Ce travail a été financé par l&#39;Institut ontarien de recherche sur le cancer (IORC), la Fondation Terry Fox et l&#39;American Association of Neurological Surgeons.

1. Culture de tissus tumeur au cerveau <ol><li> Ajouter 200 ul Libérase décongelés (Roche Applied Science) à 15 ml de LCR artificiel (ACSF-voir le tableau 1), puis placer en bain à 37 ° C de l&#39;eau. Liberase TM est un mélange d&#39;enzymes protéolytiques utilisés pour dissocier les échantillons de tissus primaires, ainsi que tumorspheres cultivées. Contrairement à la trypsine-EDTA, la méthode Libérase préserve l&#39;antigène de surface CD133. Pour un échantillon de tissu d&#39;environ 0,5 cm 3, nous utilisons 200 pi de Libérase. Si le tissu est plus petit, nous utilisons 100 ul. </li><li> Apportez une solution de chlorure d&#39;ammonium (technologies de cellules souches) à température ambiante. Solution de chlorure d&#39;ammonium lyse des globules rouges délicatement avec un effet minimal sur les autres cellules. Il ne contient pas de fixateur. </li><li> Dans le cabinet de sécurité biologique stérile, ajouter 5 ml de aCSF de récipient d&#39;échantillon, agiter pour rincer le tissu, puis pipeter hors tension. Cette étape permet d&#39;éliminer les globules rouges (RBC). </li><li> Transfert des tissus tumeur au cerveau à un stérile 100 mm Petri dish. </li><li> Avec des ciseaux ou des scalpels et des fines pinces, désagréger le tissu de consistance d&#39;un coulis. </li><li> Prélever un échantillon à l&#39;aide d&#39;une pipette 10 ml régulière ou une pince et des fragments de transfert dans le tube contenant préchauffé aCSF avec Libérase. </li><li> Lieu de l&#39;incubateur secoueur (30 min) et réglé à 37 ° C, pendant 15 min. </li><li> Filtrer le lysat tissulaire à 70 um tamis cellulaire dans un tube Falcon de 50 ml. </li><li> Faites tourner le filtrat vers le bas à 280 xg pendant 5 min. </li><li> Retirer le surnageant attentivement et évaluer la taille et la couleur du culot cellulaire résultant: granulés qui sont roses ou rouges indiquent un nombre croissant de globules rouges. </li><li> Remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS. </li><li> Ajouter une quantité appropriée de la solution de chlorure d&#39;ammonium (4-12 ml) en fonction de la taille et de la contamination culot de globules rouges (solution de chlorure d&#39;ammonium est très doux et des quantités accrues sont pas dangereux pour les cellules autres que les cellules rouges). </li><li> Incuber à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Cellules dérivéesvers le bas à 280 xg pendant 5 min. </li><li> Laver une fois avec 10 ml de PBS stérile. </li><li> Remettre en suspension dans 5 ml de milieu complet NSC (tableau 2) et le transfert d&#39;un ultra-faible pouvoir de fixation plaque 60 mm culture tissulaire (Corning). Nous utilisons ultra-basse des plaques de culture de liaison avec des surfaces d&#39;hydrogel liés de façon covalente qui sont hydrophiles et de charge neutre, afin de minimiser l&#39;attachement cellulaire médiée par la différenciation. </li></ol> Durant les premiers jours de culture, ne modifiez pas les médias: top-up uniquement avec 1-2 ml de milieu au besoin, puis continuer à observer les milieux de culture et le changement lorsque la couleur des médias devient légèrement jaune. 2. Tumorsphere dissociation de cytométrie en flux <ol><li> Évaluer tumorspheres sous le microscope: si la taille de la sphère est&gt; 100 um, la dissociation est recommandé que les grandes sphères peuvent se nécroser dans le centre. </li><li> Transfert culture à 15 ml tube conique. </li><li> Ajouter 2-3 ml stérile PBS de rincer soigneusement la plaque et ajouter à tube conique. </li><li> Centrifuger à 280 xg pendant 5 min. </li><li> Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 1 à 2 ml de PBS stérile. </li><li> Ajouter 10 ul Libérase. </li><li> Incuber à 37 ° C bain d&#39;eau pendant 3 min. Retirez et évaluer visuellement la suspension, si des amas de multiples vu, triturer doucement à l&#39;aide d&#39;une pointe de pipette 1000 pi. </li><li> Si l&#39;agglutination persiste, passez d&#39;incubation pour une période supplémentaire 1-2 min. </li><li> Laver les cellules en ajoutant 5 ml de PBS stérile et centrifugation à 280 xg pendant 5 min. </li><li> Retirer le surnageant et remettre en suspension dans du PBS stérile 500-1000 ul d&#39;EDTA 2 mM. </li><li> Évaluer