit 200% du signal de commande PBS). Une augmentation statistiquement significative de la luminescence dans les glandes LPS traités comme un échantillonARED au contrôle controlatérale a été réalisé si la fin d&#39;un groupe de 4 souris 4. Une autre étude a également utilisé l&#39;injection intra-canalaire mammaire soit E. coli ou de LPS dans le NF-kB journaliste transgéniques. Semblable à notre propre travail, ces auteurs ont constaté une augmentation significative de l&#39;activité du rapporteur 6 heures après E. coli injection 2. S&#39;il vous plaît noter qu&#39;en raison constitutive de NF-kB activité dans le cerveau et d&#39;autres organes de l&#39;abdomen, la tête et l&#39;abdomen de souris nos reporters montrent régulièrement un signal lorsque imagé, même au départ, avant toute manipulation. Ainsi, ce signal doit être ignoré en ce qui concerne cette expérience. Un signal clair doit rester dans la glande mammaire LPS-injectée après la lecture d&#39;image est ajustée pour réduire la luminescence d&#39;arrière-plan dans la glande PBS. Figure 2 montre des images avec le fond réduit. Échec de l&#39;injection de la glande seraplus probable résultat d&#39;endommager le mamelon. Cela entraînera fait, la peau au niveau de l&#39;inflammation qui sera évident sur l&#39;imagerie. Ce type de signal blessure sera très forte et confinée à la région du mamelon où le dommage est survenu, n&#39;émanant pas toute la glande, comme on le voit, après une injection de LPS succès dans les conduits. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma de procédure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4030/4030fig2.jpg" /> Figure 2. Les résultats représentatifs de l&#39;imagerie IVIS bioluminescente. (A) Acquisition de l&#39;image avec un fond réduit, révélant augmentation de l&#39;activité luciférase dans la glande LPS-injecté. (B) l&#39;image de A avec la région de quantifications d&#39;intérêt ajouté. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4030/4030fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt = &quot;Figure 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4030/4030fig3.jpg&quot; /&gt; Figure 3 d&#39;injection de pratique:.. Glande mammaire injection de colorant par injection intracanalaire Pour tester la précision de l&#39;administration par l&#39;intermédiaire du mamelon, une souris au jour 21 de la lactation a été injecté avec 100 ul de colorant bleu trypan dilué dans du PBS. Après le sacrifice, la glande a été exposé pour la visualisation. (A) d&#39;injection de succès et (B) un bolus de colorant à la tétine.

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Ici, nous utilisons une souris transgénique journaliste NF-kB et une technique d&#39;injection optimisé à la mammite modèle, une inflammation du tissu mammaire le plus souvent causée par une infection bactérienne. L&#39;étape la plus critique dans cette procédure est l&#39;injection intracanalaire lui-même. Dans la pratique, il est généralement difficile de déterminer si l&#39;injection intracanalaire a été couronnée de succès. L&#39;injection des agents (LPS ou PBS) devrait ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Lipopolysaccharide d&#39;Escherichia coli (LPS) </td><td> Sigma </td><td> L 2880 </td><td> sérotype 055: B5 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc </td><td> 46-013 CM- </td><td></td></tr><tr><td> 31 seringue à insuline Gauge </td><td> Becton Dickinson </td><td> 328438 </td><td> Aiguille courte </td></tr><tr><td> Forceps </td><td> World Precision Instruments </td><td> 15908 </td><td></td></tr><tr><td> Dissection portée </td><td> Leica </td><td> M3Z </td><td></td></tr><tr><td> Terrell Isoflurane, USP </td><td> Minrad Inc pour Rx Elite </td><td> NDC 66794-011-25 </td><td></td></tr><tr><td> IVIS 200 système d&#39;imagerie &lt;/ Td&gt; <td> Caliper (anciennement Xenogen) </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Seringue pour injection luciférine </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309597 </td><td> 1cc; 26G5 / 8 </td></tr><tr><td> D-luciférine Firefly, monohydrate de sel de sodium (Substrat luciférine) </td><td> Chimie et Biologie Biosynth </td><td> L-8240 </td><td> Diluer à 10 mg / ml </td></tr></tbody></table>

intraductal injection of lps as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an nf-&kappa;b reporter transgenic

