1. Avant le processus, de préparer et de rassembler les éléments suivants <ol><li> S&#39;il vous plaît se référer à l&#39;image de la figure 1a) et 1b) pour la construction d&#39;une plateforme en bois pour retenir la souris durant la procédure. </li><li> Mélange de digestion des ganglions lymphatiques - HBSS + 1.25mg/ml collagénase TypeIV ou 2,5 mg / ml de collagénase D </li><li> Mélange de digestion des poumons - HBSS + 1 mg / ml de collagénase </li><li> Diluer billes de latex (1:20) dans du PBS pour l&#39;injection intrapéritonéale de visualiser les LDLNs </li></ol> Remarque: LDLNs sont petites et difficiles à trouver. Pour savoir comment les trouver, d&#39;injecter 200 pl de la dilution 1:20 rouges billes de latex fluorescentes ip dans la souris. Le péritoine drains à ces LDLNs 8. 24 hpi, exposer la cavité thoracique de la souris comme décrit ci-dessus. Le LDLNs sera de couleur rose à partir des billes qui a drainé de la cavité péritonéale. <ol start="5"><li> Globules rouges (RBC) Lysis Buffer - 0,15 M NH 4 Cl, 10 mM de KHCO3, 0,1 mM Na 2 EDTA dans 1L dH 2 0. Ajuster le pH à 7.2 à 7.4 et stocker à température ambiante. </li><li> Tamis cellulaire 70μm ou 100 microns </li><li> Solution mère d&#39;EDTA 0,5 M, pH = 8,0 </li><li> HBSS sans CaCl 2 et MgCl 2 </li><li> Ciseaux et pinces à bouts francs </li><li> Laryngoscope </li><li> Gavage aiguille (calibre 22) pliés à un angle (figure 2) </li><li> Styromousse bord et broches pour la diffusion de la souris </li><li> L&#39;équilibre pan Haut </li><li> Bleu d&#39;aniline Solution - 10mg/ml dans H 2 O </li></ol> Remarque: Nous allons utiliser cette solution pour la démonstration de la technique d&#39;injection elle. 2. Préparation et administration de la souris anesthésie <ol><li> Préparer un mélange de xylazine et de kétamine dans du PBS stérile afin que les concentrations finales sont 2mg/ml et 10mg/ml respectivement. </li><li> Peser la souris sur une balance à plateau supérieur. </li><li> Calculer la dose requise pour chaque souris. Dose au xylazine (2-4 mg / kg) et la kétamine (70-80 mg / kg) le poids du corps en utilisant un volume approprié du mélange préparé et injecter intaperitoneally. Chaque souche de souris peut nécessiter l&#39;optimisation de l&#39;anesthésie. Les souris ayant reçu trop d&#39;anesthésie peut avoir un taux de respiration réduite qui pourrait être fatale après l&#39;inoculum est instillée dans les poumons. </li><li> Après 3-5 minutes, observer la souris pour les effets de l&#39;anesthésie. Vérifiez les signes suivants afin de confirmer que la souris est totalement anesthésié: <ol><li> Le taux de respiration devrait ralentir. </li><li> La souris ne doit pas étirer son bras quand ramassé par le cou. </li><li> Il ne devrait pas y avoir de réponse lorsque les membres postérieurs sont stimulés. Si ces critères ne sont pas remplies, attendez quelques minutes et vérifier de nouveau avant de procéder à l&#39;étape suivante. </li></ol></li></ol> 3. Injection intratrachéale <ol><li> Préparer l&#39;inoculum dans une solution saline 50 pl. Remplir une seringue 1ml munie d&#39;une aiguille stérile de gavage plié avec l&#39;inoculum. La seringue doit être chargé avec une poche d&#39;air derrière le 100 ul d&#39;inoculum pour s&#39;assurer que l&#39;ensemble du fluide est instillée dans le poumon. </li><li> Placez la souris sur la plate-forme inclinée bois suspendue par ses incisives sur le fil et freiner doucement en place avec un morceau de ruban. </li><li> Allumez le laryngoscope avec votre main gauche (si vous êtes droitier) et de saisir une paire de pince émoussée terminée. Utilisez la pointe du laryngoscope et la pince pour détacher délicatement la bouche ouverte. </li><li> Avec la pince, tirez la langue dehors et maintenez-le sur le côté. Guide de la lame de laryngoscope vers l&#39;arrière de la bouche. Gardez le laryngoscope enfoncée très doucement dans un angle de 90 ° jusqu&#39;à ce que vous voyez à l&#39;ouverture de la trachée. Tenez le laryngoscope en place. Des précautions doivent être prises lorsque vous tirez la langue de la bouche et cela doit être fait avec précaution afin de ne survient des dommages tissulaires. </li><li> Avec votre autre main, prenez la seringue 1ml contenant l&#39;inoculum, équipé de l&#39;aiguille plié gavage avec votre main droite et insérer l&#39;aiguille dans la trachée jusqu&#39;à ce que le coude de l&#39;aiguille est par les incisives. Poussez le piston pour offrir équitablement l&#39;inoculum. L&#39;inoculum doit pas bulle. Retirez l&#39;aiguille de la trachée dès que possible. Souris suffoquent et meurent si la trachée est bloquée depuis trop longtemps. Tenir la souris verticale pendant quelques secondes afin de permettre inoculum pour être inhalées dans les poumons. </li><li> Prenez la souris hors de la plate-forme et le placer près d&#39;une lampe chauffante. Ne laissez pas les souris sous la chaleur directe pour des périodes de temps prolongées. La souris devrait être pleinement éveillé dans les 30 min après la procédure (temps de récupération peut varier en fonction des souches). Les souris doivent être observées avec diligence pendant ce temps et ne devraient pas être autorisés à avoir trop chaud ou trop froid, cela pourrait aussi mettre la souris dans une détresse respiratoire conduisant à la mort. </li></ol> 4. Récolte et transformation des noeuds lymphatiques drainant du poumon et des poumons pour la cytométrie en flux<ol><li> Sacrifice des souris en utilisant la méthode souhaitée selon les lignes directrices d&#39;euthanasie AVMA. Cela peut varier selon les résultats de récolte individuelles. L&#39;administration d&#39;une mortelle de pentobarbital de sodium ne soit un exemple d&#39;une procédure d&#39;euthanasie appropriées. Nous n&#39;avons pas vu les effets négatifs pulmonaires de l&#39;euthanasie par le CO 