le nombre et la viabilité cellulaire en utilisant du bleu trypan. </li><li> Réglez le nombre de cellules à 1 million / ml dans du PBS EDTA 2 mM. </li></ol> 3. La coloration de surface <ol><li> Transférer 100 ul de suspension cellulaire 1x10 6 / ml par test 12x75 mm tubes d&#39;écoulement. </li><li> Ajouter la quantité appropriée d&#39;anticorps. Contrôles isotypiques appariés doivent être utilisés pour chaqueanticorps (voir tableau 3). </li><li> Incuber pendant 30 min sur la glace. </li><li> Ajouter 2 ml de PBS + 2 mM EDTA à chaque tube d&#39;écoulement. </li><li> Centrifuger à 200 xg pendant 4 minutes, décanter et éponger. </li><li> Resuspendre le culot dans 300 ul de PBS EDTA 2 mM. </li><li> Ajouter 10 ul colorant viabilité 7AAD dans chaque tube et incuber pendant au moins 15 min sur la glace. </li><li> Analyse par cytométrie en flux. </li></ol> 4. Acquisition et analyse de cytométrie en flux Les détails de l&#39;acquisition et de l&#39;analyse des données de flux sont des instruments-dépendante. Représentatifs des échantillons négatifs sont gérés et réglages de l&#39;instrument mis en place pour l&#39;avenir (taille) et latérale (granularité) de dispersion. Ce modèle de diffusion permet à l&#39;utilisateur final de visualiser toutes les cellules dans l&#39;échantillon, y compris les débris. Une région est habituellement établi autour des cellules d&#39;intérêt. (Figure 4a) Les réglages sont alors mis en place pour tous les détecteurs de fluorescence nécessaires pour positionner les cellules négatives au sein de la première décennie du afparcelle intensité luorescence. Lorsque plus d&#39;un colorant ou fluorochrome est utilisé, simples contrôles colorés doit être utilisé pour établir des valeurs de compensation de couleur (soustraction d&#39;interférer émissions de fluorescence). Lors de l&#39;exécution cellules vivantes, un colorant tel que la viabilité 7-AAD (7-amino-actinomycine D - 655 488/emission excitation) est utilisé et une seconde zone établie afin d&#39;exclure les cellules mortes (figure 4b). Ces deux régions sont appliqués à une analyse plus poussée des échantillons. 5. Test d&#39;auto-renouvellement Le test clé qui est grandement facilité par la croissance clonale sphère est le test in vitro de la capacité d&#39;auto-renouvellement, le test de dilution limite. Tumorspheres sont dissociés et distribués à des dilutions vers le bas à une seule cellule par puits, et le taux de formation sphère subséquente de plus de 7 jours de culture est calculée. Au jour 7, le pourcentage de puits ne contenant pas de sphères de chaque cellule densité de placage (F 0) est calculée et tracéeen fonction du nombre de cellules par puits (x). Le nombre de cellules nécessaires pour former au moins une tumorsphere dans chaque puits est déterminée à partir du point où la ligne croise le niveau 0,37 (F 0 = e-x). Dans une distribution de Poisson de cellules, F 0 = 0,37 correspond à la dilution d&#39;une cellule par puits, de sorte que ce calcul (les 37% se croisent) reflète la fréquence des cellules souches clonogéniques dans la population de cellules entières (Figure 5). 6. Single Cell RT-PCR Les cellules individuelles de différentes populations sont triés par Beckman Coulter XDP MoFlo sur les sites de réaction sur une diapositive AmpliGrid (Beckman Coulter cat # AG480F). Seule cellule RT-PCR est réalisée en utilisant AmpliGrid Simple One Step RT-PCR System (Beckman Coulter cat # OAX04515) selon les spécifications du fabricant. En bref, une seule cellule est déposée dans chaque site de réaction d&#39;un coulisseau AmpliGrid; la présence d&#39;une cellule unique dans chaquesite de réaction confirmée par microscopie. La transcription inverse (RT) est réalisée immédiatement après le tri pour empêcher l&#39;échantillon ne soit compromise. Le mélange master RT est préparé frais, selon les instructions du kit (tableau 4). Nous avons utilisé 0,03 ul de 25 uM des amorces aléatoires (Promega) par réaction; 1 pi de mélange maître est ajouté au centre de chaque site de réaction. Ceci est immédiatement recouvert avec 5 pi de solution d&#39;étanchéité (Beckman Coulter cat # OAX04503). En utilisant une lame AmpliSpeed ​​cycleur (Beckman Coulter; cat # OAX04101), les lames sont incubées à 25 ° C pendant 10 min, 42 ° C pendant 10 min et 55 ° C pendant 45 min. Après une transcription inverse, 3 pl de DNase / RNase eau est