Les modèles animaux de maladies humaines sont nécessaires afin d&#39;étudier rigoureusement les étapes de progression de la maladie et des mécanismes connexes, et finalement, comme modèles pré-cliniques pour tester les interventions. Dans ces méthodes, nous décrivons une technique dans laquelle le lipopolysaccharide (LPS) est injecté dans la glande mammaire en lactation de la souris via le mamelon, mastite modélisation efficace, ou l&#39;inflammation, de la glande. Il en résulte une augmentation des infections simulées du facteur nucléaire kappa B (NF-kB) de signalisation, tels que révélés par l&#39;imagerie de bioluminescence d&#39;une souris NF-kB rapporteur de la luciférase 1. Notre but ultime dans le développement de ces méthodes était d&#39;étudier l&#39;inflammation associée à la mammite dans la glande en lactation, qui comprend souvent des rougeurs, de l&#39;enflure et l&#39;infiltration de cellules immunitaires 2,3. Par conséquent, nous étions tout à fait conscients que l&#39;incision ou tout autre type de blessure de la peau, le mamelon, ou de la glande afin d&#39;introduire les LPS pourraitpas être utilisés dans nos méthodes comme l&#39;approche serait probablement confondre la lecture de l&#39;inflammation. Nous avons également souhaité une méthode straight-forward qui ne nécessitent pas spécialement conçus dessinés à la main pipettes ou l&#39;utilisation de micro-manipulateurs d&#39;organiser ces outils spécialisés en place. Ainsi, nous avons décidé d&#39;utiliser une seringue à insuline disponible dans le commerce et d&#39;injecter l&#39;agent dans le conduit mammaire d&#39;un mamelon intacte. Cette méthode a été un succès et nous a permis d&#39;étudier l&#39;inflammation associée à l&#39;injection de LPS, sans effets supplémentaires recouvertes par le processus d&#39;injection. En outre, cette méthode a également utilisé un NF-kB luciférase reporter souris transgénique et la technologie d&#39;imagerie bioluminescente pour montrer visuellement et quantitativement augmenté de signalisation NF-kB dans la glande LPS-injecté 4. Ces méthodes sont d&#39;intérêt pour les chercheurs de nombreuses disciplines qui souhaitent modèle de maladie dans la glande mammaire en lactation, en fin de compte, la techniquedécrit ici pourrait être utilisée pour l&#39;injection d&#39;un certain nombre de substances, et ne se limite pas au LPS seulement.

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Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&amp;kappa;B Reporter Transgenic

Décrit ici est une technique dans laquelle lipopolysaccharide est injecté dans la glande mammaire en lactation de la souris via le mamelon pour simuler la mammite, une condition souvent causée par une infection bactérienne. Des résultats d&#39;injection de lipopolysaccharide à l&#39;augmentation du facteur nucléaire kappa B (NF-kB) de signalisation, visualisé par l&#39;imagerie de bioluminescence d&#39;une souris NF-kB rapporteur de la luciférase.

Injection intra-canalaire de LPS comme un modèle de souris de la mammite: signalisation visualisée via un transgénique NF-kB Reporter

Animal models of human disease are necessary in order to rigorously study stages of disease progression and associated mechanisms, and ultimately, as ...

intraductal-injection-lps-as-mouse-model-mastitis-signaling

Research

JoVE Journal

Medicine

Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

19.1K vues.  Vanderbilt University Medical Center. Décrit ici est une technique dans laquelle lipopolysaccharide est injecté dans la glande mammaire en lactation de la souris via le mamelon pour simuler la mammite, une condition souvent causée par une infection bactérienne. Des résultats d'injection de lipopolysaccharide à l'augmentation du facteur nucléaire kappa B (NF-kB) de signalisation, visualisé par l'imagerie de bioluminescence d'une souris NF-kB rapporteur de la luciférase.

