Ce travail a été soutenu par le Centre de la Floride pour la recherche tumeurs cérébrales, l&#39;Preston A. Wells Jr. centre de thérapie tumeur au cerveau et le National Institutes of Health (1R21CA141020-01).

1. Préparation de la suspension de cellules de glioblastome unique <ol><li> Gliomasphere culture est établie et maintenue en utilisant le test de neurosphères (NSA) comme décrit précédemment 2,11,12. </li><li> Au moment approprié pour les passages gliomaspheres, le milieu contenant les sphères est enlevé, placé dans une taille stérile tube approprié culture de tissus, et centrifugé à 800 tours par minute (110 g) pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Le surnageant est éliminé et le culot est remis en suspension de sphères dans 1 ml de 0,05% de trypsine-EDTA et incubées à 37 ° C dans un bain d&#39;eau pendant 3-5 min. </li><li> Un volume égal d&#39;inhibiteur de trypsine de soja est ensuite utilisé pour arrêter l&#39;activité trypsine. </li><li> La suspension cellulaire est doucement introduit à la pipette de haut en bas pour assurer l&#39;homogénéité et la neutralisation complète de l&#39;activité de la trypsine. </li><li> La suspension cellulaire est à nouveau centrifugé à 800 tours par minute pendant 5 min. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 1 ml de NeuroCultNSC milieu de base. </li><li> 10 pl de la suspension à cellule unique est mélangée avec 90μl de bleu trypan à effectuer un comptage des cellules. </li></ol> 2. La coloration avec la revue Cell Trace Carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE) Teinture verte fluorescente <ol><li> Pour chaque 1 million de cellules à colorer, 1 ml de réactif de coloration est préparée en ajoutant 1 pi de 5 mM de cellules CFSE colorant Trace (Molecular Probes, Invitrogen) à 1 ml de milieu de base NeuroCult NSC pour obtenir une concentration finale de coloration 5 uM . </li><li> Le réactif de coloration contenant les cellules est bien mélangé jusqu&#39;à homogénéité et incubée à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Pendant l&#39;incubation, glacée NeuroCult NSC milieu de base est préparée comme la solution de trempe. </li><li> Pour arrêter le processus de coloration, les volumes environ 5-10 de solution d&#39;arrêt glacée est ajoutée aux cellules CFSE-chargés. </li><li> La solution est ensuite centrifugée à 800 rpm pendant 5 min et le surnageant est éliminé. </li><li> A eest le point, il doit apparaître une pastille de cellules au fond du tube avec une teinte vert clair de couleur, indiquant la coloration a été couronnée de succès. </li><li> Les cellules sont lavées par remise en suspension du culot dans 1-2 ml de frais NeuroCult NSC milieu de base, la centrifugation à 800 rpm pendant 5 min et élimination du surnageant. Cette procédure est répétée pour un total de trois lavages. </li><li> Après le troisième lavage, les cellules sont remises en suspension dans 1 ml de milieu de base NeuroCult NSC et une numération cellulaire est effectuée. </li><li> Les cellules CFSE colorées sont ensuite étalées dans des flacons de culture de tissus stériles à une densité appropriée [50.000 cellules / ml] et placé dans un 37 ° C / 5% de CO2 incubateur humidifié. </li></ol> 3. Vérification en cours de chargement CFSE <ol><li> Cellules ensemencées dans la culture NSA peut être contrôlé au microscope à fluorescence afin de vérifier coloration CFSE. A ce stade, toutes les cellules présentent lumineux de couleur verte (Figure 1). En variante, une goutte de la suspension de cellules à partir deCellules colorées CFSE pourrait être placée sur une lame de microscope et recouverte d&#39;une lamelle couvre-objet à visualiser les cellules au microscope fluorescent. </li><li> Étiquetage CFSE réussie est confirmée par cytométrie en flux. Pas moins de 1-5 x 10 5 cellules de chaque groupe est suffisant pour la vérification de coloration CFSE. Le CFSE chargés et déchargés cellules cellules témoins négatifs sont remises en suspension dans respectivement 1 x-PBS ou NeuroCult NSC milieu de base pour un volume total de 500 ul et placés dans des tubes FACS séparés. </li><li> Le cytomètre de flux est ajusté en fonction de ses instructions mode d&#39;emploi pour les paramètres associés. CFSE a une longueur d&#39;onde d&#39;excitation maximale de 492 nm et le maximum d&#39;émission de 517 nm. </li><li> Tout d&#39;abord, les cellules témoins non chargées sont exécutées et les événements acquis sont enregistrés dans dispersion vers l&#39;avant et le côté (FSC vs SSC) et des parcelles histogramme, et la population de cellules principale est fermée (figure 2A). </li><li> De même, les cellules CFSE chargés sont analysées en utilisant le même paramètres utilisé pour les cellules de contrôle (figure 2B). </li></ol> 4. Isolement de la lente séparation [CFSE soit retenue] Population cellule à l&#39;aide Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) <ol><li> Lors de la division, de l&#39;intensité CFSE est diminuée et les cellules hGBM former gliomaspheres qui sont composées de cellules présentant différents niveaux d&#39;intensité de fluorescence verte (Figure 3). Lorsque les gliomaspheres ont atteint une taille moyenne d&#39;environ 150-200 pm de diamètre (environ 5 à 10 jours après chargement CFSE en fonction de la vitesse de croissance de la lignée cellulaire), le milieu contenant les sphères