2. </li><li> Epingler les bras et les jambes sur une planche à dissection. Faire une incision le long du milieu de la face ventrale avec des ciseaux. Tirez doucement sur la peau et exposer les muscles de la paroi thoracique. </li><li> Faire des incisions à travers les muscles de la paroi thoracique afin d&#39;exposer les organes abdominaux. </li><li> Tenir la pointe du sternum à la pince et la ponction de la membrane. Couper la membrane le long des côtés de la cage thoracique. </li><li> Avec les ciseaux parallèles à la surface du panneau de dissection, couper à travers la cavité thoracique long de la ligne dorso-ventrale des deux côtés. </li><li> Soulevez légèrement la cage thoracique en place. Sur le côté droit du cœur, juste en dessous du thymus, la recherche de deux ganglions lymphatiques. Un ganglion lymphatique légèrement plus grand tiers sont situées au-dessous d&#39;un vaisseau sanguin artériel petite perpendiculaire à la trachée. Récolte des ganglions lymphatiques dans 1 ml de mélange de la digestion des ganglions lymphatiques. </li><li> Après la récolte des ganglions lymphatiques, maintenez le cœur avec une paire de pinces et de saisir les poumons avec un autre. Poumons récolte dans 3ml de PBS glacé dans une plaque à 6 puits. </li><li> Séparer les lobes des poumons, aspirer PBS et hachez les lobes en petits morceaux à l&#39;aide de pinces et ciseaux. Ajouter 3 ml du mélange de digestion pour les poumons. Conservez la plaque de 6 puits sur la glace pendant cette étape. </li><li> Incuber les ganglions lymphatiques pendant 25-30 minutes et les poumons pendant 30 min à 37 ° C. Ajouter EDTA à une concentration finale de 10 mM de chacun des mélanges de digestion pour arrêter la réaction et la placer sur la glace. </li><li> En utilisant une seringue de 3 ml, passer des morceaux de poumons à travers une aiguille de 18GA 3 fois. Écraser les morceaux de poumons et les ganglions travers les tamis cellulaire de 70 100 microns en utilisant l&#39;extrémité arrière d&#39;un piston de la seringue 1ml. Lavez les crépines cellule avec 10ml de HBSS sans Ca 2 + et Mg 2 +. Centrifuger à 500 xg pendant 5 min. </li><li> Reprendre le culot dans 5 ml de tampon de lyse RBC et incuber pendant 3 min à température ambiante. Ajouter 10 ml de HBSS sans Ca 2 + et Mg 2 + pour étancher la lyse. Centrifuger à 500 xg pendant 5 min. Amener les poumons et les suspensions LDLN seule cellule à 10ml et 5ml respectivement. Nombre des cellules vivantes en utilisant un hématimètre par exclusion du bleu trypan. Les cellules sont maintenant prêts à tacher la cytométrie en flux. 1 lobe du poumon pourrait être suffisant pour la cytométrie de flux. Autres lobes peut être utilisé pour d&#39;autres questions expérimentales au sein de la même souris comme les broyats de cytokines ou de tissus pour l&#39;histologie. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: PMA et les macrophages alvéolaires dans les poumons d&#39;acquérir de l&#39;antigène espaces alvéolaires des poumons qui la suit immédiatement l&#39;injection. La figure 3 montre le pourcentage de CD11c + (exprimé sur les PMA et les macrophages alvéolaires), les cellules qui sont positifs pour marqué par fluorescence des spores de Bacillus anthracis, 30 min après l&#39;injection. A cette époque, ~ 15,9% de CD45 + CD11c + cellules dans la suspension cellulaire seul poumon abrité les spores de Bacillus anthracis (figure 3, panneaux inférieurs). Pour une caractérisation plus poussée de cellules CD11c + dans les poumons, se référer à Kim et Braciale 4. Perles marqués par fluorescence sont couramment utilisés pour évaluer le trafic des antigènes particulaires au LDLNs 9. Pour évaluer ce type de transport à partir de poumons d&#39;LDLNs, des billes de latex fluorescentes ont été l&#39;injection de LPS et de LDLNs ont été analysés à 24 hpi. Environ 4% des cellules CD11c Salut dans le LDLNs hébergé perles fluorescentes au 24hpi (figure 4). Ces expériences montrent que représentant de ce protocole peut être utilisé efficacement pour suivre les cellules qui acquièrent des antigènes particulaires inhalées dans les poumons et les a ensuite le trafic vers le LDLNs. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Plateforme en bois pour retenir souris pendant qu&#39;elle injection. Un bloc de bois a été coupé à un angle et des barres de métal ont été équipés, vue de face Figure 1a) et la figure 1b vue de côté). Un petit morceau de fil a été enroulé autour de la barre de métal pour ancrer les incisives de la souris. Un morceau de ruban a été attachée à la plate-forme à nouer autour de la souris pour le maintenir en place pendant la procédure. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Gavage aiguilles d&#39;injection pour elle. Une aiguille de gavage (à droite) a été pliés à un angle de ~ 135 ° (à gauche) pour qu&#39;il l&#39;injection. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Pourcentage de toutes les cellules CD11c + dans les poumons qui abritent l&#39;GFP injectées exprimer Bacillus anthracis (Sterne-p6GFP), défi après 5h. AJ souris ont été défi avec 1x10 8 spores de Bacillus anthracis GFP et les poumons ont été analysés à 5h après l&#39;infection. Les parcelles de points montrent le pourcentage de CD11c + cellules pulmonaires qui sont positifs pour le Bacillus anthracis. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. Détection des billes fluorescentes (jaune / vert) dans les poumons des ganglions lymphatiques drainant les 24 heures suivant i. Injection de t. AJ souris ont reçu soit du PBS (panneau de gauche) ou 5x10 9 Fluoresbrite YG microsphères (0.5μm) avec 10 pg de LPS (panneau de droite) elle et LDLNs ont été analysés 24hpi. Représentant parcelles points montrent le pourcentage de cellules Salut CD11c dans l&#39;LDLNs que les perles fluorescentes comploté contre le port d&#39;un canal vide.