Vidéo: Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

Mouse Bladder Wall Injection

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. Before starting injections, the surgical area must be cleaned with soap and water and antiseptic solution. Surgical equipment must be sterilized before use and between each animal. Each mouse is placed under inhaled isoflurane anesthesia (2-5% for induction, 1-3% for maintenance) and its bladder exposed by making a midline abdominal incision with scissors. If the bladder is full, it is partially decompressed by gentle squeezing between two fingers. The cell suspension of interest is intramurally injected into the wall of the bladder dome using a 29 or 30 gauge needle and 1 cc or smaller syringe. The wound is then closed using wound clips and the mouse allowed to recover on a warming pad. Bladder wall injection is a delicate microsurgical technique that can be mastered with practice.

Mouse bladder wall injection is a useful approach to orthotopically study bladder stem cell and cancer biology. This delicate microsurgical method can be mastered with careful technique and practice.

Injection mur souris vessie

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. ...

Recherche

Médecine

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Initiation de carcinome du sein métastatique en ciblant de l&#39;épithélium canalaire avec adénovirus Cre: un modèle de souris transgénique roman du cancer du sein

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Excitotoxiques stimulation de Microslices cerveau comme un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de l&#39;AVC

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson&#039;s Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

Élaboration d&#39;un modèle de rat à base alpha-synucléine pour la maladie de Parkinson par injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral adéno-associé recombinant

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have been established by tamoxifen induced deletion of Ccm genes in postnatal animals. These mouse models provide invaluable tools to investigate molecular mechanism and therapeutic approaches for CCM disease. An accurate and quantitative method to assess lesion burden and progression is essential to harness the full value of these animal models. Here, we demonstrate the induction of CCM disease in a mouse model and the use of the contrast enhanced X-ray micro computed tomography (micro-CT) method to measure CCM lesion burden in mouse brains. At postnatal day 1 (P1), we used 4-hydroxytamoxifen (4HT) to activate Cre recombinase activity from the Cdh5-CreErt2 transgene to cleave the floxed allele of Ccm2. CCM lesions in mouse brains were analyzed at P8. For micro-CT, iodine based Lugol&#39;s solution was used to enhance contrast in brain tissue. We have optimized the scan parameters and utilized a voxel dimension of 9.5 &#181;m, which lead to a minimum feature size of approximately 25 &#181;m. This resolution is sufficient to measure CCM lesion volume and number globally and accurately, and provide high-quality 3-D mapping of CCM lesions in mouse brains. This method enhances the value of the established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for CCM and other cerebrovascular diseases.

This protocol demonstrates the induction of cerebral cavernous malformation disease in a mouse model and uses contrast enhanced micro computed tomography to measure lesion burden. This method enhances the value of established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for cerebral cavernous malformation and other cerebrovascular diseases.

Induction et Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations dans le modèle murin

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant for targeting neovascular glaucoma, a sight-threatening complication of diabetic retinopathy. This method is based on the induction of iris vascular response by a series of self-sealing uveal punctures on BALB/c mice and takes advantage of the postpartum maturation of mouse ocular vasculature. Mouse pups undergo uveal punctures from postnatal day 12.5, when the pups naturally open their eyes, until postnatal day 24.5. Due to the transparency of the cornea, iris vasculature can be analyzed easily through time by noninvasive in vivo methods. Furthermore, the semitransparent iris of BALB/c mice can be flatmounted for detailed immunohistologic analysis with minimal non-specific background staining. In this model, angiogenesis is mainly driven by the inflammatory and plasminogen activating systems. The puncture-induced model is the first to induce iris neovascularization in small rodents, and has the advantage of allowing direct noninvasive in vivo analysis of the angiogenic process. Moreover, the model can be combined with angiogenic modulating substances, which highlights its potential in the study of angiogenesis with an in vivo perspective.