est enlevé, placé dans une culture tissulaire stérile de taille appropriée tube et centrifugée à 800 rpm pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Une suspension à cellule unique est préparé de la manière décrite dans les étapes précédentes, et les cellules sont remises en suspension dans du PBS pendant un nombre de cellules afin de préparer une suspension de cellules avec une densité allant jusqu&#39;à 10 7 cellules par millilitre. </li><li> À l&#39;arrièreer remettre en suspension les cellules dans un volume approprié de PBS, l&#39;iodure de propidium (PI, Sigma, 500 pg / ml) est ajouté à une concentration de 1 ug / ml de suspension cellulaire à exclure les cellules mortes lors du tri / analysés par cytométrie en flux. </li><li> Deux 15 ml stériles tubes de culture cellulaire contenant chacun 1 ml de NeuroCult complet NSC moyen est utilisé pour collecter les cellules triées lente séparation (cellules CFSE de retenue) et les cellules rapides de division (cellules CFSE dilution). </li><li> Tout d&#39;abord, la suspension de cellules dans le groupe de cellules non chargée est exécutée à travers le cytomètre de flux. </li><li> Les cellules (événements) sont tracées sur la base de diffusion vers l&#39;avant (FSC) contre side scatter (SSC) et les paramètres de tension pour les deux paramètres sont réglés de telle sorte que la majorité des cellules sont inclus dans le complot de flux. </li><li> Pour exclure les cellules mortes ou endommagées, les cellules sont tracées en fonction de la réactivité par rapport SSC PI et la population seule cellule vivante (PI négatif) est fermée. </li><li> Ensuite, une population homogène de cellules est sélectionnée en fonction fscatter scatter orward (FSC) par rapport latéral (SSC). </li><li> La seule population homogène de cellules vivantes est ensuite tracée dans un histogramme basé sur la fréquence de cellules CFSE mis en fonction de l&#39;intensité sur une échelle logarithmique. L&#39;intensité du laser est ajustée CFSE pour placer le signal négatif entre 0 et 100. </li><li> En utilisant les mêmes paramètres et une stratégie de déclenchement similaire, les cellules CFSE étiquetés sont passés à travers le cytomètre en flux et analysées (figure 4C). </li><li> Par la suite, une population de cellules divisant lente et une population globale (cellules en division rapide) sont identifiés en fonction de leur capacité à retenir CFSE (CFSE haut-dessus de 5% et CFSE bas-fond de 85%, respectivement). </li><li> Ces différentes populations de cellules sont ensuite triées dans différents tubes stériles de 15 ml de culture de tissus contenant 1 ml de milieu complet NSC. </li><li> Les cellules triées sont ensuite centrifugées à 800 rpm pendant 5 min. </li><li> Surnageant est éliminé et le culot est remis en suspension dans une approle volume approprié de milieu (en fonction du nombre d&#39;événements isolés ou la taille de pastille) et une numération cellulaire est effectuée. </li><li> Les cellules provenant de différentes populations triées sont ensuite étalées à 50.000 cellules par millilitre dans une fiole appropriée tissus stériles culture et placé dans un 37 ° C / 5% incubateur à CO2 humidifié pendant 5-10 jours avant d&#39;être des passages en série ou utilisés pour des expériences en aval. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Après le chargement CFSE, toutes les cellules présentent une fluorescence verte intense que visualisé au microscope (Figure 1). Cette couleur verte teintée peut être vu, même à l&#39;œil nu (voir la vidéo). L&#39;analyse de ces cellules avec la cytométrie en flux montre également très intense fluorescence verte par rapport aux cellules témoins (Figure 2). Sur les cellules CFSE placage chargés de la culture de neurosphères, ces cellules prolifèrent et forment 150-200 gliomaspheres um dans 5-10 jours. Comme les cellules prolifèrent, t<html> Il colorant fluorescent est également réparti entre les cellules filles lors des divisions, conduisant à la réduction de moitié de l&#39;intensité de fluorescence avec chaque division cellulaire. Glioblastomes sont fonctionnellement hétérogènes et sont constituées de cellules en prolifération sur des échelles de temps différentes. La méthode décrite dans ce protocole permet d&#39;identifier et d&#39;isoler rapides et lents cellules qui se divisent en vertu de leur capacité de diluer ou de conserver CFSE, respectivement (figure 3, voir aussi la vidéo). Analyse par cytométrie en flux de gliomaspheres dissociées générés à partir de cellules chargées CFSE par rapport aux cellules non chargées démontre diverses propriétés de rétention CFSE (figure 4). Cellules en division rapide (en bas 85%) ou lents cellules en division (les 5% - haute CFSE) gliomapshere exposition capacité à former lorsqu&#39;elles sont cultivées dans les conditions d&#39;essai neurosphères (figure 5). gure 1 &quot;/&gt; Figure 1. Cellules tumorales dissociées immédiatement après le chargement d&#39;un colorant CFSE. Les cellules présentent lumineux de couleur verte démontrant l&#39;étiquetage succès. Grossissement, 10 x. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Confirmation chargement CFSE par cytométrie en flux. A) des cellules non chargées, B) CFSE chargé cellules et c) comparer l&#39;intensité de fluorescence dans des cellules CFSE chargés par rapport à vide. Notez qu&#39;il ya plusieurs ordres de grandeur de différence dans l&#39;intensité de fluorescence entre les cellules marquées et non marquées. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig3.jpg" alt="Figure 3" /> La figure 3. Gliomasphere Un représentant dérivée d&#39;une cellule chargée par CFSE 6 jours après l&#39;étalement. Certaines cellules présentent une coloration CFSE très lumineux. Grossissement, 63 x. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3918/3918fig4.jpg&quot; alt = &quot;Figure 4&quot; /&gt; Figure 4. Représentant cytométrie de flux parcelles / histogrammes pour l&#39;isolement de rapides et lents cellules en division 6 jours après coloration CFSE. Une réactivité) FSC vs SSC montrer à la population cellule entière, B) SSC vs PI à exclure les cellules mortes ou endommagées, C) FSC vs SSC à la porte d&#39;une population cellulaire homogène en direct, D) Démontrer la présence de cellules CFSE de retenue 6 jours après le marquage CFSE comme en témoigne une plus grande intensité de la fluorescence par rapport au contrôle négatif. L&#39;histogramme montre également que l&#39;intensité CFSE pourri au fil du temps. E) Histogramme affichant la stratégie de déclenchement pour identifier les cellules CFSE de retenue (top 5%) et les cellules CFSE dilution (en bas de 85%). <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Gliomaspheres Représentant Figure 5. Générées à partir de <stronG&gt; A) de division rapide des cellules-bas (CFSE) et des cellules B) lente séparation (CFSE haut). Grossissement:. 10x et 20x respectivement C) représentant le nombre de cellules obtenues à partir de division rapide ou lent dérivé des cellules de culture au temps de passage. P &lt;0,05, test t. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3918/3918fig5large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma.">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).</li><li>Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deoxycholate+promotes+survival+of+breast+cancer+cells+by+reducing+the+level+of+pro-apoptotic+ceramide.">Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide.</a> Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).</li><li>Pece, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+molecular+heterogeneity+of+breast+cancers+correlates+with+their+cancer+stem+cell+content.">Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content.</a> Cell. 140, 62-73 (2010).</li><li>Roesch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temporarily+distinct+subpopulation+of+slow-cycling+melanoma+cells+is+required+for+continuous+tumor+growth.">A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth.</a> Cell. 141, 583-594 (2010).</li><li>Dembinski, J. L., Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+functional+analysis+of+a+slow+cycling+stem+cell-like+subpopulation+in+pancreas+adenocarcinoma.">Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).</li><li>Graham, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive,+quiescent,+Philadelphia-positive+stem+cells+from+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+are+insensitive+to+STI571+in+vitro.">Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro.</a> Blood. 99, 319-325 (2002).</li><li>Holyoake, T. 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(56), e3633-e3633 (2011).</li><li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Un nombre croissant d&#39;études ont démontré l&#39;importance d&#39;une lente séparation sous-compartiment des cellules dans le cancer qui contribuent à la formation de tumeurs et 2-8 la résistance au traitement. Par conséquent, il est essentiel de décrire et de standardiser les méthodes expérimentales permettant l&#39;étude de cette sous-population spécifique de cellules ou plus généralement de comparer des sous-populations avec des taux de croissance différents. Utilisation CFSE pour identif...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Type </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC milieu de base (Human) </td><td> Moyen </td><td> Technologies des cellules souches </td><td> 05750 </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC suppléments prolifération (Human) </td><td> Supplément de milieu </td><td> Technologies des cellules souches </td><td> 05753 </td></tr><tr><td> 0,05% de trypsine-EDTA </td><td> Réactif </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td></tr><tr><td> Inhibiteur de la trypsine du soja </td><td> Réactif </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomycine </td><td> Réactif </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> T25 flacon </td><td> Culture de conservation </td><td> Nalge Nunc internationale </td><td> 136196 </td></tr><tr><td> T80 flacon </td><td> Culture de conservation </td><td> Nalge Nunc internationale </td><td> 178905 </td></tr><tr><td> Tubes de 15 ml </td><td> Culture de conservation </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td></tr><tr><td> Tubes de 50 ml </td><td> Culture de conservation </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> FEM </td><td> Facteur de croissance </td><td> R &amp; D </td><td> 2028-EG </td></tr><tr><td> CFSE CellTrace cellulaire Kit prolifération </td><td> Division cellulaire fluorescent Suivi Dye </td><td> Molecular Probes, Invitrogen </td><td> C34554 </td></tr></tbody></table>