<ol>
	<li>Grayson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+lung+dendritic+cell+maturation+and+migration+during+respiratory+viral+infection.">Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection.</a> J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).</li><li>GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+dendritic+cell+subsets+differ+in+their+capacity+to+support+the+induction+of+virus-specific+cytotoxic+CD8++T+cell+responses.">Respiratory dendritic cell subsets differ in their capacity to support the induction of virus-specific cytotoxic CD8+ T cell responses.</a> PLoS One. 4, e4204-e4204 (2009).</li><li>Bakocevic, N., Worbs, T., Davalos-Misslitz, A., Forster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-dendritic+cell+interaction+dynamics+during+the+induction+of+respiratory+tolerance+and+immunity.">T cell-dendritic cell interaction dynamics during the induction of respiratory tolerance and immunity.</a> J Immunol. 184, 1317-1317 (2010).</li><li>Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+the+pathology+and+efficacy+of+vaccination+in+a+murine+model+of+inhalational+anthrax.">Influence of particle size on the pathology and efficacy of vaccination in a murine model of inhalational anthrax.</a> J Med Microbiol. , (2010).</li><li>Kiyono, H., Fukuyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NALT-+versus+Peyer's-patch-mediated+mucosal+immunity.">NALT- versus Peyer's-patch-mediated mucosal immunity.</a> Nat Rev Immunol. 4, 699-699 (2004).</li><li>Parungo, C. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transoral+tracheal+intubation+of+rodents+using+a+fiberoptic+laryngoscope.">Transoral tracheal intubation of rodents using a fiberoptic laryngoscope.</a> Lab Anim Sci. 36, 256-256 (1986).</li><li>Takahashi, S., Patrick, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+lymphatic+drainage+to+individual+thoracic+and+cervical+lymph+nodes+in+the+rat.">Patterns of lymphatic drainage to individual thoracic and cervical lymph nodes in the rat.</a> Lab Anim. 21, 31-31 (1987).</li><li>Broeck, W. V. a. n. d. e. n., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes:+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB/cAnNCrl+mice.">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-12 (2006).</li></ol>