Iris neovascularization, a common complication of ischemic retinal disease, may lead to sight-threatening neovascular glaucoma. Here, we describe a murine protocol for inducing experimental iris neovascularization that may be used for noninvasive evaluation of angiogenesis-modulating substances.

Induite par la ponction de néovascularisation Iris comme un modèle de souris de Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

Oleic Acid-Injection in Pigs As a Model for Acute Respiratory Distress Syndrome

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit patients. Despite treatment advances over the last decades, ARDS patients still suffer mortality rates between 35 and 40%. There is still a need for further research to improve the outcome of patients suffering from ARDS. One problem is that no single animal model can mimic the complex pathomechanism of the acute respiratory distress syndrome, but several models exist to study different parts of it. Oleic acid injection (OAI)-induced lung injury is a well-established model for studying ventilation strategies, lung mechanics and ventilation/perfusion distribution in animals. OAI leads to severely impaired gas exchange, deterioration of lung mechanics and disruption of the alveolo-capillary barrier. The disadvantage of this model is the controversial mechanistic relevance of this model and the necessity for central venous access, which is challenging especially in smaller animal models. In summary, OAI-induced lung injury leads to reproducible results in small and large animals and hence represents a well-suited model for studying ARDS. Nevertheless, further research is necessary to find a model that mimics all parts of ARDS and lacks the problems associated with the different models existing today.

In this article, we present a protocol to induce acute lung injury in pigs by central-venous injection of oleic acid. This is an established animal model for studying the acute respiratory distress syndrome (ARDS).

Acide oléique-Injection chez les porcs comme modèle pour un Syndrome de détresse respiratoire aiguë

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Mesure de la contractilité isométrique de l’artère mésentérique de souris à l’aide de fil myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic fatty liver disease, metabolic liver disease, and liver cancer) requires experimental manipulation of animal models and in vitro cell cultures. Both techniques have limitations, such as the requirement of large numbers of animals for in vivo manipulation. However, in vitro cell cultures do not reproduce the structure and function of the multicellular hepatic environment. The use of precision-cut liver slices is a technique in which uniform slices of viable mouse liver are maintained in laboratory tissue culture for experimental manipulation. This technique occupies an experimental niche that exists between animal studies and in vitro cell culture methods. The presented protocol describes a straightforward and reliable method to isolate and culture precision-cut liver slices from mice. As an application of this technique, ex vivo liver slices are treated with bile acids to simulate cholestatic liver injury and ultimately assess the mechanisms of hepatic fibrogenesis.

This protocol provides a simple and reliable method for the production of viable precision-cut liver slices from mice. The ex vivo tissue samples can be maintained under laboratory tissue culture conditions for multiple days, providing a flexible model to examine liver pathobiology.

Murine Precision-Cut Liver Slices comme un modèle Ex Vivo de biologie du foie

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

A Mouse Model for Chronic Pancreatitis via Bile Duct TNBS Infusion

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. Several rodent models have been developed to study CP, of which the bile duct 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) infusion model replicates the features of neuropathic pain seen in CP. However, bile duct drug infusion in mice is technically challenging. This protocol demonstrates the procedure of bile duct TNBS infusion for generation of a CP mouse model. TNBS was infused into the pancreas through the ampulla of Vater in the duodenum. This protocol optimized drug volume, surgical techniques, and drug handling during the procedure. TNBS-treated mice showed features of CP as reflected by bodyweight and pancreas weight reductions, changes in pain-associated behaviors, and abnormal pancreatic morphology. With these improvements, mortality associated with TNBS injection was minimal. This procedure is not only critical in generating pancreatic disease models but is also useful in local pancreatic drug delivery.

Chronic pancreatitis (CP) is a disease characterized by inflammation and fibrosis of the pancreas, often associated with intractable abdominal pain. This article focuses on refining the technique to generate a mouse model of CP via bile duct infusion with 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS).

Un modèle murin pour la pancréatite chronique par perfusion de TNBS dans les voies biliaires

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. ...