Ce travail a été soutenu par des subventions du National Institutes of Health (AI050677, HD-051 998, et GM103433), un Malcolm Feist bourse de recherche cardio-vasculaire, et une bourse de l&#39;American Heart Association prédoctoral (10PRE4200007).

1. Préparation de gélatine à revêtement Lamelles <ol><li> Placer les lamelles de verre lavées à l&#39;acide (15 mm de diamètre) dans un plastique stérile boîte de 100 mm (es). Placer 8-9 lamelles par boîte et assurez-vous qu&#39;ils ne se touchent pas les uns les autres ou sur les côtés du plat .. </li></ol> Remarque: lamelles, les aiguilles et les pinces doivent être stérile pour éliminer les microorganismes contaminants possibles, ainsi que les endotoxines qui affectent les fonctions cellulaires, y compris la motilité. <ol start="2"><li> Peser la poudre de gélatine et de remettre en suspension la poudre dans de l&#39;eau désionisée pour former une solution de gélatine à une concentration finale de 0,5 g/300 ml. Ensuite, la solution de gélatine doit être autoclavé. </li><li> Pipette 2-3 gouttes de gélatine (~ 100-150 ml) sur chaque lamelle. </li></ol> Remarque: Veillez à ne pas laisser la gélatine de toucher le plat ou vous ne serez pas en mesure de retirer les lamelles de la boîte. <ol start="4"&gt; <li> Cuire les lamelles recouvertes de gélatine dans la boîte de 100 mm dans une étuve à 90 ° C pendant 10 min. </li><li> Enlever tout excès de gélatine par pipetage doux. </li><li> Sécher les lamelles dans le plat 100 mm dans le four à 70 ° C pendant 45 min. </li><li> Une fois sec, retirer les lamelles de la boîte de 100 mm en utilisant une solution stérile, sans endotoxine aiguille et pince à épiler (l&#39;aiguille est utilisée pour pousser gentiment jusqu&#39;à la lamelle à la rendre accessible à la pince à épiler pour enlever délicatement). </li><li> Placez individuelles revêtues de gélatine lamelles dans des puits séparés d&#39;un plat de 24 puits. </li></ol> 2. Préparation de l&#39;or colloïdal recouvertes de lamelles couvre- <ol><li> Peser une quantité appropriée d&#39;acide chloraurique (trihydrate d&#39;acide tétrachloroaurique; HAuCl 4 · 3H 2 O), puis remettre en suspension dans de l&#39;eau déminéralisée stérile pour préparer une solution finale 14,5 mM (toxique). Préparer 1,5 ml de la solution par 8-9 lamelles. </li></ol> Attention: l&#39;acide chloroaurique est hbrassée en cas d&#39;ingestion cause des brûlures graves de la peau et des lésions oculaires et peut causer une réaction allergique cutanée. Toxique en cas d&#39;ingestion. <ol start="2"><li> Peser une quantité appropriée de citrate de sodium (dihydrogénophosphate trisodique 2-hydroxy-1 ,2,3-tricarboxylate; Na 3 C 6 H 5 O 7), puis remise en suspension de la poudre dans de l&#39;eau désionisée pour obtenir une solution finale à 0,5%. Préparer 1 ml de la solution par 8-9 lamelles. </li></ol> Attention: le citrate de sodium peut irriter les yeux et la peau. Elle peut également causer une irritation des voies respiratoires et digestives. <ol start="3"><li> Dans une solution stérile, sans endotoxines bécher combiner 1,5 ml de la solution stérile 14,5 mm HAuCl4 solution et 13,5 ml d&#39;eau déminéralisée stérile, le résultat devrait donner une solution jaune pâle. Les volumes mentionnés ci-dessus permettra pour 8-9 lamelles d&#39;or colloïdal à faire. </li><li> Tout en continuant à agiter, chauffer la solution sur une plaque chaude jusqu&#39;à ce qu&#39;il commence à bhuile. </li></ol> Avertissement: Le chauffage de la solution doit être effectuée sous la hotte, sous forme de vapeurs peut être nocif / toxique. Les vapeurs sont plus destructeur pour le tissu des muqueuses et des voies respiratoires supérieures. <ol start="5"><li> Retirer le bécher de la plaque chauffante. </li><li> Tout en agitant, ajouter 0,7 ml de la solution de citrate de sodium à 0,5%. Le volume mentionné ci-dessus permettra pour 8-9 lamelles d&#39;or colloïdal à faire. </li><li> Continuez à remuer cette solution combinée pendant environ 2 minutes (Note: La couleur de la solution change graduellement du jaune pâle, d&#39;effacer, de gris, de violet, de pourpre foncé, avant d&#39;atteindre finalement un vin rouge ou, de préférence, couleur rouille) . Ce produit est la solution d&#39;or colloïdal. </li><li> Refroidir la solution d&#39;or colloïdal dans une pipette de 10 ml de 1-2 min (pour garder la couche de gélatine sur la lamelle de fusion lorsque la solution d&#39;or colloïdal est ajouté) et ensuite ajouter 1,0 à 2,0 ml de la colloidasolution d&#39;or sur chaque lamelle l revêtues de gélatine préalablement placée dans un plat de 24 puits (s) (la quantité de la solution d&#39;or colloïdal que vous ajoutez des lamelles recouvertes de gélatine dépend de la façon dont les particules d&#39;or précipité dans la solution - voir commentaires ci-dessous). </li></ol> Remarque: il peut y avoir des variations dans l&#39;efficacité de la précipitation de particules d&#39;or, il est conseillé de d&#39;abord ajouter 0,5-1 ml de la solution d&#39;or colloïdal pour les lamelles recouvertes de gélatine, puis placez le plat de 24 puits dans l&#39;incubateur pendant 0,5 heure . Après ce temps d&#39;incubation, les lamelles doivent être vérifiés au microscope optique de la densité appropriée des particules d&#39;or sur les lamelles. Voir la figure 1 pour des images de microscopie de 20x exemples de trop faible et trop forte concentration de particules d&#39;or. Voir la figure 2 pour des images de microscopie 40x d&#39;une concentration idéale de particules d&#39;or (au moins pour une utilisation avec des monocytes). L&#39;optimal densité des nanoparticules d&#39;or sur la lame doit être déterminée expérimentalement pour chaque type cellulaire utilisé, les caractéristiques des différentes cellules vont dicter leur force de mouvement sur les lamelles. Si la concentration de particules d&#39;or est insuffisant, ajouter un supplément de 0,5-1 ml de la solution d&#39;or colloïdal pour les lamelles recouvertes de gélatine. En fonction de la taille des cellules, la concentration appropriée de particules d&#39;or et peut varier, ce qui va finalement dépendre de la taille de la cellule examinée pour la motilité. Par exemple, avec des monocytes humains étant de petite taille des cellules (~ 10-20 um 28), une plus forte concentration de particules d&#39;or a été nécessaire dans nos analyses. La répartition appropriée des nanoparticules d&#39;or fournit au chercheur la possibilité de facilement et efficacement distinguer les bords de pistes cellulaires. Une concentration de particules d&#39;or qui est trop élevé nuit à la capacité des cellules à se déplacer et donc de mesurer avec précisionleur motilité, tandis que la concentration de particules d&#39;or qui est trop faible limite les capacités de délimiter une plage précise de la motilité. Note importante: Si la synthèse de nanoparticules d&#39;or est problématique, des nanoparticules d&#39;or synthétisées sont commercialement disponibles dans les tailles de 5 nm à 400 nm. En outre, des microsphères fluorescentes ont également été utilisés dans des études de 29 motilité cellulaire. Toutefois, l&#39;utilisation de ces microsphères nécessite un microscope à fluorescence pour l&#39;analyse de la migration des cellules. <ol start="9"><li> Placer le plat à 24 puits avec colloïdales d&#39;or recouvertes de lamelles dans un incubateur à 37 ° C et incuber 1 h à partir du jour au lendemain. </li><li> Après l&#39;incubation, rincer / extraire l&#39;or non lié par trempage des lamelles (3x) en phosphate stérile (PBS, pH 7,4). </li><li> Placez ces colloïdales revêtues d&#39;or lamelles dans un endroit propre et plat de 12 (es) contenant du PBS. </li><li> Conservez ces lamelles à 4 ° C jusqu&#39;au moment deutiliser (parafilm la plaque avant de les placer dans un réfrigérateur). </li></ol> Remarque importante: Toujours garder les colloïdales revêtues d&#39;or lamelles dans un certain type de liquide / médias comme les particules d&#39;or peuvent s&#39;écailler des lamelles si on les laisse sécher. Les lamelles d&#39;or colloïdal doit être utilisé dans les 2-3 mois à compter de la date à laquelle elles ont été faites. Contrôle de la qualité: Dans un dosage unique piste phagokinetic motilité, il est essentiel d&#39;utiliser des lamelles qui se caractérisent par une concentration analogue de particules d&#39;or. Ce point simple permettra aux différences quantitatives dans la motilité cellulaire entre les échantillons d&#39;être uniquement due à la nature du traitement et de ne pas les propriétés physiques des colloïdales revêtues d&#39;or lamelles. Nous sommes favorables à l&#39;utilisation des lamelles seulement faites en même temps dans des expériences individuelles, mais nous avons montré que, tant que la densité des nanoparticules d&#39;or sont égaux, l&#39;utilisation de lamellesà partir de différentes préparations est approprié. 3. L&#39;analyse de la motilité cellulaire <ol><li> Placer les colloïdes d&#39;or revêtues de lamelles dans un milieu approprié cellulaires pour les cellules d&#39;intérêt. </li><li> Transfert des cellules traitées de manière appropriée sur les colloïdales revêtues d&#39;or lamelles placées dans un plat de 24 puits (s) </li></ol> Remarque: Le nombre de cellules transférées au bien unique doit être déterminée pour chaque type cellulaire étudié. Idéalement, les cellules doivent être également répartis sur l&#39;or colloïdal enduit de lamelle, qui à son tour permettra l&#39;analyse statistique des seules traces créées par une seule cellule. Si les cellules sont étalées à une concentration trop élevée, il devient très probable que les pistes se chevauchent de plusieurs cellules on le verra. Pistes qui se chevauchent ne peuvent pas être quantifiés avec précision et, par conséquent, ils ne peuvent pas être pris en compte dans les analyses finales du mouvement des cellules testées. Chevauchement titres à la suite d&#39;l&#39;implication de plusieurs cellules sont généralement faciles à observer, comme la fusion ou croisement des routes (dans le domaine de l&#39;analyse) dans lequel deux ou plusieurs cellules peuvent être observées dans la même zone contiguë effacé. <ol start="3"><li> Incuber à 37 ° C CO / 5% 2 pendant 24 heures (ou à toute heure convenable, par exemple, nous avons analysé la motilité des monocytes entre 6 h et 24 h cellules de post-traitement et endothéliales à 12 h post-traitement). Le délai optimal pour déterminer et mesurer la motilité cellulaire varie en fonction du type cellulaire étudié, et donc doit être déterminée expérimentalement pour chaque type de cellule (un bon point de départ, cependant, est de 6 à 12 heures après le traitement). </li></ol> Remarque: Si expérimentales colloïdales revêtues d&#39;or lamelles doivent être stockés et / ou analysées à un moment plus tard, les cellules et les nanoparticules d&#39;or doivent être fixés sur les lamelles. Pour accomplir cette étape de fixation; Étape suivante 3.3, premier lavage des lamelles de soin 2 fois avec 1xPBS (trempage des lamelles est préférable, comme le retrait de nanoparticules d&#39;or à partir des lamelles doit être évité), puis utiliser une méthode de fixation de cellules standard, telles que l&#39;incubation avec du paraformaldéhyde température ambiante de 3%. Après une incubation de 15 min, le paraformaldéhyde 3% doivent être enlevés et les lamelles soigneusement lavés 3 fois avec du PBS 1x. Les lamelles fixes peuvent être stockés dans un réfrigérateur. <ol start="4"><li> L&#39;utilisation d&#39;un microscope optique, capter des images des morceaux créés par une seule cellule mobile (Remarque: Le grossissement utilisé pour prendre des photos de pistes cellulaires vont certainement varier selon le type de cellule à l&#39;étude). Des exemples de voies cellulaires créés par les cellules non-mobiles et immobiles sur colloïdales d&#39;or revêtues de lamelles sont présentés dans la figure 2. </li></ol> Remarque: Les nanoparticules d&#39;or de la taille utilisée dans le test de motilité piste phagokinetic a été trouvé pour être complètement non toxique pour les cellules 30. Si nécessaire, La viabilité des cellules examinées peut être évaluée par coloration au bleu trypan ou examinés pour d&#39;autres marqueurs de la viabilité cellulaire. Il faudrait tenir compte de la nécessité pour la fixation, le type de fixation, etc, si cette étape doit être réalisée. <ol start="5"><li> En utilisant le logiciel librement disponible, comme logiciel ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) ou NIH Image ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/nih-image/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/</a> ), développés à l&#39; National Institutes of Health, ou ImageTool ( <a href="http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html" target="_blank">http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html</a> ) développé à l&#39;Université du Texas Health Science Center à San Antonio, la superficie moyenne (en unités arbitraires) de l&#39;or colloïdal autorisé par 10-20 ou plusieurs cellules (par exemple) est déterminé pour chaque groupe expérimental à partir des images capturées. Les statistiques peuvent alors être exécutés sur til a recueilli les résultats. Par exemple, les résultats peuvent être tracées en moyenne ± l&#39;erreur-type des moyens (SEM) avec des tests t de Student effectués, et une valeur de P &lt;0,05 utilisés comme mesure de la signification statistique entre les échantillons. Figures 3 et 4 montrent des étapes de la analyse de la zone de l&#39;or colloïdal dégagé par la cellule. </li></ol>