identification and isolation of slow-dividing cells in human glioblastoma using carboxy fluorescein succinimidyl ester (cfse)

Hétérogénéité tumorale représente une caractéristique fondamentale soutenant la robustesse de la tumeur et présente un obstacle majeur au développement de stratégies thérapeutiques 1. Pour surmonter le problème de l&#39;hétérogénéité tumorale, il est essentiel de développer des tests et des outils permettant phénotypique, (épi) l&#39;identification génétique et fonctionnelle et la caractérisation des sous-populations tumorales qui conduisent pathologies spécifiques aux maladies et représentent des cibles cliniquement pertinentes. Il est maintenant bien établi que les tumeurs présentent distinct sous-fractions de cellules avec des fréquences différentes de la division cellulaire, et que les critères fonctionnels d&#39;être lent vélo est positivement associée à la capacité de formation de tumeurs dans plusieurs cancers, notamment ceux du cerveau, du sein, de la peau et pancréas et leucémie 2-8. Le colorant fluorescent carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) a été utilisée pour suivre la fréquence de division des cellules in vitro et in vivo dans le sang tumors et des tumeurs solides tels que le glioblastome 2,7,8. La cellule-perméant non fluorescent pro-drogue de CFSE est converti par les estérases intracellulaires en un composé fluorescent, qui est retenu à l&#39;intérieur des cellules par liaison covalente à des protéines par réaction de son radical succinimidyle avec des groupes amine intracellulaires pour former des liaisons amide stables 9. Le colorant fluorescent est également réparti entre les cellules filles lors des divisions, conduisant à la réduction de moitié de l&#39;intensité de fluorescence avec chaque division cellulaire. Cela permet le suivi de la fréquence du cycle cellulaire jusqu&#39;à huit à dix tours de la division 10. Capacité de rétention CFSE a été utilisé avec des cellules tumorales du cerveau pour identifier et isoler une sous-population vélo lente (top 5% colorant retenue cellules) a démontré d&#39;être enrichie en activité des cellules souches du cancer 2. Ce protocole décrit la technique de coloration des cellules avec CFSE et l&#39;isolement des populations individuelles au sein d&#39;une culture de l&#39;homme glioblastome (GBM) dérivés de cellules possédant des taux de division différents en utilisant 2 cytométrie en flux. La technique a permis d&#39;identifier et d&#39;isoler une tumeur au cerveau lent vélo population de cellules en raison de leur capacité à retenir l&#39;étiquetage CFSE.

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Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

Ce protocole vidéo montre l&#39;application de la teinture fluorescente carboxyfluorescéine succinimidylester (CFSE) pour l&#39;identification et la séparation des différentes sous-populations de cellules de glioblastome humain basé sur la fréquence de la division cellulaire.

Identification et isolement des cellules ne se divisant lentement dans le glioblastome humain Utilisation carboxy fluorescéine succinimidyl ester (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

identification-isolation-slow-dividing-cells-human-glioblastoma-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

14.0K vues.  The University of Florida. Ce protocole vidéo montre l'application de la teinture fluorescente carboxyfluorescéine succinimidylester (CFSE) pour l'identification et la séparation des différentes sous-populations de cellules de glioblastome humain basé sur la fréquence de la division cellulaire.

Vidéo: Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Différenciation isolement, caractérisation et comparative de l&#39;homme dentaires cellules souches de pulpe Dérivé de dents permanentes à l&#39;aide de deux méthodes différentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Recherche

Médecine

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Isolement de cellules souches du cancer à partir d&#39;échantillons cancer de la prostate humaine

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolement, cryoconservation et de la culture des droits de cellules épithéliales Amnion pour des applications cliniques

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

Isolement des cellules endothéliales humaines lymphatique par multi-paramètres fluorescence tri cellulaire activé

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Etudier le cancer du pancréas Stem Cell Caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Génération de microtumeurs Utilisation 3D Biogel humain Système de culture et les cellules de glioblastome patients dérivés pour Kinomic Profilage et Testing Réponse Drug

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Appauvrissement des cellules de souris de xénogreffes de tumeurs humaines améliore de manière significative l&#39;analyse en aval des cellules cibles

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

Livraison intradermique de cellules souches thérapeutiques au glioblastome dans un modèle de souris

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

Caractérisation des cellules immunitaires dans les tissus adipeux humains à l’aide de cytométrie en flux

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

Isolement de cellules primaires de Decidual humaines des Membranes fœtales des placentas à terme

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...