Nous tenons à remercier Andrea Tedeschi pour les aider à mettre les expériences de ChIP initiales en laboratoire et Ricco Lindner pour sa contribution à affiner les conditions de ChIP. Ce travail a été soutenu par la Fondation Hertie, la subvention de Fortune, Université de Tübingen, et la DFG DI subventions 1497/1-1 (tous accordés à Simone Di Giovanni).

1. Sciatique et une lésion du nerf dorsal colonne <ol><li> L&#39;animal est placé sur une serviette en chirurgie et en dessous une thermopad est présent pendant toute la procédure garder la température du corps de la souris à 37 ° C. Tous les animaux sont anesthésiés à la chirurgie avec une constante isoflurane / O 2 de l&#39;administration. Les instruments chirurgicaux sont autoclavés avant la procédure. </li><li> Pour les dommages sciatique, deux membres postérieurs sont soigneusement rasé, et l&#39;épilation est complété par épilateur génériques avant nettoyage de la peau avec de l&#39;alcool suivie par Betadyne 3 fois. </li><li> Le nerf sciatique est exposée par une incision de 4 mm postérieur et parallèlement au fémur à mi-cuisse à travers la peau et en répartissant les muscles en dehors de l&#39;biceps avec des pinces fines. </li><li> Le nerf sciatique est exposée, puis blessé, et la peau est fermée avec deux clips de suture. </li></ol> REMARQUE: La même incision est faite pour exposer le nerf sciatique, mais la plaie est suturée fermée laissant intacte le nerf de la blessure imposture. <ol start="5"><li> Pour des blessures de la colonne dorsale, le dos de la souris est soigneusement rasé, et l&#39;épilation est complété par épilateur génériques avant de nettoyer la peau avec de l&#39;alcool de pulvérisation / glisser. </li><li> La moelle épinière est exposée par une incision de 2,5 cm environ T7 à T13. La peau est écartées, et le tissu conjonctif est enlevée le long de la vertèbre de T9 à T11. </li><li> Une laminectomie est réalisée à T10 niveau </li></ol> NOTE: Pour la plupart des expériences, la laminectomie est considéré comme la blessure Sham. <ol start="8"><li> Quelques gouttes de xylocaïne sont ajoutées au tissu pour anesthésier le cordon, et la dure-mère est enlevée, en accordant une attention à ne pas toucher la moelle épinière. </li><li> Les colonnes dorsales sont blessés et le muscle est suturé proches, encore une fois attention à ne pas toucher la moelle épinière. Enfin, la peau est suturée fermé avec des clips de suture. La buprénorphine (0,1 mg / kg) doit être administré deux fois par jour pendant 48 heures ou jusqu&#39;à ce que ne sont plus nécessaires. </li></ol> 2. Réticulation <ol><li> Disséquer DRG L4 et L5 de souris blessées après l&#39;euthanasie. Collecter un total de 16 GHM dans glacée HBSS + inhibiteurs de la protéase à cocktails (2 blessés et 2 simulacre DRG de chaque animal, pour un total de 4 animaux). </li><li> Centrifuger brièvement le DRG, puis retirez délicatement le HBSS et ajouter 500 ul de 1% de formaldehyde dans du PBS + cocktail inhibiteurs de la protéase et incuber l&#39;échantillon pendant 30 minutes à 37 ° C. </li></ol> Étape critique. Utilisez fraîche, le formaldéhyde moléculaires de qualité de biologie. <ol start="3"><li> Ajouter 125 mM de glycine pour arrêter la fixation et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Centrifuger brièvement, aspirer hors de tampon, et lavez le tissu à deux reprises avec 500 ul PBS glacé + cocktail inhibiteurs de la protéase. </li></ol> 3. Préparation de noyaux et de cisaillement chromatine <ol><li> Aspirer le PBS, ajouter 400 ul de tampon de lyse SDS, transférer dans un tube à centrifuger pré-réfrigérés, et de perturber le tissu avec environ 30 coups à la micropestle. </li></ol> Étape critique. Lyse et des perturbations du tissu sont vitales pour un bon rendement de la chromatine réticulé. <ol start="2"><li> Soniquer l&#39;échantillon avec 8 impulsions, 10 secondes chacun à la sortie de 70% (Bandelin, Sonoplus GM70). </li></ol> ATTENTION. Le cisaillement de la chromatine doit être optimisé pour votre sonication notamment mis en place et la fragmentation de la chromatine correcte doit être vérifié avant de lancer l&#39;expérimentation IP réelle (voir la section 3). NOTE. Fragmentation de la chromatine pourrait également être effectuée par micrococcal nucléase (MNase) la digestion. En règle générale, la fragmentation par ultrasons est préféré pour des tissus fixés, tandis que la digestion est favorisée pour MNase immunoprécipitation tissus chromatine native. Réticulé, cisaillé chromatine peuvent être stockés à -80 ° C pendant 2 mois, mais éviter la répétition des cycles gel / dégel. 