Nous avons utilisé ce protocole pour étudier le trafic de spores de Bacillus anthracis à partir des poumons vers le LDLNs. Pour des applications similaires, le nombre de particules délivré aux poumons doivent être soigneusement choisis de sorte que le matériau injecté peut être détecté dans le LDLNs par cytométrie en flux. Nous avons également utilisé avec succès cette méthode pour le transfert adoptif de cellules et d&#39;étiquetage des populations spécifiques de cellules pulmonaires en utili...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Stariner cellulaire 70μm </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bleu d&#39;aniline </td><td> Fisher </td><td> A967-25 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;aiguille d&#39;alimentation animale </td><td> Popper et Fils Inc </td><td> 7920 </td><td></td></tr><tr><td> Collagénase </td><td> Sigma </td><td> C2139 </td><td></td></tr><tr><td> Collagénase TypeIV </td><td> Worthington </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Collagénase D </td><td> Roche </td><td> 11088974103 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite YG microsphères (0.5μm) </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 17152 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS sans chlorure de calcium et chlorure de magnésium </td><td> Invitrogen </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> La kétamine HCl (100mg/ml) </td><td> Hospira Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lame de laryngoscope </td><td> PennCentury, Inc </td><td> Pour le modèle LS-1 </td><td> Reportez-vous à <a href="http://www.penncentury.com">www.penncentury.com</a> </td></tr><tr><td> Léger laryngoscope à fibre optique </td><td> WelchAllyn </td><td> 80814 </td><td></td></tr><tr><td> Rouge perles fluorescentes (0.5μm) </td><td> Invitrogen </td><td> F8812 </td><td> Pour une injection ip </td></tr><tr><td> Xylazine (100mg/ml) </td><td> Laboratoires Lloyd </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry

Les cellules phagocytaires telles que les macrophages alvéolaires et les cellules dendritiques pulmonaires (PMA) en continu de l&#39;échantillon les antigènes des espaces alvéolaires dans les poumons. PMA, en particulier, sont connus pour migrer vers les ganglions lymphatiques drainant pulmonaires (LDLNs) où ils présentent les antigènes aux cellules T inhalé initier une réponse immunitaire appropriée à une variété d&#39;immunogènes 1,2. Pour le modèle des interactions entre les poumons et les antigènes en suspension dans les souris, les antigènes peuvent être administrés par voie intranasale 1,3,4, intratrachéale 5 ou 6 sous forme d&#39;aérosols. Livraison par chaque itinéraire implique distinctes des compétences techniques et des limitations qui doivent être considérés avant de concevoir une expérience. Par exemple, l&#39;exposition intranasale et sous forme d&#39;aérosol fournit des antigènes à la fois dans les poumons et les voies respiratoires supérieures. Ainsi antigènes peuvent accéder le tissu lymphoïde associé nasales (NALT) 7, potentiellement compliquer l&#39;interprétation des résultats. En outre, la déglutition, l&#39;éternuement et la fréquence respiratoire de la souris peut aussi conduire à des incohérences dans les doses délivrées. Bien que l&#39;implication des voies respiratoires supérieures peut être préférable pour certaines études, cela peut compliquer les expériences portant sur des événements spécifiquement initiée dans les poumons. Dans ce cadre, le intratrachéale (it) la route est préférable car elle offre le matériel de test directement dans les poumons et contourne le NALT. De nombreux protocoles d&#39;injection l&#39;impliquer intubation soit aveugles de la trachée à travers la cavité buccale ou de l&#39;exposition chirurgicale de la trachée d&#39;accéder à des poumons. Nous décrivons ici un simple, cohérente et non-chirurgical méthode pour qu&#39;il l&#39;instillation. L&#39;ouverture de la trachée est visualisée à l&#39;aide d&#39;un laryngoscope et une aiguille tordue gavage est ensuite inséré directement dans la trachée pour livrer l&#39;inoculum. Nous avons également décrire les procédures de récolte et de transformation des LDLNs et des poumons pour l&#39;analyse du trafic de l&#39;antigène par cytométrie en flux.