ajouté à chaque site de réaction, et la totalité du mélange transféré dans un tube PCR (1 tube / le site). Dans une plaque de PCR, un volume de réaction de 10 ul est utilisé pour la PCR quantitative: 8 pl qPCR master mix (5 pi SYBR Green (Quanta), 1 pl d&#39;eau, 1 pl de 10 uM avant et mélanger amorce inverse) plus 2 &amp;mu; l du mélange RT. Pour quantification en temps réel, les échantillons sont analysés sur un cycleur BioRad utilisant le programme suivant: 95 ° C pendant 10 min, 45 cycles de 95 ° C pendant 30 secondes, 60 ° C pendant 60 secondes, 72 ° C pendant 60 secondes, puis par 10 min à 72 ° C et l&#39;analyse des courbes de fusion. Les valeurs de Ct ont été déterminées à l&#39;aide Opticon Monitor 3 (BioRad). Trois gènes peut être évaluée par cellule, y compris GAPDH comme gène de ménage. L&#39;expression des gènes est normalisée à l&#39;expression de GAPDH, selon 2-ΔCt. Au moins une douzaine de cellules individuelles de la même population de la même espèce peuvent être utilisés comme biologique reproduit pour compenser le manque de technique répétitions. 7. Les résultats représentatifs La figure 1 montre une imagerie par résonance magnétique (IRM) d&#39;un patient avec un représentant de GBM. Échantillons de tumeurs du cerveau sont obtenues à partir de patients consentants immédiatement après la chirurgie, tel qu&#39;approuvé par le Hamilton Health Sciences / S McMaster Healthciences éthique de la recherche. Une partie de chaque échantillon est donnée à la neuropathologiste pour le diagnostic clinique de routine. L&#39;échantillon restant est traité comme le montre la figure 2. Les cellules tumorales, une fois immatriculés dans les médias complets de cellules souches neurales de facteurs de croissance, tumorspheres comme montré dans la figure 3. Les cellules tumorales sont marquées avec des marqueurs de surface de cellules souches neurales CD133 et CD15 et analysées par cytométrie en flux comme le montre la figure 4. Les cellules individuelles provenant de populations différentes, par exemple, CD15 + / CD133 +, CD15 + / CD133-, CD15-/CD133 +, CD15-/CD133- sont ensuite triées dans des plaques de 96 puits (figure 5a) ou dans des diapositives AmpliGrid (Figure 6a). Dans la plaque de 96 puits, des cellules individuelles qui possèdent la capacité d&#39;auto-renouvellement (par exemple, les cellules CD133 +), (figure 5b), peuvent former tumorspheres (figure 5c) après incubation. Un graphe d&#39;auto-renouvellement peuvent être tracées (Figure 5d) en comptant le nombre de sphères formées par puits. Cellules individuelles triées dans le site de réaction de la lame AmpliGrid (Figure 6a). Les ARN extrait de cellules simples peuvent être une transcription inverse en utilisant la AmpliSpeed ​​Advalytix (Figure 6b). L&#39;ADNc obtenu est utilisé pour effectuer en temps réel RT-PCR (figure 6c). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig1.jpg" /> Figure 1. Imagerie par résonance magnétique (IRM) d&#39;un GBM patient. IRM du cerveau d&#39;une jeune fille de 16 ans avec une histoire d&#39;un mois de maux de tête et une histoire d&#39;une semaine de vomissements, léthargie et confusion visuelle. Séquence FLAIR axial montre une grande bi-hémisphérique (&quot;papillon&quot;) GBM. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig2.jpg" /> Figure 2. Traitement des tumeurs cérébrales. Échantillons de tumeurs cérébrales sont bénéficier du droit àminé des patients consentants immédiatement après la chirurgie. Ils sont dissociés mécaniquement comme indiqué (a) et sont ensuite dissociées enzymatiquement en aCSF avec Liberase par incubation dans un incubateur 30 min à bascule à 37 ° C pendant 15 min (b). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig3.jpg" /> Figure 3. Populations BTIC former tumorspheres en culture. Dissociées cellules tumorales du cerveau immatriculés dans les médias complets de cellules souches neurales de facteurs de croissance former tumorspheres. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig4.jpg" /> Figure 4. L&#39;analyse par cytométrie en flux des populations BTIC. (A) par rapport à l&#39;avenir propriétés de diffusion latérales offrent une image de toutes les cellules, y compris les débris (b) Les cellules qui se colorent avec le colorant viabilité 7-AAD sont exclus de l&#39;analyse. (C) La position des quadrants statistiques est déterminée à l&#39;aide des contrôles isotypiques appropriés (d) Les cellules tumorales colorées avec ma surfacerkers CD15 et CD133-PE-APC. (D) trieur de cellules MoFlo XDP. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4111/4111fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig5.jpg" /> Figure 5. Limiter l&#39;analyse dilution de BTICs révèle leur capacité d&#39;auto-renouvellement. (A) Cellules de dilutions variables sont classées dans 96 puits contenant 200 pl de NSC (b) une seule cellule par puits. (C) Après une période d&#39;incubation de 7 jours, un tumorsphere est formé. La morphologie de tumorspheres secondaire est identique à celle de tumorspheres primaires. (D) Les valeurs moyennes de x-interception valeurs peuvent être calculées à partir de l&#39;analyse de limiter la dilution pour chaque sous-type de tumeur à révéler le nombre de cellules nécessaires pour former au moins une tumorsphere par puits. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig6.jpg" /> Figure 6. Analyse de l&#39;expression des gènes d&#39;une cellule unique BTICest possible en utilisant une seule cellule technologie RT-PCR. (a) Les cellules individuelles d&#39;une population BTIC peuvent être triées sur des lames AmpliGrid. (B) la synthèse d&#39;ADNc est effectuée sur des cellules individuelles sur des lames AmpliGrid l&#39;aide de l&#39;AmpliSpeed ​​Advalytix. (C) La PCR quantitative en temps réel est effectuée sur le ADNc synthétisé à partir des cellules individuelles BTIC. <table border="1"><tbody><tr><td> 2M NaCl </td><td> 62 ml </td></tr><tr><td> 1M KCl </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 3,2 ml </td></tr><tr><td> 155 mM NaHCO 3 </td><td> 169 ml </td></tr><tr><td> Le glucose 1M </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 108 mM de CaCl 2 </td><td> 0,9256 ml </td></tr><tr><td> Purelab Ultra H 2 0 </td><td> 749,84 ml </td></tr></tbody></table> Tableau 1 liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) -. 1.000 ml. <table border="1"><tbody><tr><td> Média basales </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> 01:01 DMEM: F12 </td><td> 480 ml </td></tr><tr><td> Supplément N2 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 3,0 g </td></tr><tr><td> La N-acétylcystéine (60 pg / ml) </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Factor-1 la survie neuronale (NSF-1) </td><td> 10 ml </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Neuronaux médias de cellules souches. Médias NSC complets (fait frais avant utilisation): Médias NSC basales + 20 ng / ml d&#39;EGF (epidermal growth factor) + 20 ng / ml de bFGF (basic fibroblast growth factor) + 10 ng / ml LIF (facteur inhibiteur de leucémie) * + 10 ul / ml antibiotique-antimycotique * Facteur inhibiteur de leucémie (LIF): Ce réactif contient de Millipore une cytokine interleukine 6 classe, un protein qui supprime la différenciation spontanée des cellules souches promotion d&#39;entretien à long terme des cultures de cellules souches. <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorps </td><td> Fournisseur / CAT # </td><td> ul / test (dans 100 pl) </td></tr><tr><td> CD133 / 2 APC (293C3) </td><td> Miltenyi Biotec/130-090-854 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> IgG2b APC (contrôle isotypique) </td><td> Miltenyi Biotec/130-092-217 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> CD15PE </td><td> Beckman Coulter/IM1954U </td><td> 5 </td></tr><tr><td> IgG2a PE (isotype contrôle) </td><td> Beckman Coulter/A09141 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> Beckman Coulter/A07704 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tableau 3. Anticorps débit. <table border="1"><tbody><tr><td> Composant </td><td> Volume (1 réaction) </td><td> Volume (48 réactions) </td></tr><tr><td> 2x tampon de réaction cellulaire RT </td><td> 0,50 ul </td><td> 30,0 ul </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor (10 U / pl) </td><td> 0,02 ul </td><td> 1,2 pl </td></tr><tr><td> 5X Single Cell RT enhancer </td><td> 0,15 ul </td><td> 9,00 ul </td></tr><tr><td> Single Cell RT Enzyme Mix </td><td> 0,04 ul </td><td> 2,4 pl </td></tr><tr><td> Advablue (OAX04227) </td><td> 0,1 pl </td><td> 6,00 ul </td></tr><tr><td> Nucléase sans eau </td><td> compléter à 1 ul </td><td> faire jusqu&#39;à 60 pi </td></tr></tbody></table> Tableau 4. Composition du master mix RT RT-PCR pour cellule unique (cat # OAX04515).

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+does+not+predict+tumor+growth+potential+in+mouse+models+of+high-grade+glioma.">Self-renewal does not predict tumor growth potential in mouse models of high-grade glioma.</a> Cancer Cell. 21, 11 (2012).</li><li>Venugopal, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+marks+intermediate+precursors+during+differentiation+of+human+brain+tumor+initiating+cells.">Bmi1 marks intermediate precursors during differentiation of human brain tumor initiating cells.</a> Stem Cell Res. 8, 141 (2012).</li><li>Gerlinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N. 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Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 413 (2007).</li><li>Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4, e309 (2006).</li><li>Ross, I. L., Browne, C. M., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+individual+genes+in+eukaryotic+cells+occurs+randomly+and+infrequently.">Transcription of individual genes in eukaryotic cells occurs randomly and infrequently.</a> Immunol. Cell Biol. 72, 177 (1994).</li><li>Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+real-time+polymerase+chain+reaction.">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol. Aspects Med. 27, 95 (2006).</li><li>Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+mRNA+using+real-time+RT-PCR.">Quantification of mRNA using real-time RT-PCR.</a> Nat. Protoc. 1, 1559 (2006).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

L&#39;hypothèse de cellules souches du cancer 10, basé sur le travail dans la leucémie 21, le cancer du sein 11 et 4,5 le cancer du cerveau, suggère que seule une fraction relativement faible de cellules dans la tumeur, appelées cellules souches cancéreuses, possèdent une capacité à proliférer et largement auto renouveler. La plupart des cellules tumorales perdent leur capacité à proliférer et à se renouveler car ils se différencient en cellules qui deviennent l...

Les tumeurs cérébrales sont parmi les cancers les plus agressifs et hétérogènes connus chez l&#39;homme. Bien que leur détection précoce et le diagnostic ont été facilitées par la neuro-imagerie moderne de la technologie, nous manquons encore de traitement curatif pour les tumeurs cérébrales nombreuses, en particulier pour diffuses, celles envahissantes ou celles situées profondément dans le cerveau. Les tumeurs cérébrales représentent la première cause de mortalité par cancer chez les enfants en raison de leur caractère très agressif et souvent incurable. Le glioblastome (GBM), la tumeur cérébrale primaire la plus fréquente chez l&#39;adulte, est l&#39;un des cancers les plus agressifs de l&#39;homme, craint pour son pronostic toujours fatale 1. Cette tumeur très maligne astrocytaire (OMS grade 4) se produit généralement dans les hémisphères cérébraux des adultes, et peut également se produire chez les jeunes enfants et les nourrissons. Sa croissance est rapide et infiltrantes et de diagnostic des caractéristiques pathologiques comprennent pléomorphisme nucléaire, la prolifération microvasculaire et une nécrose 2,3. Pour adults avec glioblastome nouvellement diagnostiqué, la médiane de survie dépasse rarement 12 mois 1, avec des réponses généralement pauvres à toutes les modalités thérapeutiques. Nous avons remarqué qu&#39;il ya beaucoup de similitudes fonctionnelles et génétiques partagées par les cellules souches somatiques et les cellules cancéreuses, et que les voies moléculaires qui régulent le développement normal du cerveau sont souvent dérégulée dans le cancer. En appliquant les paradigmes en biologie des cellules souches à l&#39;étude des tumeurs du cerveau, nous étions les premiers chercheurs à identifier de manière prospective et purifier une sous-population de cellules de GBM de l&#39;homme qui présentaient les propriétés des cellules souches de la prolifération, l&#39;autorenouvellement et la différenciation in vitro 4 et dans vivo 5. Nous avons appliqué les conditions de culture et les dosages utilisés à l&#39;origine pour caractériser les cellules souches neurales normales (NSC) in vitro à de multiples 6,7 tumeurs cérébrales pédiatriques et adultes, et enrichi par ces cellules souches comme par tri cellulaire pour le marqueur de surface des cellules progénitrices neurales CD133 8 ,9. Le CD133 + fraction tumeur au cerveau contient des cellules qui ont une fréquence beaucoup plus élevée de l&#39;initiation tumorale que le CD133-fraction dans les cerveaux de souris NOD-SCID 5,10. Cette formellement établi que seul un sous-ensemble rare de cellules tumorales du cerveau avec des propriétés de cellules souches sont des tumeurs initier, de les gagner le nom de «tumeur au cerveau cellules initiatrices» ou «BTICs&quot;. L&#39;identification roman de BTICs offre de nouvelles perspectives sur la tumorigenèse cerveau humain, accordant son soutien résolu à l&#39;hypothèse des cellules souches cancéreuses 10-13 comme base pour de nombreuses tumeurs solides, et établit une nouvelle cible cellulaire pour des thérapies plus efficaces contre le cancer 14-20. Thérapies qui mettent l&#39;accent sur les tuant la majeure partie de la tumeur risquent de rater le rare tige-comme fraction, permettant à la tumeur de continuer à croître. Thérapies qui mettent l&#39;accent sur la destruction des cellules souches du cancer peut offrir un meilleur traitement et le pronostic des patients atteints de tumeurs cérébrales. Afin d&#39;étudier les populations BTIC, nous avons affiné notre culture protocoles spécifiquement sélectionnées pour les populations de cellules au sein des tumeurs cérébrales humaines qui possèdent des propriétés de cellules souches. Sans sérum, les cellules souches neurales (NSC) permet moyen pour le maintien d&#39;un état de cellules souches non différenciées, et l&#39;addition de facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF), le facteur de croissance épidermique (EGF), le facteur inhibiteur de leucémie et (LIF) permet de la prolifération des multi-puissant, d&#39;auto-renouvellement et extensibles tumorspheres de l&#39;homme. Ici, nous décrivons les méthodes impliquées dans le traitement des tumeurs cérébrales primaires et leur culture dans un milieu de NSC pour enrichir les populations BTIC. Nous avons appelé notre modèle expérimental &quot;isolats de patients BTIC» pour souligner le fait que ces cellules sont très peu cultivées dans des souches conditions de la cellule pour sélectionner des populations de cellules souches. immunomarquage ultérieur des populations BTIC pour les principaux marqueurs de cellules souches telles que CD133 et CD15 et l&#39;analyse par cytométrie en flux est également décrit. Nous discutons ensuite l&#39;analyse de dilution limitante,qui aide à étudier le potentiel d&#39;auto-renouvellement de BTICs. Enfin, nous explorons l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes de ces cellules rares en triant les cellules simples sur des lames AmpliGrid et l&#39;exécution seule cellule RT-PCR. Ces techniques sont également applicables aux autres tumeurs cérébrales telles que le médulloblastome, épendymome et les gliomes pédiatriques.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> 01:01 DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-082 </td></tr><tr><td> Supplément N2 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Wisent </td><td> 330-050 EL- </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Invitrogen </td><td> 15023-021 </td></tr><tr><td> N-acétylcystéine </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A9165-25g </td></tr><tr><td> Facteur de survie des neurones -1 (NSF-1) </td><td> Lonza Clonetics </td><td> CC-4323 </td></tr><tr><td> Facteur de croissance épidermique (EGF) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> E9644 </td></tr><tr><td> Facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0261 </td></tr><tr><td> Facteur inhibiteur de leucémie (LIF) </td><td> Millipore </td><td> LIF1010 </td></tr><tr><td> Antibiotique / antimycotique </td><td> Wisent </td><td> 450-115 EL- </td></tr><tr><td> Libérase TM </td><td> Roche </td><td> 05 401 119 001 </td></tr><tr><td> Une solution de chlorure d&#39;ammonium </td><td> Technologies des cellules souches </td><td> 07850 </td></tr></tbody></table>

processing of primary brain tumor tissue for stem cell assays and flow sorting

Les tumeurs cérébrales sont typiquement constitués de cellules morphologiquement différents qui expriment une variété de marqueurs de lignage neural. Seule une fraction relativement faible de cellules dans la tumeur avec des propriétés de cellules souches, appelées cellules tumorales du cerveau d&#39;amorçage (BTICs), possèdent une capacité à différencier selon plusieurs lignées, auto-renouvellement, et d&#39;initier des tumeurs in vivo. Nous avons appliqué les conditions de culture utilisés à l&#39;origine pour les normales des cellules souches neurales (NSC) à une variété de tumeurs cérébrales humaines et a constaté que cette méthode de culture sélectionne spécifiquement pour les souches de type populations. Un milieu sans sérum (NSC) permet le maintien d&#39;un état de cellules souches non différenciées, et l&#39;addition de bFGF et EGF permet la prolifération des multi-puissant, auto-renouvellement, et tumorspheres expansibles. Pour caractériser davantage la population BTIC chaque tumeur, nous évaluons marqueurs de surface cellulaire par cytométrie en flux. Nous pouvons également trier les populations d&#39;intérêt pour characteriz plus spécifiquestion. L&#39;auto-renouvellement des essais sont réalisés sur BTICs simples triés dans des plaques à 96 puits, la formation d&#39;tumorspheres après incubation à 37 ° C indique la présence d&#39;une tige ou d&#39;une cellule progénitrice. Le nombre de cellules multiples d&#39;une population donnée peut également être triées dans différents puits pour limiter l&#39;analyse de dilution, d&#39;analyser la capacité d&#39;auto-renouvellement. Nous pouvons également étudier expression différentielle des gènes dans une population cellulaire particulière en utilisant seule cellule RT-PCR. Les protocoles suivants décrivent les procédures pour la dissociation et de culture primaire d&#39;échantillons humains pour enrichir des populations BTIC, ainsi que la dissociation de tumorspheres. Sont également inclus les protocoles de coloration pour l&#39;analyse de cytométrie de flux ou tri, l&#39;auto-renouvellement des essais, et seule cellule RT-PCR.

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Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

L&#39;identification des cellules tumorales du cerveau d&#39;amorçage (BTICs), les cellules rares, dans un tumorales hétérogènes possédant des propriétés de cellules souches, offre de nouvelles perspectives sur la pathogénie des tumeurs cérébrales humaines. Nous avons amélioré les conditions de culture spécifiques pour enrichir BTICs, et nous avons l&#39;habitude d&#39;utiliser la cytométrie en flux pour enrichir davantage ces populations. D&#39;auto-renouvellement des tests et de l&#39;analyse par transcription seule cellule RT-PCR peut ensuite être effectuée sur ces cellules isolées.

Traitement des tissus de tumeur cérébrale primaire pour les essais sur les cellules souches et les flux de tri

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

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JoVE Journal

Medicine

17.9K vues.  McMaster University. L'identification des cellules tumorales du cerveau d'amorçage (BTICs), les cellules rares, dans un tumorales hétérogènes possédant des propriétés de cellules souches, offre de nouvelles perspectives sur la pathogénie des tumeurs cérébrales humaines. Nous avons amélioré les conditions de culture spécifiques pour enrichir BTICs, et nous avons l'habitude d'utiliser la cytométrie en flux pour enrichir davantage ces populations. D'auto-renouve...

Vidéo: Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological conditions including parasitic infection, inflammation, traumatic stress, graft-versus-host disease, diabetes and cancer1-7. In mice, MDSC express Mac-1 (CD11b) and Gr-1 (Ly6G and Ly6C) surface antigens7. It is important to note that MDSC are well studied in various tumor-bearing hosts where they are significantly expanded and suppress anti-tumor immune responses compared to na&iuml;ve counterparts7-10. However, depending on the pathological condition, there are different subpopulations of MDSC with distinct mechanisms and targets of suppression11,12. Therefore, effective methods to isolate viable MDSC populations are important in elucidating their different molecular mechanisms of suppression in vitro and in vivo.
Recently, the Ghansah group has reported the expansion of MDSC in a murine pancreatic cancer model. Our tumor-bearing MDSC display a loss of homeostasis and increased suppressive function compared to na&iuml;ve MDSC 13. MDSC percentages are significantly less in lymphoid compartments of na&iuml;ve vs. tumor-bearing mice. This is a major caveat, which often hinders accurate comparative analyses of these MDSC. Therefore, enriching Gr-1+ leukocytes from na&iuml;ve mice prior to Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) enhances purity, viability and significantly reduces sort time. However, enrichment of Gr-1+ leukocytes from tumor-bearing mice is optional as these are in abundance for quick FACS sorting. Therefore, in this protocol, we describe a highly efficient method of immunophenotyping MDSC and enriching Gr-1+ leukocytes from spleens of na&iuml;ve mice for sorting MDSC in a timely manner. Immunocompetent C57BL/6 mice are inoculated with murine Panc02 cells subcutaneously whereas na&iuml;ve mice receive 1XPBS. Approximately 30 days post inoculation; spleens are harvested and processed into single-cell suspensions using a cell dissociation sieve. Splenocytes are then Red Blood Cell (RBC) lysed and an aliquot of these leukocytes are stained using fluorochrome-conjugated antibodies against Mac-1 and Gr-1 to immunophenotype MDSC percentages using Flow Cytometry. In a parallel experiment, whole leukocytes from na&iuml;ve mice are stained with fluorescent-conjugated Gr-1 antibodies, incubated with PE-MicroBeads and positively selected using an automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS) Pro Separator. Next, an aliquot of Gr-1+ leukocytes are stained with Mac-1 antibodies to identify the increase in MDSC percentages using Flow Cytometry. Now, these Gr1+ enriched leukocytes are ready for FACS sorting of MDSC to be used in comparative analyses (na&iuml;ve vs. tumor- bearing) in in vivo and in vitro assays.

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

This is a rapid and comprehensive method of immunophenotyping Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) and enriching Gr-1+ leukocytes from mouse spleens. This method uses flow cytometry and AutoMACS Cell Sorting to enrich for viable Gr-1+ leukocytes prior to FACS sorting of MDSC for use in vivo and in vitro assays.

Préparation de dérivés myéloïdes cellules suppressives (MDSC) de Naive et pancréatique souris porteuses de tumeurs par cytométrie en flux et automatisé de tri magnétique de cellules activées (autoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

Recherche

Médecine

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

Isolement des noyaux de cardiomyocytes post-mortem des tissus

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Différenciation isolement, caractérisation et comparative de l&#39;homme dentaires cellules souches de pulpe Dérivé de dents permanentes à l&#39;aide de deux méthodes différentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Patient Culture cellulaire dérivée et isolement de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putatifs cellules souches du cancer du mélanome

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel haute résolution<em&gt; In vivo</em&gt; Technique d&#39;imagerie pour étudier la réponse dynamique des structures intracrâniennes à la croissance tumorale et de thérapeutique

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Adaptation des semi-automatique de circulation des cellules tumorales (CTC) Essais pour les applications cliniques et précliniques de recherche

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

Evaluation des propriétés de cellules souches en cellules humaines de l&#39;ovaire Carcinome utilisant MULTI et simples à base de cellules Sphères dosages

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Tumeur primaire et MEF cellule d&#39;isolement pour étudier métastases pulmonaires

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

Essais in vitro pour évaluer la formation et la perturbation du vaisseau en forme de barrière de sang-cerveau

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

Stratégies d’échantillonnage et traitement des échantillons de tissu de la biobanque de modèles biomédicaux porcins

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...