4. Analyse de la digestion de chromatine (recommandé) <ol><li> Retirer 10 ul de votre échantillon cisaillé chromatine pour l&#39;analyse. Ajouter 200 mM de NaCl à l&#39;échantillon et d&#39;inverser le cross-link par une incubation à 65 ° C pendant 2h. </li><li> Purifier l&#39;ADN (voir section 8) et d&#39;exécuter un gel d&#39;agarose 1%. ADN devraient être fragmentée à une longueur d&#39;environ 200-1000 pb (figure 1). </li></ol> ATTENTION. Plus de la fragmentation de la chromatine peut conduire à de signal diminué, tandis que la fragmentation incomplète conduira à la résolution diminuée et le fond a augmenté. 5. Immunoprécipitation <ol><li> Déterminer le nombre de réactions d&#39;immunoprécipitation (voir note ci-dessous), et diviser des échantillons aussi dans de nouveaux tubes. Porter le volume de chaquejusqu&#39;à 500 ul avec un tampon de puce + inhibiteurs de la protéase cocktail. </li><li> Retirer 5 ul de votre échantillon dilué et le transfert dans un nouveau tube. Ceci est votre échantillon d&#39;entrée de 1% et il sera stocké à -20 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire (article 7). </li><li> Pour chaque immunoprécipitation, ajouter des anticorps appropriés ou IgG normales de contrôle et incuber à 4 ° C pendant la nuit avec la rotation. </li></ol> NOTE. Lors de la détermination du nombre d&#39;immunoprécipitation, un contrôle positif (par exemple des anticorps histone H3) et un contrôle négatif (IgG normale) doit être envisagée. La quantité d&#39;anticorps utilisés pour chaque IP varie entre anticorps et doit être déterminée empiriquement. Cependant, il est généralement dans une fourchette de 2-10? G / immunoprécipitation. <ol start="4"><li> Pour votre immunoprécipiter anticorps / protéine / ADN complexes, ajouter 30 ul de ChIP grade Perles protéines G magnétique et incuber pendant 2 h à 4 ° C avec rotation. </li></ol> 6. Lavage <ol><li> Pour déroulant liés chromatine perles complexes, placer le tube sur le support magnétique. Attendez jusqu&#39;à ce que la solution est claire et ensuite retirer soigneusement votre surnageant. </li><li> Ajouter 1 ml de lavage faible teneur en sel (tampon ChIP) pour les perles et incuber à 4 ° C pendant 3-5 minutes avec une rotation, puis tirez vers le bas perles et aspirer hors laver comme à l&#39;étape 6.1. Répétez cette étape pour un total de 3 lavages. </li><li> Ajouter 1 ml de tampon de lavage élevées de sel (tampon puce + 350 mM NaCl) pour les perles et incuber pendant 3-5 minutes avec une rotation, puis tirez vers le bas perles et aspirer hors laver comme à l&#39;étape 6.1. </li></ol> 7. Élution et le renversement de réticulation <ol><li> Prenez vos échantillons d&#39;entrée de la -20 ° C, ajouter 150 ul de tampon d&#39;élution ChIP et mis de côté à température ambiante jusqu&#39;à l&#39;étape 7.5. </li><li> Ajouter 150 pi de tampon d&#39;élution ChIP 1x pour chaque échantillon IP de l&#39;étape 6.3. </li><li> Placer les tubes dans un thermomixer et éluer la chromatine des billes en incubant les échantillons à 65 ° C pendant 30 minutes avec vortex doux. </li><li> Pull-down des perles sur le rack magnétique, et transférer soigneusement la chromatine éluée (surnageant) dans de nouveaux tubes. </li><li> Pour tous les tubes, y compris vos échantillons d&#39;entrée, ajouter 200 mM de NaCl et 40 ug / réaction de la protéinase K et incuber à 65 ° C pendant 2 heures. </li></ol> NOTE. L&#39;étape d&#39;élution peut être effectuée à température ambiante, aussi, mais il pourrait ne pas être aussi efficace. 8. Récupération de l&#39;ADN <ol><li> Ajouter 1 volume de phénol / chloroforme à vos échantillons provenant de l&#39;étape 7.5 et vortex pendant 30 secondes. </li><li> Centrifuger à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse à température ambiante pendant 5 minutes. </li><li> Soigneusement récupérer les aqueuse (supérieure) de phase dans de nouveaux tubes, ajouter 1 volume de chloroforme à la phase aqueuse, et le vortex pendant 30 secondes. </li><li> Centrifuger à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse à température ambiante pendant 5 minutes. </li><li> Soigneusement récupérer les aqueuse (supérieure) de phase dans de nouveaux tubes, puis ajouter 300mm de NaOAc, 20 ug / réaction du glycogène, et 2,5 volumes d&#39;éthanol glacé de 100%. </li></ol> ATTENTION. L&#39;ajout d&#39;un transporteur, comme le glycogène, est nécessaire pour améliorer la précipitation de relativement petite taille des fragments d&#39;ADN. <ol start="6"><li> Incuber à -80 ° C pendant 2 heures pour précipiter l&#39;ADN. </li></ol> NOTE. L&#39;étape de précipitation peut aussi être effectuée durant la nuit à -20 ° C. <ol start="7"><li> Centrifuger les échantillons à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse pendant 20 minutes à 4 ° C. </li><li> Retirer délicatement le surnageant et laver les culots d&#39;ADN précipité avec 300 pi de la glace froide d&#39;éthanol à 70%. </li><li> Centrifuger les échantillons à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse pendant 10 minutes à 4 ° C. </li><li> Retirer délicatement le surnageant que possible et laisser les granulés séchés à l&#39;air. </li><li> Remettre en suspension dans 20 pl de stériles H 2 O. Les échantillons sont maintenant prêts pour la PCR, ou l&#39;ADN peuvent être conservés à -20 ° C. </li></ol> 9. Les résultats représentatifs Un résultat représentatif d&#39;une expérience de ChIP dans les GHM suivants lésion sciatique est montré (figures 1 et 2). Premièrement, nous montrons l&#39;ADN fragmenté à une longueur d&#39;environ 200-1000 pb (figure 1). Deuxièmement, nous démontrons une puce PCR signaux suivants à partir du promoteur proximal de la croissance associée protéines-43 (GAP-43) que lors d&#39;une lésion du nerf sciatique (couloir 4, la figure 2, 5 &#39;). Aucun signal PCR est présent lorsque l&#39;animal reçoit une blessure au simulacre seulement (piste 3), et lors de l&#39;utilisation normale des IgG sériques pour la propriété intellectuelle (piste 5 et 6). Pour tester la spécificité de l&#39;anticorps, nous avons analysé les échantillons d&#39;ADN identiques, mais a utilisé un ensemble d&#39;amorces de contrôle qui détecte une région dans le 3&#39;-UTR de notre gène d&#39;intérêt où aucune occupation est attendue. Signaux de PCR sont absents de toutes les voies (voies 3-6, Figure 2, 3 &#39;), sauf pour le signal d&#39;entrée, ce qui représente des échantillons d&#39;ADN non-IP comme standard de contrôle PCR (voies 1-2, Figure 2). Cette procédure peut être effectuée ChIP suivants soit des lésions de la colonne dorsale sciatique ou épinière telles que résumées dans un schéma (figure 3). <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Gel d&#39;agarose des inversé réticulé ADN qui a été cisaillé par sonication à la bonne plage de longueurs de fragment. <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Semi-quantitative des résultats de PCR à partir de tissus DRG suivants lésion du nerf sciatique montrant que p53 acétylée se lie à la région de GAP-43 promoteur proximal 48 heures après une lésion du nerf sciatique. Contrôle de PCR de l&#39;émission des tissus DRG mêmes que p53 acétylés ne pas se lier à une région de contrôle de l&#39;ADN située dans la région 3 &#39;non traduite (UTR) du gène GAP-43 (S = Sham, I = blessé). <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Un schéma général montrant la localisation des sites de lésion sur le nerf sciatique, et la colonne dorsale.

