This study was supported by the Swiss National Foundation (n&#176; 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)

Les soins des animaux était conforme aux lignes directrices approuvées par les autorités locales suisses (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, Veterinärdienst, Sekretariat tierversuche, Nrs d&#39;approbation. 52/11 et 35/14). Ces lignes directrices sont en accord avec la directive européenne 2010 Communauté / 63 / UE. Remarque: Travailler dans une hotte à flux laminaire avec des instruments et des solutions stériles pour toutes les étapes 1 - 5 y compris les sous-étapes. 1. Préparation des AME Nota: AME sont composés d&#39;un substrat de verre, micro-fabriqué des électrodes métalliques et une couche d&#39;isolation polymère SU-8 (voir aussi Tscherter et al. 3). Aux fins de cette étude, les AEM disponibles dans le commerce ont été commandés avec un réseau d&#39;électrodes mise en page personnalisée (Figure 1 A &amp; B). Les 68 électrodes sont disposées dans une grille rectangulaire qui est divisée en deux zones par une rainure 300 um de largeur libre d&#39;électrodes, électrprospects et isolation iCal. Chaque électrode est de 40 x 40 um en taille et ils sont espacés de 200 um de centre à centre. Quatre grandes électrodes de masse sont disposées autour de l&#39;emplacement d&#39;enregistrement. Ils diffèrent des autres AME standards disponibles dans le commerce à leur taille (21 mm x 21 mm) et ils ont pas de chambre d&#39;enregistrement fixe. <ol><li> Pour désinfection AME de rinçage à l&#39;éthanol 100% (2x), 70% d&#39;éthanol (1x) et d&#39;eau distillée (2x) pendant au moins 30 secondes chacun. Laisser sécher. Mettez 10 - 12 AME dans une boîte de Pétri en verre propre (150 mm x 25 mm) et fermer le couvercle. </li><li> AME autoclave pendant 20 min à 120 ° C. Stocker à température ambiante. </li><li> Préparer la solution de revêtement (voir la liste des matériaux) pour les AME et aliquotes de conserver à -20 ° C. </li><li> Mettez chaque MEA dans une boîte de Pétri stérile individuel (35 mm x 10 mm). </li><li> Utiliser une pipette refroidie à mettre 150 solution de revêtement ul refroidi au-dessus des électrodes et fermer le couvercle de la boîte de Pétri. Après environ 10 minutes, vérifier les bulles d&#39;air au-dessus deles électrodes et retirez délicatement dessus avec une spatule en caoutchouc recouverte si nécessaire. Laisser reposer pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Résidus de solutions de revêtement de Aspirer, lavent 1x avec un milieu optimisé pour prénatale et neurones embryonnaires et 2x avec distillée, de l&#39;eau stérile. Si AME ne sont pas utilisés jusqu&#39;à ce que le lendemain, les conserver dans l&#39;eau distillée stérile à 37 ° C dans l&#39;incubateur O / N. Sinon, laissez directement à sec à température ambiante. </li></ol> 2. Ingrédients nécessaires à la préparation et la croissance des cultures organotypiques <ol><li> Préparer la solution de lavage sans calcium (voir la liste des matériaux). </li><li> Reconstituer le plasma de poulet dans une solution de lavage (1: 1, secouez doucement, éviter la formation de bulles), centrifuger à 3000 g pendant environ 20 min et décanter le contenu clair dans un tube stérile. Aliquote de 200 ul dans des cryotubes et conserver à -20 ° C. </li><li> Reconstituer la thrombine à partir de plasma bovin en conséquence (200 U / ml) et stérilisée par filtration (filtre de 0,2 um des pores). Aliquoter 200 pi dans crytotubes et conserver à -20 ° C. </li><li> Pour 30 cultures préparer 100 ml de milieu nutritif (voir la liste des matériaux). </li></ol> Dissection des tissus 3. Spinal Cord Nota: Les rendements de procédure, en fonction du nombre d&#39;embryons, des tranches de moelle épinière pendant environ 25 - 35 co-cultures et est préparé à l&#39;intérieur d&#39;une hotte à flux laminaire dans des conditions stériles. <ol><li> Appliquer une dose létale de pentobarbital (0,4 ml) à la mère de l&#39;animal par injection intramusculaire. Confirmez anesthésie profonde en vérifiant le réflexe de retrait de la pédale. Livrer embryons de rat E14 par césarienne et le sacrifice par décapitation. </li><li> Transférer les corps des embryons dans une boîte de Pétri remplie de solution stérile réfrigérés, lavage. </li><li> Effectuer une coupe transversale complète avec un scalpel au-dessus des membres postérieurs et une autre au-dessus des pattes avant et retirer les membres de l&#39;organisme. Ensuite, faire une coupe dans le plan frontal pour séparer les viscères du dos contenant le co moellee. </li><li> Par le tranchage, transférer les morceaux contenant de la moelle épinière une à la fois sur un disque de montage et couper à une épaisseur de 225 - 250 um avec un broyeur de tissus. Mettre une goutte de solution de lavage sur le tissu haché et transférer tranches avec une spatule en 35 mm x 10 mm de boîtes de Pétri remplies de solution stérile réfrigérés, lavage. </li><li> Pour chaque tranche séparément, disséquer la moelle épinière loin de tissu restant. Donner des ganglions de la racine dorsale attachée. </li><li> Laissez les tranches reposer pendant 1 heure à 4 ° C. </li></ol> 4. Montage tranches cordon de tissus de la colonne vertébrale sur les AME <ol><li> Warm up milieu nutritif stérile dans l&#39;incubateur (37 ° C, légèrement couvercle pour l&#39;oxygénation dévissé). </li><li> Position MEA avec des pincettes stériles avec pointes recouvertes de caoutchouc à la température ambiante dans la boîte de Pétri sous un microscope stéréo avec le réseau d&#39;électrodes dans le foyer. Centrer une gouttelette 6 pi de plasma de poulet sur le propre, sans poussière, et stérile réseau d&#39;électrodes. En utilisant une petite spatule, soigneusement glisserdeux sections de la moelle épinière avec des côtés ventral face de l&#39;autre dans la gouttelette de plasma. Ne touchez pas les électrodes avec la spatule. </li><li> Ajouter 8 pi de thrombine autour de la gouttelette de plasma de poulet. Avec la pointe de la pipette thrombine, mélanger délicatement et étaler le mélange de poulet plasma / de thrombine autour des deux tranches. Encore une fois, ne pas toucher directement le réseau d&#39;électrodes fragile. Juste avant la coagulation, aspirer l&#39;excès de poulet plasma / thrombine. </li><li> Cap la boîte de Pétri de conserver une humidité élevée tandis que l&#39;ensemble MEA / culture assis pendant environ 1 h dans une chambre humidifiée à l&#39;intérieur de l&#39;incubateur à 37 ° C. </li><li> Soigneusement ajouter 10 pi de milieu nutritif à la chambre de culture, plafonner la boîte de Pétri et remis dans l&#39;incubateur pendant environ 30 min. </li><li> Placez chaque assemblage MEA / culture avec, conseils recouverts de caoutchouc stérile dans un tube de rouleau, ajouter 3 ml de milieu nutritif et bien fermer le couvercle. Placer le tube d&#39;enroulement dans le tambour de rouleau tournant à 1-2 tours par minute dans l&#39;incubateur à 5% de CO un <sub&gt; 2 atmosphère -d&#39;une à 37 ° C. </li><li> Changer la moitié du milieu de culture au bout de 7 jours in vitro (DIV) et après 1 - 2 fois par semaine. </li></ol> 5. lésions mécaniques <ol><li> Prenez l&#39;assemblage MEA / culture avec embouts stériles, caoutchouc recouvert sur le tube d&#39;enroulement et le placer dans une boîte de Pétri sans milieu nutritif sous un microscope stéréo avec le tissu au point. Vérifier visuellement que les deux tranches sont fusionnés. </li><li> Maintenez la MEA / culture assemblée régulière en plaçant une pince à épiler avec des pointes recouvertes de caoutchouc sur la MEA. </li><li> Placer une lame de scalpel dans la rainure de la MEA à proximité des tranches de tissu. Maintenez le scalpel plutôt horizontalement. </li><li> Soulevez la poignée de scalpel jusqu&#39;à mais laissez la lame de scalpel rester dans la gorge de la MEA de telle manière que la lame &quot;rouleaux&quot; de la base au sommet et coupe ainsi le tissu couvrant travers la gorge. </li><li> Graves des connexions de tissus résiduels avec une pointe d&#39;aiguille 25 G si nécessAry. Travailler uniquement dans la région dans la gorge et ne touchez pas les bords d&#39;appel d&#39;offres. </li><li> Mettez la MEA / Assemblée de la culture dans le tube du rouleau. Fournir 3 ml de milieu nutritif frais pour les cultures et les replacer dans le tambour de rouleau dans l&#39;incubateur. </li></ol> 6. électrophysiologique enregistrements de l&#39;activité spontanée <ol><li> Pour étudier la régénération fonctionnelle entre les deux tranches de la moelle épinière après le nombre choisi de DIV, monter l&#39;ensemble MEA / culture dans une chambre d&#39;enregistrement sur un microscope et d&#39;appliquer environ 500 solution extracellulaire pi (voir la liste des matériaux). </li><li> Attendre 10 min avant le premier enregistrement pour permettre au système de se stabiliser. </li><li> Enregistrez base 2x activité spontanée pour environ 10 min de chaque électrode de la MEA à l&#39;activité RT-détection. </li><li> Pour assurer des conditions stables extracellulaires, échanger solution extracellulaire après chaque session d&#39;enregistrement. </li><li> Pour désinhiber le réseau, appliquer la solution extracellulaire containing strychnine (1 uM) et gabazine (10 uM). Attendez au moins 2 minutes avant de commencer l&#39;enregistrement. </li></ol> Analyse des données 7. Remarque: Pour la détection des potentiels d&#39;action au niveau extracellulaire enregistrées pour chaque électrode utilisant un détecteur basé sur les écarts types et un discriminateur ultérieure. Cette procédure est décrite en détail dans Tscherter et al. 3. <ol><li> Afficher l&#39;activité neuronale détecté de chaque électrode dans un complot tramé selon les procédures standard 3 (figure 1F). </li><li> Déterminer et d&#39;afficher l&#39;activité totale du réseau pour chaque tranche en additionnant le nombre d&#39;événements dans les canaux selon sein d&#39;une fenêtre glissante de 10 ms, décalés par pas de 1 ms (Figure 1G et voir Tscherter et al. 3). </li><li> Détecter dans chaque tranche éclats individuels (grappes d&#39;activité qui apparaissent sur plusieurs électrodes). Donc, Fixer un seuil minimal d&#39;activité de pointe dans l&#39;activité totale du réseau correspondant et de définir chaque début et à la fin éclater éclater. Par exemple, un seuil approprié est de 25% de l&#39;amplitude moyenne de la salve et un début d&#39;éclatement peut être définie par le premier événement dans une fenêtre de temps d&#39;au moins 5 ms, un fin éclater en étant le dernier événement dans une fenêtre de temps d&#39;au moins 25 ms (voir Heidemann et al. 10). </li><li> Pour quantifier la régénération fonctionnelle calculer le pourcentage de salves synchronisées entre les deux tranches. Pour ce faire, calculer le temps de latence entre une salve dans une tranche et la rafale suivante dans l&#39;autre tranche. Remarque: une paire de salve est appelée &quot;synchronisé&quot; quand le temps d&#39;attente est inférieure à la longueur moyenne de salves. Surtout dans les co-cultures avec beaucoup d&#39;activité, il existe la possibilité que les deux parties lancent hasard une rafale dans la fenêtre de latence choisi. Ce fait doit être pris en compte lors de la quantification du pourcentage de synchronized rafales. Pour une description détaillée des calculs voir Heidemann et al. 10. </li></ol> 8. Fixation des cultures et immunohistochimie <ol><li> Pour toutes les étapes qui comprennent le lavage ou l&#39;incubation assurez-vous de mettre les cultures sur une table basculante pour assurer la diffusion adéquate de la solution à travers le tissu. </li><li> Directement après la session d&#39;enregistrement est terminé prendre l&#39;ensemble MEA / culture de la configuration, le mettre dans une boîte de Pétri (35 mm x 10 mm) et ajouter environ 2 ml de solution extracellulaire. </li><li> Pour séparer les tranches à partir des couches de cellules environnantes qui se sont formés pendant le temps in vitro, prendre une pointe de pipette de 10 pi et encercler les tranches. Faites attention à ne pas endommager les cultures. Il est possible d&#39;omettre cette étape, mais intégrer plus tard est plus facile quand il est effectué. </li><li> Utiliser une aiguille de seringue non métallique mince (voir liste matériaux) en combinaison avec une seringue de 1 ml remplie de soluti extracellulaireà souffler doucement la culture au large de la MEA. </li><li> Retirer la pointe d&#39;une pipette Pasteur et adapter la poire en caoutchouc sur l&#39;extrémité effilées. Utilisez l&#39;extrémité arrière de transférer la culture dans fixateur (4% de paraformaldehyde avec du tampon phosphate salin (PBS, 0,1 M)). Ne pas utiliser la pointe standard de la pipette Pasteur pour le transfert, car il est trop petit et les cultures serait plié et probablement endommagé. Correction pour les 1 - 2 h à 4 ° C. Rincer la MEA avec de l&#39;eau distillée et enlever les résidus de tissu avec les doigts, mais ne pas rayer avec l&#39;ongle. AME de magasins dans de l&#39;eau distillée à 4 ° C </li><li> Laver les cultures 3x dans du PBS pendant au moins 10 minutes à chaque fois. Conserver dans PBS à 4 ° C ou commencer directement avec la procédure de coloration. </li><li> Incuber les cultures pendant au moins 90 min dans une solution de blocage (sérum de chèvre à 5%, 1% d&#39;albumine de sérum bovin, 0,3% de détergent dans du PBS). </li><li> Ajouter le premier anticorps dilué dans une solution de blocage et incuber pendant 3 nuits à 4 ° C. </li><li> Laver 3x dans PBS pendant au lest à 30 minutes chacun. </li><li> Ajouter le deuxième anticorps dilué dans du PBS pendant 2 heures à température ambiante. </li><li> Laver 3x dans du PBS pendant au moins 30 min chacun. </li><li> Transférer les tranches avec une pipette Pasteur avec embout retiré sur un porte-objet. Enlever l&#39;excès de PBS et l&#39;enrober avec un milieu de montage. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Plusieurs éléments de la procédure présentée sont fondamentales pour la réalisation d&#39;expériences précises et reproductibles. Toutes les étapes au cours de la préparation des solutions AEM, et la production des cultures de tranches sont effectuées dans des conditions stériles sous une hotte à flux laminaire. Les antibiotiques ne sont pas appliqués au milieu nutritif, car ils peuvent affecter l&#39;activité spontanée 14. Pendant le revêtement de MEA, la partie la plus importante est de faire en sorte que la solution de gel de la matrice extracellulaire reste froid en tout temps. Décongeler au réfrigérateur et de garder sur la glace pendant toute la procédure pour assurer une température maximale proche de 0 ° C. Lors de la préparation de l&#39;isolement rapide et tranches sectionnement, ainsi que de prêter attention à une basse température en utilisant la glace froid tampons de dissection augmente le pourcentage des cultures saines. De plus, le plasma / coagulation de la thrombine est l&#39;une des étapes les plus critiques. Tout d&#39;abord, assurez-vous que le plasma est correctement Mixed avec la thrombine. Deuxièmement, accorder une attention particulière à l&#39;élimination autant de résidus que possible pour assurer une bonne fixation des tranches aux AME. Cette étape est extrêmement sensible au temps; si le délai est trop court, trop de mélange plasma / de la thrombine est retiré. Si le délai est trop long, la coagulation est déjà arrivé, augmentant le risque de retirer les tranches avec le résiduel plasma / thrombine. Si les lésions mécaniques sont prévues, il est important d&#39;utiliser AME avec une conception précise. La zone où la lésion est destiné doit être libre d&#39;électrodes, fils et l&#39;isolation. Sinon, le système électrique de la MEA vont être endommagé et, par conséquent, aucun enregistrement ne peut être effectué plus. Une autre étape cruciale concerne la taille de la lésion. Il a été montré précédemment que la reconnexion deux jeunes tranches après lésion dure environ deux jours 10. Pour toutes les expériences, la règle de base a été utilisé que le chic de l&#39;espaceen tranches après lésion ne doit pas être plus grand que la largeur de la rainure de la MEA (300 um). Une plus grande taille de la lésion peut entraîner un délai plus long pour la reconnexion ou, si la lésion est trop grand, aucune reconnexion du tout. Pour annoter, expériences antérieures ont révélé qu&#39;une mise initiale de deux tranches plus loin que 1 mm donne un taux de connexion très faible. Avant le début des enregistrements, un trajet de réglage d&#39;au moins 10 min à la température ambiante, au lieu de 37 ° C de l&#39;incubateur, et à la solution extracellulaire, à la place du milieu de nutrition est recommandée. Une observation attentive de la configuration de l&#39;activité au cours de ces premières minutes assure que les données de mesure représentent le motif d&#39;éclatement de la culture de manière appropriée après que l&#39;enregistrement a commencé. Pour la détection de l&#39;activité, l&#39;acquisition des données et le traitement ultérieur, le matériel fait maison (chambre d&#39;enregistrement, les connexions aux amplificateurs et amplificateurs), les programmes en laboratoireVUE, C ++ et IgorPro sont utilisés. Configurations de MEA commerciales et d&#39;autres logiciels sont adaptés aussi bien pour ces opérations. Ici, les signaux vus par les électrodes sont amplifiés 1001 fois, et ensuite numérisées à un débit de 6 kHz. Le modèle présenté peut être un outil utile pour examiner les connexions propriospinaux parce in vivo, ils sont difficiles à étudier sans interférence de monter et descendre des faisceaux de fibres. La co-culture de deux tranches de la moelle épinière peut élégamment contourner ce problème. Les cultures fournissent un microenvironnement qui peuvent être étroitement contrôlée et facilement manipulé. D&#39;autre part, l&#39;entrée supraspinal et sensorielle est bien sûr absent. En outre, le procédé de la préparation de culture représente une situation de détérioration du système nerveux central. Les cellules gliales telles que les astrocytes et la microglie sont connus pour répondre à des lésions avec une prolifération accrue et, par conséquent, le tissu est dans une certaine mesure réorganisée. Relatif au mode présentél la formation d&#39;une cicatrice gliale après avoir effectué des lésions mécaniques n&#39;a pas été observée. Une explication pourrait être que les mécanismes d&#39;adaptation des astrocytes ont déjà été déclenchés pendant le processus de préparation et que les lésions des cultures n&#39;a pas abouti à une autre réponse. En outre, il n&#39;y a aucune preuve de la participation des inhibiteurs associés de la myéline, par exemple., Nogo-A, dans le potentiel de régénération des cultures à faible lésés à un âge avancé. Cependant, il a été montré que le traitement avec l&#39;inhibiteur de la phosphodiestérase 4 rolipram, en commençant directement après l&#39;exécution de lésions à 23 DIV augmente la régénération fonctionnelle entre les 10 tranches. Ces résultats démontrent que la récupération fonctionnelle peut être augmentée dans les vieilles cultures. Sensiblement, lors du comptage du nombre d&#39;axones qui traversent le site de la lésion, pas de différence entre les cultures lésés à un jeune âge et les cultures lésés à un âge avancé a été découvert. Ces résultats suggèrent que le manque de régénération axonale est pas la raison majeure fou la perte de la récupération après lésions tardives dans la culture et donc souligner la nécessité d&#39;un modèle qui permet l&#39;analyse fonctionnelle de la régénération. Formation synaptique et la plasticité synaptique pourraient jouer un rôle majeur dans le processus de récupération 10. Ces mécanismes ont gagné beaucoup d&#39;attention au cours des dernières années et il est aujourd&#39;hui largement admis que ils ont un impact majeur sur le résultat après une blessure de la moelle épinière. Par conséquent, un modèle qui offre des conditions stables pour enquêter sur ces processus dans l&#39;isolement et dans les moindres détails peut certainement aider à obtenir un aperçu sur la régénération fonctionnelle dans la moelle épinière.

Cultures organotypique du système nerveux central (SNC) ont été largement utilisés pour étudier divers phénomènes physiologiques et pathologiques allant de développement neuronal à la neurodégénérescence. Par rapport à des cultures de cellules dissociées, des tranches organotypiques offrent l&#39;avantage d&#39;une plus grande complexité avec un cytoarchitecture intact et un circuit synaptique local. Dans le même temps, le tissu peut être analysée de façon isolée, sans la nécessité de mettre en cause la complexité de l&#39;ensemble du contexte dans vivo. De plus, un accès facile et répété pour les cellules de choix est justifié, à l&#39;environnement extra-cellulaire peut être contrôlée avec précision et, en général, des modèles in vitro sont moins coûteux que leurs homologues in vivo. Au cours des dernières années, diverses études présentées similitudes frappantes entre les profils de développement des cultures à long terme par rapport aux animaux vivants correspondante 1,2. Il a été montré que les circuits de neurones du SNC de divers regions expriment l&#39;activité de réseau spontané au cours du développement et que les tranches organotypiques maintenir partiellement ce phénomène 3 -7. Préparations isolées de la moelle épinière ont été particulièrement utilisées pour étudier la production de rythme 6 et la formation des circuits neuronaux 1. Un moyen d&#39;enregistrer l&#39;activité spontanée de tranches organotypiques est à la culture sur le dessus de tableaux multi-électrodes (AME). Ces appareils contiennent de multiples électrodes qui peuvent surveiller les potentiels extracellulaires générés par les potentiels d&#39;action à partir de nombreuses cellules simultanément (enregistrement multi-unité). La haute résolution temporelle des enregistrements MEA peut être utilisée pour reconstruire la dynamique d&#39;activité précis dans un circuit neuronal donné. En outre, contrairement à la pièce de serrage technique est non invasive, qui permet des mesures et les résultats à long terme dans le fait que les neurones ne sont pas affectés dans leur comportement. Fou les besoins de cette étude, la combinaison de la moelle épinière co-cultures organotypiques et enregistrements multisite a été utilisé pour étudier la régénération fonctionnelle au sein de la moelle épinière. Depuis adultes vertébrés supérieurs ont le potentiel pour récupérer des dommages de la moelle épinière limité, différentes stratégies ont été étudiées pour favoriser la régénération après une lésion de la moelle épinière. Jusqu&#39;à présent, le faisceau cortico-spinal a généralement été le système de modèle de choix pour ces enquêtes. Ces expériences sont généralement beaucoup de temps, coûteux et nécessitent de grandes cohortes d&#39;animaux en raison de la forte variabilité au sein des groupes simples. En outre, il semble que les connexions propriospinaux (neurones qui sont entièrement confinés à l&#39;intérieur de la moelle épinière) peuvent jouer un rôle central dans le processus de récupération suite à des lésions de la moelle épinière 8. Ces fibres sont difficiles à étudier in vivo sans l&#39;interférence de monter et descendre des faisceaux de fibres. Bonnici et Kapfhammer 9 utilisés moelle épinière longitudinalecultures tranche de souris postnatales comme une approche alternative. Après avoir effectué les lésions mécaniques, ils ont analysé semi-quantitative de la régénération des axones morphologique entre les segments de la moelle épinière. Ils ont observé moins, mais pas Aucun axones traversant le site de la lésion dans les cultures coupées à un âge mûr. En revanche, les cultures qui ont été lésés à un stade jeune affichent une grande quantité de régénération axonale 5 - 7 jours après le dommage. Toutefois, la preuve pour les connexions fonctionnelles n&#39;a pas été présenté. Par conséquent, le développement d&#39;un représentant dans le modèle in vitro de fibres propriospinaux qui permet à l&#39;enquête de la régénération fonctionnelle peut être un outil précieux pour étendre nos connaissances sur les processus de régénération de la moelle épinière.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Planar multielectrode array</td>
			<td>Qwane Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>custom-made according to the design of our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>80 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-070</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled, sterile water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve growth factor-7S [5ng/mL]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0513</td>
			<td>200 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>reconstituted in wash solution with 1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix gel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356230</td>
			<td>Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium optimized for prenatal and embryonic neurons</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[mg/L]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2-6H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 anhydrous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular solution (pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[mM]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>145</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent: Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3%, harmful if swallowed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210-064</td>
			<td align="right">5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2366</td>
			<td>Lyophilized, reconstitute with wash solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gabazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SR-95531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mecamylamine hydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2843</td>
			<td>toxic if swallowed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>MF28G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>harmful, 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI-31</td>
			<td>Covance</td>
			<td>SMI-31P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI-32</td>
			<td>Covance</td>
			<td>SMI-32R-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strychnine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0532</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1123740001</td>
			<td>irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flat tube 10 (= roller tube)</td>
			<td>Techno Plastic Products AG</td>
			<td>91243</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating functional regeneration in organotypic spinal cord co-cultures grown on multi-electrode arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

Pour étudier le potentiel de récupération fonctionnelle des co-cultures dérivées de la moelle épinière d&#39;embryons E14 de rat, des lésions ont été effectuées dans une fenêtre de temps de 8 à 28 DIV. 2 à 3 semaines plus tard, l&#39;activité neuronale spontanée a été enregistrée avec les AME (Figure 1 C &amp; D). Les potentiels d&#39;action extracellulaire enregistrés ont été identifiés hors ligne pour chaque électrode individuelle (figure 1E). De ces données raster parcelles ont été générés (Figure 1F), suivie par l&#39;activité réseau parcelles de visualiser l&#39;activité totale séparément par côté (figure 1G). Dans chaque tranche l&#39;activité spontanée est généralement organisé en rafales. Si les tranches sont reliés fonctionnellement, ces salves peuvent se propager d&#39;une tranche à l&#39;autre. Par conséquent, le montant de salves synchronisées entre les deux tranches a été calculé pour mesurer quantitativement la régénération fonctionnelle. Pour une description détaillée de la façon dont l&#39;int de transformationo les différentes parcelles est effectuée et comment la formule de calcul du pourcentage de l&#39;activité synchronisée a été dérivé, s&#39;il vous plaît voir Heidemann et al. 10. Dans toutes les expériences, l&#39;activité a été enregistrée dans des conditions standard. Dans une deuxième étape, l&#39;inhibition synaptique a été bloquée par addition de strychnine (1 uM) et gabazine (10 uM) à la solution de bain extracellulaire. Cela conduit généralement à une désinhibition un modèle d&#39;activité plus régulier avec rafales prolongées et des intervalles de salve, ce qui facilite la définition de salves et par conséquent la détermination de la synchronisation de salve entre les tranches. Cultures lésés à un jeune âge (7 - 9 DIV) affichent une grande quantité de l&#39;activité synchronisée 2-3 semaines après la lésion alors que les cultures lésé à des stades ultérieurs (&gt; 19 DIV) a montré une nette réduction de la capacité de régénérer (Figure 2 A - F). Ces résultats indiquent que la capacité de régénérationdes connexions fonctionnelles dans les cultures cordon de tranche épinière diminue d&#39;un niveau élevé, représentant l&#39;état embryonnaire in vivo, à un niveau faible, représentant l&#39;état encore développés in vivo, dans les trois semaines dans la culture. Quels types de connexions sont effectivement impliqués dans salve de synchronisation entre les deux tranches? Outre les connexions propriospinaux, les fibres pourraient également découler de motoneurones ou neurones du ganglion de la racine dorsale. Il a été montré précédemment que les neurones ganglionnaires de la racine dorsale de ne sont pas pertinents pour la connectivité fonctionnelle entre la moelle épinière 10 tranches. Cependant, l&#39;implication des motoneurones restait une possibilité. Depuis motoneurones sont connus pour former des connexions des neurones cholinergiques de la moelle épinière par l&#39;intermédiaire des récepteurs nicotiniques 13, l&#39;activité de la moelle épinière co-cultures a été enregistré à huit DIV, alors que les cultures montrent une activité très 10 synchronisés, et l&#39;antagoniste nicotinique Mecamylamine (MEC, 100 pM) a été ajouté à la solution de bain extracellulaire. Une participation des motoneurones dans la liaison entre les deux tranches se traduirait par une diminution du pourcentage de l&#39;activité synchronisée. Cependant, ce ne fut pas le cas (MEC: 91,0 ± 4,5%, n = 7; contrôle: 93,6 ± 4,6%, n = 7, p&gt; 0,05, Wilcoxon correspondait test de paires). Ces résultats suggèrent que les synapses cholinergiques ne contribuent pas à la liaison fonctionnelle entre les tranches. Toutefois, étant donné ont également été montré motoneurones pour libérer du glutamate au niveau des synapses dans le SNC 11, 15, ces expériences ne comprennent pas entièrement leur engagement. Pour identifier les motoneurones colorations immunohistochimiques contre le neurofilament non phosphorylée H avec SMI-32 ont été réalisées. Ils ont révélé plusieurs corps cellulaires marqués grandes typiques pour les motoneurones, répartis sur la tranches (figure 3A). L&#39;anticorps SMI-32 a été rapportée pour marquer les corps cellulaires des motoneurons 12 et cette constatation vaut également pour les cultures utilisées 13. En outre, des colorations de corps cellulaires neuronaux en général, par exemple, contre les b-III-tubuline ou NeuN ainsi que les corps cellulaires gliales, par exemple., Les astrocytes avec l&#39;anticorps GFAP sont en ligne avec d&#39;autres rapports et correspondent aux descriptions morphologiques de ces types de cellules ( Figure 3 B - D). Néanmoins, l&#39;étiquetage des axones avec l&#39;anticorps SMI-32 est préoccupante (figure 3E). Contre toute attente, un vaste réseau de fibres apparaît lors de l&#39;utilisation de cet anticorps et il ressemble à la coloration SMI-31 que les étiquettes phosphorylée neurofilament H (figure 3F). Une interprétation de ce résultat pourrait être que la régulation du développement des neurofilaments phosphorylation / déphosphorylation est pas aussi serré dans les cultures utilisées par rapport à la situation in vivo. Un événement mixte de neurofilaments phosphorylés et non phosphorylés dans le même axone pourrait explain cette constatation. Une autre possibilité est que les SMI-32 axones marqués proviennent de neurones de projection. Tsang et ses collègues 16 ont montré que, par exemple, des colonnes et des colonnes de cellules intermédiolatérale les neurones de Clark sont colorées par SMI-32 en plus motoneurones. Prononcés prolifération des neurites de ces neurones pourrait également expliquer l&#39;abondance de SMI-32 fibres positives. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig1.jpg" /> Figure 1. affichage et d&#39;analyse de l&#39;activité spontanée. (A) Schéma d&#39;un MEA. Les électrodes de platine recouvert sont représentés en noir, les fils rouge et transparentes dans la rainure dans le milieu de la MEA en jaune. (B) gros plan, le réseau d&#39;électrodes situé au centre de la MEA. Les diagrammes sont aimablement fournies par le Dr M. Heuschkel. Image lumineuse sur le terrain d&#39;une ancienne 8 DIV cultur (C)e. Les tranches ont augmenté et fondue le long des côtés se faisant face. La barre jaune représente la gorge electrode- et sans isolation de la MEA. Barre d&#39;échelle = 400 um (D) Chronologie des expériences. Deux tranches de moelle épinière de rat E14 embryons sont placés à côté de l&#39;autre sur AME. Au bout de quelques jours, les tranches et fusible se développent le long des côtés se faisant face. Dans un délai de 8 à 28 DIV, lésions complets seront effectués par l&#39;intermédiaire du site de fusion. Deux à trois semaines plus tard, l&#39;activité spontanée est enregistrée et les cultures sont fixées pour les colorations immunohistochimiques. (E) des traces d&#39;activité spontanée de chaque électrode individuelle d&#39;une culture vieille de 23 DIV. Pour une meilleure visualisation, que chaque seconde trace est illustré. Traces oranges représentent l&#39;activité qui a été enregistrée à partir de la tranche sur le côté droit, des traces bleues sur le côté gauche. La plupart des salves sont synchronisés entre les deux. Les pointes de flèches à une explosion se produisant dans la tranche de gauche qui ne partiellement propagé vers la droite tranche. L&#39;activité dans la bonne tranche cependant n&#39;a pas atteint le seuil choisi d&#39;au moins 25% de l&#39;activité maximale de crête moyenne du côté en fonction et par conséquent, n&#39;a pas été détecté comme une rafale. Grossissements sur la droite représentent la dernière paire de rafale synchronisée. (F) Raster parcelle de l&#39;activité illustrée par (E). (G) parcelle de l&#39;activité de réseau avec des éclats définies ci-dessous (barres de base) de l&#39;activité illustrée en (E). Adapté de Heidemann et al., 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig2.jpg" /> Figure 2. synchronisé par rapport à l&#39;activité non synchronisé. (A, B) des parcelles de trame de cultures lesioneD à un jeune âge (à 7-9 DIV), montrant l&#39;activité synchronisée dans des conditions standard (A) et en vertu de la désinhibition (B). (C, D) des parcelles de trame de cultures lésés à un âge avancé (à&gt; 19 DIV), montrant une activité non synchronisé dans des conditions standard (C) et sous la désinhibition (D). (E, F) Pourcentage moyen de l&#39;activité synchronisée tracée pour chaque jour de la lésion individuelle enregistrée dans des conditions standard (E) et en vertu de la désinhibition (F). Les enregistrements ont été prises 2 - 3 semaines après le jour de la lésion. Adapté de Heidemann et al., 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig3.jpg" /> Figure 3. immunohistochimique caractérisation. (A) Coloration des corps cellulaires motoneurones avec SMI-32. (B) β-III étiquetage de la tubuline de corps cellulaires des neurones matures et leurs processus. (C) d&#39;identification des astrocytes avec GFAP. (D) l&#39;étiquetage des corps de cellules neuronales mature avec NeuN. (E) SMI-32 coloration de non-phosphorylée neurofilament H. (F) neurofilament phosphorylée H identifié par SMI-31. Adapté de Heidemann et al., 10. Notez que les deux, SMI-31 et SMI-32, un vaste réseau de fibres est visible dans les cultures. Bars AD = 20 um, H &amp; F = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Ici, nous présentons un protocole qui est basée sur des tranches de moelle épinière en culture sur des réseaux multi-électrode à étudier la régénération fonctionnelle de connexions propriospinaux in vitro.

Enquêter Régénération fonctionnelle en organotypiques médullaires Co-cultures Cultivé sur des tableaux multi-électrodes

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.0K vues.  University of Bern.  Ici, nous présentons un protocole qui est basée sur des tranches de moelle épinière en culture sur des réseaux multi-électrode à étudier la régénération fonctionnelle de connexions propriospinaux in vitro. 

Vidéo: Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Recherche

Neurosciences

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Enregistrements tableau multi-électrodes des Avalanches neuronale dans des cultures organotypiques

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Spinal Cord Transection dans le poisson zèbre larvaire

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Spiral Ganglion Neuron Explant Culture and Electrophysiology on Multi Electrode Arrays

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons. 
We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.

We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.

Spiral Ganglion Neuron Explantation Culture et électrophysiologie sur multi-électrodes Arrays

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) on a treadmill is widely used as a rehabilitation tool in the SCI population with many benefits and improvements to daily life. We utilize this method of activity-based task-specific training (ABT) in rodents after SCI to both elucidate the mechanisms behind such improvements and to enhance and improve upon existing clinical rehabilitation protocols. Our current goal is to determine the mechanisms underlying ABT-induced improvements in urinary, bowel, and sexual function in SCI rats after a moderate to severe level of contusion. After securing each individual animal in a custom-made adjustable vest, they are secured to a versatile body weight support mechanism, lowered to a modified three-lane treadmill and assisted in step-training for 58 minutes, once a day for 10 weeks. This setup allows for the training of both quadrupedal and forelimb-only animals, alongside two different non-trained groups. Quadrupedal-trained animals with body weight support are aided by a technician present to assist in stepping with proper hind limb placement as necessary, while forelimb-only trained animals are raised at the caudal end to ensure no hind limb contact with the treadmill and no weight-bearing. One non-trained SCI group of animals is placed in a harness and rests next to the treadmill, while the other control SCI group remains in its home cage in the training room nearby. This paradigm allows for the training of multiple SCI animals at once, thus making it more time-efficient in addition to ensuring that our pre-clinical animal model mimics the clinical representation as close as possible, particularly with respect to the body weight support with manual assistance.

This protocol demonstrates our model of activity-based locomotor treadmill training for rats with spinal cord injury (SCI). Included is both quadrupedal and forelimb-only groups, in addition to two distinct types of non-trained control groups. Investigators are able to assess training effects on SCI rats using this protocol.

La formation axée sur l’activité sur un tapis roulant avec la moelle épinière blessée des Rats Wistar

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...

Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and a lot of comparative data has been published in the literature. This includes a multitude of assessment methods to study functional recovery following nerve injury and repair. Besides evaluation of nerve regeneration by means of histology, electrophysiology, and other in vivo and in vitro assessment techniques, functional recovery is the most important criterion to determine the degree of neural regeneration. Automated gait analysis allows recording of a vast quantity of gait-related parameters such as Paw Print Area and Paw Swing Speed as well as measures of inter-limb coordination. Additionally, the method provides digital data of the rats&#8217; paws after neuronal damage and during nerve regeneration, adding to our understanding of how peripheral and central nervous injuries affect their locomotor behavior. Besides the predominantly used sciatic nerve injury model, other models of peripheral nerve injury such as the femoral nerve can be studied by means of this method. In addition to injuries of the peripheral nervous systems, lesions of the central nervous system, e.g., spinal cord contusion can be evaluated. Valid and reproducible data assessment is strongly dependent on meticulous adjustment of the hard- and software settings prior to data acquisition. Additionally, proper training of the experimental animals is of crucial importance. This work aims to illustrate the use of computerized automated gait analysis to assess functional recovery in different animal models of peripheral nerve injury as well as spinal cord contusion injury. It also emphasizes the method&#8217;s limitations, e.g., evaluation of nerve regeneration in rats with sciatic nerve neurotmesis due to limited functional recovery. Therefore, this protocol is thought to help researchers interested in peripheral and central nervous injuries to assess functional recovery in rodent models.

Automated gait analysis is a feasible tool to evaluate functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury and spinal cord contusion injury. While it requires only one setup to assess locomotor function in various experimental models, meticulous hard- and soft-ware adjustment and training of the animals is highly important.

Analyse automatisée de la démarche pour évaluer la récupération fonctionnelle chez les rongeurs ayant des lésions périphériques du nerf ou de la contusion de la moelle épinière

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and ...

Electromagnetic Controlled Closed-Head Model of Mild Traumatic Brain Injury in Mice

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and understanding the mechanisms of how a TBI alters brain function. The availability of multiple animal models of TBI is necessary to model the different aspects and severities of TBI seen in people. This manuscript describes the use of a midline closed head injury (CHI) to develop a mouse model of mild TBI. The model is considered mild because it does not produce structural brain lesions based on neuroimaging or gross neuronal loss. However, a single impact creates enough pathology that cognitive impairment is measurable at least 1 month after injury. A step-by-step protocol to induce a CHI in mice using a stereotaxically guided electromagnetic impactor is defined in the paper. The benefits of the mild midline CHI model include the reproducibility of the injury-induced changes with low mortality. The model has been temporally characterized up to 1 year after the injury for neuroimaging, neurochemical, neuropathological, and behavioral changes. The model is complementary to open skull models of controlled cortical impact using the same impactor device. Thus, labs can model both mild diffuse TBI and focal moderate-to-severe TBI with the same impactor.

The protocol describes mild traumatic brain injury in a mouse model. In particular, a step-by-step protocol to induce a mild midline closed head injury and the characterization of the animal model is fully explained.

Modèle à tête fermée contrôlé électromagnétique de lésion cérébrale traumatique légère chez la souris

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and ...

Greffe à long terme de cellules h-SC-NES dans des cultures organotypiques de moelle épinière

Long-Term Mouse Spinal Cord Organotypic Slice Culture as a Platform for Validating Cell Transplantation in Spinal Cord Injury

Resolutive cures for spinal cord injuries (SCIs) are still lacking, due to the complex pathophysiology. One of the most promising regenerative approaches is based on stem cell transplantation to replace lost tissue and promote functional recovery. This approach should be further explored better in vitro and ex vivo for safety and efficacy before proceeding with more expensive and time-consuming animal testing. In this work, we show the establishment of a long-term platform based on mouse spinal cord (SC) organotypic slices transplanted with human neural stem cells to test cellular replacement therapies for SCIs.
Standard SC organotypic cultures are maintained for around 2 or 3 weeks in vitro. Here, we describe an optimized protocol for long-term maintenance (&#8805;30 days) for up to 90 days. The medium used for long-term culturing of SC slices was also optimized for transplanting neural stem cells into the organotypic model. Human SC-derived neuroepithelial stem (h-SC-NES) cells carrying a green fluorescent protein (GFP) reporter were transplanted into mouse SC slices. Thirty days after the transplant, cells still show GFP expression and a low apoptotic rate, suggesting that the optimized environment sustained their survival and integration inside the tissue. This protocol represents a robust reference for efficiently testing cell replacement therapies in the SC tissue. This platform will allow researchers to perform an ex vivo pre-screening of different cell transplantation therapies, helping them to choose the most appropriate strategy before proceeding with in vivo experiments.

Pleins feux sur l’auteur : Culture à long terme de coupes de moelle épinière pour faire progresser les thérapies de régénération de la moelle épinière

In this paper, we provide a reproducible method to generate and maintain long-term spinal cord organotypic slices transplanted with neural stem cells as an ex vivo model for testing cellular replacement therapies.

Culture à long terme de coupes organotypiques de moelle épinière de souris comme plate-forme de validation de la transplantation cellulaire dans les lésions de la moelle épinière

Resolutive cures for spinal cord injuries (SCIs) are still lacking, due to the complex pathophysiology. One of the most promising regenerative approaches ...