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Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Nous illustrons non-chirurgical de livraison du matériel de test dans les poumons des souris anesthésiées par la trachée. Cette méthode permet l&#39;exposition des poumons à des agents pathogènes bactériens et viraux, les cytokines, des anticorps, des perles, des produits chimiques, ou des colorants. En outre, nous décrivent la récolte et la transformation des poumons et les ganglions lymphatiques drainant pulmonaires (LDLNs) pour la cytométrie de flux.

Non-chirurgicale instillation intratrachéale de souris avec analyse des poumons et les ganglions lymphatiques drainant poumon par cytométrie en flux

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

non-surgical-intratracheal-instillation-mice-with-analysis-lungs-lung

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

57.0K vues.  University of Colorado School of Medicine. Nous illustrons non-chirurgical de livraison du matériel de test dans les poumons des souris anesthésiées par la trachée. Cette méthode permet l'exposition des poumons à des agents pathogènes bactériens et viraux, les cytokines, des anticorps, des perles, des produits chimiques, ou des colorants. En outre, nous décrivent la récolte et la transformation des poumons et les ganglions lymphatiques drainant pulmonaires (LDLNs) pour la cytométrie de flux.

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Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

L&#39;étude des interactions de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Avec des neutrophiles par cytométrie en flux et microscopie Time Lapse

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Recherche

Immunologie et infection

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Détection de nanoparticules fluorescentes Interactions avec immunitaire primaire sous-populations de cellules par cytométrie en flux

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with &lt;em&gt;Mycobacterium bovis&lt;/em&gt; Bacille Calmette-Gu&amp;#233;rin

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

Un test basé CFSE pour étudier la migration de la peau murine cellules dendritiques dans les ganglions lymphatiques de drainage lors de l&#39;infection avec<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacille Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.

This article provides detailed methodology to identify and quantify functional T lymphocyte subsets present within murine kidney, aorta and lymph nodes by intracellular staining and flow cytometry. The model of angiotensin II induced hypertension was chosen to explain, step-by-step, the procedures and fundamental principles of flow cytometry and intracellular staining.

Intracellulaires Coloration et cytométrie de flux pour identifier lymphocytaires sous-ensembles au sein murin Aorte, Reins et les ganglions lymphatiques dans un modèle de l&#39;hypertension

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

Collecte et traitement des ganglions lymphatiques des animaux de grande taille pour l’analyse de l’ARN : préparation pour l’étude de transcriptomique ganglion des grandes espèces animales

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolement et la Culture In Vitro de Macrophages alvéolaires murines et humaines

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Caractérisation des sous-ensembles de Monocyte humain de sang Flow Cytometry analyse

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, thymic derived Treg (tTreg) cells and peripherally induced Treg (pTreg) cells. They are present in different organs of our body and can be distinguished by specific markers, such as Helios and Neuropilin 1. It has been reported that tTreg cells are functionally more suppressive than pTreg cells. Therefore, it is important to determine the proportion of both tTreg and pTreg cells when investigating heterogeneous cell populations. Herein, we collected thymic glands, pancreatic draining lymph nodes and spleens from normoglycemic non-obese diabetic mice to distinguish tTreg cells from pTreg cells using flow cytometry. We manually prepared single cell suspensions from these organs. Fluorochrome conjugated surface CD4, CD8, CD25, and Neuropilin 1 antibodies were used to stain the cells. They were kept in the fridge overnight. On the next day, the cells were stained with fluorochrome conjugated intracellular Foxp3 and Helios antibodies. These markers were used to characterize the two subsets of Treg cells. This protocol demonstrates a simple but practical way to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen and use them for subsequent flow cytometric analysis.

Herein, we present a protocol to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen to further study these cells using flow cytometry. In addition, this protocol was used for determining the subsets of regulatory T cells using flow cytometry.

Détermination des sous-ensembles de lymphocytes T régulateurs dans le Thymus murin, pancréatique, drainage des ganglions lymphatiques et la rate à l’aide de cytométrie en flux

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Préparation de la moelle osseuse entière pour l'analyse de la cytométrie de masse des cellules de lignée neutrophile

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

A Model of Self-limited Acute Lung Injury by Unilateral Intra-bronchial Acid Instillation

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic findings similar to human acute respiratory distress syndrome (ARDS). The resulting alveolar edema, alveolar-capillary barrier damage, and leukocyte infiltration predominantly affect the left lung, preserving the right lung as an uninjured control and allowing animals to survive. This model of self-limited acute lung injury enables investigation of tissue resolution mechanisms, such as macrophage efferocytosis of apoptotic neutrophils and restitution of alveolar-capillary barrier integrity. This model has helped identify important roles for resolution agonists, including specialized pro-resolving mediators (SPMs), providing a foundation for the development of new therapeutic approaches for patients with ARDS.

Selective intra-bronchial acid instillation to the left lung in mice results in unilateral and self-limited acute lung injury that models human acute respiratory distress syndrome (ARDS) induced by gastric acid aspiration.

Un modèle de lésions pulmonaires aigues autolimitées par l'instillation unilatérale de l'acide intrabronchique

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic ...