L’initiation de l’apoptose est médiée par l’activation des caspases sur les plateformes moléculaires marqueurs. Nous présentons la détection du complexe clé de mort cellulaire d’initiation DISC, qui sert de plate-forme pour l’activation de la caspase-8. L’avantage de cette technique est qu’elle permet la détection de l’assemblage et de la composition du complexe DISC tout en fournissant des informations sur le traitement de la caspase-8 dans ce complexe.
Commencez l’expérience avec des cellules qui sont confluentes à 80% à 90% et adhérentes au plat. Jetez le milieu et ajoutez du milieu frais aux cellules adhérentes. Ensuite, stimulez les cellules avec la concentration sélectionnée de CD95L en maintenant la plaque à un angle et en pipetant le ligand dans le milieu sans toucher les cellules adhérentes.
Pour récolter les cellules, placez le plat cellulaire sur de la glace. Ajouter 10 millilitres de PBS froid à la suspension cellulaire et gratter les cellules attachées de la plaque. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres.
Lavez deux fois le plat cellulaire avec 10 millilitres de PBS froid et ajoutez la solution de lavage dans le même tube de 50 millilitres. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire à 500 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant, remettez en suspension la pastille de cellule dans un millilitre de PBS froid.
Transférez ensuite la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre. Centrifugez la suspension de la cellule et remettez en suspension la pastille de cellule dans un millilitre de PBS froid. Répétez la centrifugation une fois de plus, puis remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de tampon de lyse et incubé pendant 30 minutes sur de la glace.
Après l’incubation, centrifuger le lysat à la vitesse maximale pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, puis transférer le surnageant dans un tube propre. Jetez la pastille et prélevez un échantillon de 50 microlitres du lysat dans un autre tube pour déterminer la concentration en protéines. Pour l’immunoprécipitation, ajouter deux microlitres d’anticorps anti-APO1 et 10 microlitres de billes de sépharose de protéine A préparées au lysat.
Ajouter 10 microlitres des billes seules dans un tube séparé contenant le lysat pour servir de contrôle des perles. Incuber le mélange contenant le lysat, les anticorps et les billes de sépharose de protéine A pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec un mélange doux. Le lendemain, centrifuger le mélange à 500 fois G pendant quatre minutes à quatre degrés Celsius.
Après avoir jeté le surnageant, lavez les perles en ajoutant un millilitre de PBS froid et en jetant le surnageant après centrifugation. Répétez cette étape au moins trois fois. Après avoir jeté le dernier lavage PBS, aspirer les perles de préférence avec une seringue Hamilton de 50 microlitres.
Pour effectuer le transfert Western, ajoutez 20 microlitres de tampon de chargement 4X aux perles et chauffez à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Simultanément, chauffez les commandes de lysat à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Chargez les lysats, les immunoprécipitants et un étalon de protéines sur un gel SDS à 12,5% et exécutez avec une tension constante de 80 volts.
Une fois l’exécution du gel terminée, transférez les protéines du gel SDS vers une membrane de nitrocellulose. Une fois le transfert terminé, placez la membrane tachée dans une boîte et incubez-la pendant une heure dans une solution bloquante sous une légère agitation, puis lavez la membrane trois fois pendant cinq minutes avec du PBST. Pour détecter les protéines, ajoutez le premier anticorps primaire à la dilution indiquée à la membrane et incubez-le pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec une légère agitation.
Le lendemain, lavez la membrane avec trois lavages PBST de cinq minutes, puis incubez la membrane avec 20 millilitres d’anticorps secondaires en secouant doucement pendant une heure à température ambiante. Lavez à nouveau la membrane trois fois avec pbST. Après avoir jeté le dernier lavage PBST, ajoutez environ un millilitre de substrat de peroxydase de raifort à la membrane et détectez le signal de chimioluminescence.
La stimulation des cellules HeLa-CD95 du cancer du col de l’utérus avec CD95L a entraîné un niveau élevé de formation de CD95 DISC surveillé par immunoprécipitation CD95. CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 et c-FLIPS ont été observés dans ces immunoprécipitations CD95 indiquant une formation efficace de DISC. Les produits de clivage de p43-FLIP et p22-FLIP ont été détectés dans les immunoprécipitations, indiquant l’activation de la caspase-8.
Les cellules HeLa-CD95 qui surex expriment c-FLIP longtemps ont été utilisées pour l’analyse de la formation de CD95 DISC. Semblable aux cellules HeLa-CD95 parentales, aucun recrutement de FADD, de procaspase-9, de procaspase-10, de protéines c-FLIP et de PARP1 n’a été détecté dans les immunoprécipitations de ces cellules sans traitement CD95L. Les lymphocytes T primaires activés ont été caractérisés par des niveaux élevés de CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 et c-FLIPS dans les immunoprécipitations anti-CD95.
Cette technique permet l’analyse de la formation moléculaire de DISC, y compris le traitement de la caspase-8 au niveau du DISC. Toutes les étapes de lavage sont très importantes. De plus, les points de stimulation et les temps d’incubation doivent être pris au sérieux.
C’est la seule façon de mesurer l’assemblage sur le complexe DISC. Cependant, pour mesurer l’activation de la caspase-8, on peut également mettre en œuvre des tests d’activité de la caspase-8. Cette approche nous a permis d’obtenir de nouvelles informations sur l’initiation à l’apoptose.