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	<li>Beirowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+analysis+of+Wallerian+degeneration+using+restricted+axonal+labelling+in+YFP-H+mice.">Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).</li><li>Carey, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , (2009).</li><li>Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(&amp;mu;ChIP.">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (&amp;mu;ChIP.</a> Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).</li><li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation:+optimization,+quantitative+analysis+and+data+normalization.+Plant+Methods.">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods.</a> 11, 3-11 (2007).</li><li>Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li><li>Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li><li>Makwana, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+in+successful+peripheral+regeneration.">Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration.</a> Febs J. 272, 2628-2638 (2005).</li><li>Tedeschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+p53-CBP/p300+transcription+module+is+required+for+GAP-43+expression,+axon+outgrowth,+and+regeneration.">A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration.</a> Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).</li><li>Teng, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regeneration+in+adult+CNS+neurons--signaling+molecules+and+pathways.">Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways.</a> J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).</li></ol>

Ce protocole fournit une méthode pour poser directement sur l&#39;environnement chromatine lors de la régénération axonale dans le système nerveux adulte après une lésion axonale. Il intègre le modèle de blessures avec des DRG immunoprécipitation de la chromatine à sonder l&#39;environnement et épigénétiques de la transcription à la suite de blessures ni à la SNP ou SNC. Il est particulièrement utile pour les enquêteurs qui voudraient caractériser les sites putatifs de liaison pour le facteur de trans...

<table border="1"><tbody><tr><th> Réactifs </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Tampon ChIP 10x </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 7008 </td></tr><tr><td> 2x Elution Buffer ChIP </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 7009 </td></tr><tr><td> ChIP grade protéines G Perles magnétiques </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 9006 </td></tr><tr><td> Rack Grip Magna (8 également) </td><td> Millipore </td><td> 20-400 </td></tr><tr><td> Chloroforme </td><td> MERCK </td><td> De l&#39;ONU 1888 </td></tr><tr><td> Formaldéhyde 37% </td><td> ROTH </td><td> CP10.1 </td></tr><tr><td> 10x solution de glycine </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 7005 </td></tr><tr><td> Le glycogène </td><td> Sigma </td><td> G1767 </td></tr><tr><td> HBSS 10x </td><td> Gibco </td><td> 14185 </td></tr><tr><td> Histone H3 d&#39;anticorps (lapin) </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 2650 </td></tr><tr><td> Normale IgG de lapin </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 2729 </td></tr><tr><td> Phénol / chloroforme / alcool isoamylique </td><td> ROTH </td><td> A156.1 </td></tr><tr><td> Comprimés protéase cocktail Inhibiteurs </td><td> Roche </td><td> 04 693 116 001 </td></tr><tr><td> Protéinase K (20 mg / ml) </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> 10012 </td></tr><tr><td> SDS Lysis Buffer </td><td> Upstate </td><td> 20-163 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> Équipement nécessaire </th></tr><tr><td> Sonicator </td></tr><tr><td> Micropestle </td></tr><tr><td> Microcentrifugeuse </td></tr><tr><td> Thermomixer </td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury

Axones dans le système nerveux central (SNC) ne se régénèrent pas, tandis que ceux du système nerveux périphérique (SNP) ne régénère dans une certaine mesure après une blessure (Teng et al., 2006). Il est reconnu que les programmes de transcription essentiels à la croissance des neurites et axonales sont réactivés lors d&#39;une lésion au niveau du SNP (Makwana et al., 2005). Toutefois, les outils disponibles pour analyser la régulation des gènes in vivo des neurones sont limitées et souvent difficiles. Les ganglions de la racine dorsale (DRG) offrent un système de blessures, car les deux excellents modèle de SNC et du SNP sont innervés par un axone bifurqué provenant du soma mêmes. Les ganglions représentent une collection discrète de corps cellulaires où tous les événements transcriptionnels se produire, et fournir ainsi une région clairement définie de l&#39;activité transcriptionnelle qui peuvent être facilement et de façon reproductible retiré de l&#39;animal. Blessure de fibres nerveuses au niveau du SNP (nerf sciatique par exemple), où la régénération axonale ne se produisent, devraient révéler un ensemble de programmes transcriptionnels qui sont distincts de ceux répondant à une blessure similaire dans le SNC, où la régénération n&#39;a pas lieu (par exemple, la moelle épinière ). Sites pour le facteur de transcription liant, histones et modification de l&#39;ADN résultant d&#39;une blessure à l&#39;autre SNP ou SNC peuvent être caractérisés en utilisant immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Ici, nous décrivons un protocole puce en utilisant les tissus fixés DRG la souris après une lésion axonale. Cette puissante combinaison fournit un moyen pour caractériser l&#39;environnement chromatine pro-régénération nécessaire pour favoriser la régénération axonale.

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Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Nous présentons une méthode pour immunoprécipitation de la chromatine du tissu racinaire ganglions dorsaux après une lésion axonale. L&#39;approche peut être utilisée pour identifier des sites spécifiques facteur de transcription liant et la modification épigénétique de l&#39;importance des histones et l&#39;ADN pour la régénération des axones lésés à la fois dans le système nerveux central et périphérique.

Immunoprécipitation de la chromatine du tissu racinaire ganglions dorsaux suivants lésions axonales

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

chromatin-immunoprecipitation-from-dorsal-root-ganglia-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.0K vues.  University of Tuebingen. Nous présentons une méthode pour immunoprécipitation de la chromatine du tissu racinaire ganglions dorsaux après une lésion axonale. L'approche peut être utilisée pour identifier des sites spécifiques facteur de transcription liant et la modification épigénétique de l'importance des histones et l'ADN pour la régénération des axones lésés à la fois dans le système nerveux central et périphérique.

Vidéo: Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Imagerie en temps réel des axones de la racine dorsale après Rhizotomie

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Recherche

Neurosciences

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Étude génétique de la régénération des axones avec cultivées adultes dorsaux neurones ganglion de la racine

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

Imagerie intravitale de axonales Interactions avec microglie et les macrophages de souris dans une colonne dorsale Crush blessures

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Les ganglions rachidiens neurones et les cellules souches différenciées dérivées de tissu adipeux: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-culture modèle pour étudier la régénération des nerfs périphériques

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.

Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.

Extrusion hydraulique de la moelle épinière et isolement de ganglions rachidiens en Rongeurs

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Racine Dorsale Ganglion Injection et Racine Dorsale Crush blessures comme modèle pour la régénération sensorielle Axon

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

Isolement des ganglions de la racine dorsale et la Culture primaire afin d’étudier la libération des neurotransmetteurs

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Isolement rapide des macrophages de ganglion de racine dorsal

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Purification des fibroblastes et des cellules de Schwann des nerfs sensoriels et moteurs in vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as well as various other cell types. Published culture protocols often refer to whole dissociated DRG cultures as being neuronal, despite the presence of fibroblasts, Schwann cells, macrophages, and lymphocytes. While these whole DRG cultures are sufficient for imaging applications where neurons can be discerned based on morphology or staining, protein or RNA homogenates collected from these cultures are not primarily neuronal in origin. Here, we describe an immunopanning sequence for cultured mouse DRGs. The goal of this method is to enrich DRG cultures for neurons by removing other cell types. Immunopanning refers to a method of removing cell types by adhering antibodies to cell culture dishes. Using these dishes, we can negatively select against and reduce the number of fibroblasts, immune cells, and Schwann cells in culture. This method allows us to increase the percentage of neurons in cultures.

This paper describes an immunopanning protocol for adult mouse dorsal root ganglia. By adhering antibodies to culture plates, we can negatively select and remove non-neuronal cells. We show that the cultures are enriched for neurons using this protocol, allowing for an in-depth study of neuronal responses to manipulation.

Enrichissement de cultures de neurones ganglionnaires de la racine dorsale de souris adultes par immunopanoramique

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...