<ol>
	<li>Armstrong, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+cell+motility+during+embryogenesis.">The control of cell motility during embryogenesis.</a> Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop+and+go+traffic+to+tune+T+cell+responses.">Stop and go traffic to tune T cell responses.</a> Immunity. 21, 305-314 (2004).</li><li>Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tissue+repair:+from+wound+healing+to+fibrosis.">Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 5-17 (1997).</li><li>Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+proteins+in+migration+and+invasion.">Polarity proteins in migration and invasion.</a> Oncogene. 27, 6970-6980 (2008).</li><li>Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion:+integrating+cytoskeletal+dynamics+and+cellular+tension.">Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).</li><li>Mitchison, T. J., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+cell+motility+and+cell+locomotion.">Actin-based cell motility and cell locomotion.</a> Cell. 84, 371-379 (1996).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments.">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112, 453-465 (2003).</li><li>Bretscher, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+membrane+flow+and+the+cytoskeleton+to+cooperate+in+moving+cells.">Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells.</a> Cell. 87, 601-606 (1996).</li><li>Albrecht-Buehler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagokinetic+tracks+of+3T3+cells.">The phagokinetic tracks of 3T3 cells.</a> Cell. 11, 395-404 (1977).</li><li>Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cytomegalovirus+induces+monocyte+differentiation+and+migration+as+a+strategy+for+dissemination+and+persistence.">Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence.</a> J. Virol. 78, 4444-4453 (2004).</li><li>Palmisano, R., Itoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Metalloproteinase+Protocols.">Matrix Metalloproteinase Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 622, 379-392 (2010).</li><li>Ohta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOXD3-Overexpression+Increases+Integrin+Alpha+V+Beta+3+Expression+and+Deprives+E-Cadherin+while+It+Enhances+Cell+Motility+in+A549+Cells.">HOXD3-Overexpression Increases Integrin Alpha V Beta 3 Expression and Deprives E-Cadherin while It Enhances Cell Motility in A549 Cells.</a> Clinical and Experimental Metastasis. 7-8, 381-390 (2006).</li><li>Kawa, S., Kimura, S., Hakomori, S., Igarashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+chemotactic+motility+and+trans-endothelial+migration+of+human+neutrophils+by+sphingosine+1-phosphate.">Inhibition of chemotactic motility and trans-endothelial migration of human neutrophils by sphingosine 1-phosphate.</a> FEBS Lett. 420, 196-200 (1997).</li><li>Kawamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+and+WAVE2+acting+downstream+of+phosphatidylinositol+3-kinase+are+required+for+myogenic+cell+migration+induced+by+hepatocyte+growth+factor.">N-WASP and WAVE2 acting downstream of phosphatidylinositol 3-kinase are required for myogenic cell migration induced by hepatocyte growth factor.</a> J. Biol. Chem. 279, 54862-54871 (2004).</li><li>Ando, Y., Jensen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+and+insulin-like+growth+factor+I+enhance+keratinocyte+migration.">Epidermal growth factor and insulin-like growth factor I enhance keratinocyte migration.</a> J. Invest. Dermatol. 100, 633-639 (1993).</li><li>Todt, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+tumor+necrosis+factor-alpha+on+human+trophoblast+cell+adhesion+and+motility.">Effects of tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility.</a> Am. J. Reprod. Immunol. 36, 65-71 (1996).</li><li>McAuslan, B. R., Reilly, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+phagokinesis+in+response+to+specific+metal+ions.">Endothelial cell phagokinesis in response to specific metal ions.</a> Exp. Cell. Res. 130, 147-157 (1980).</li><li>Smith, M. S., Bentz, G. L., Smith, P. M., Bivins, E. R., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCMV+activates+PI(3)K+in+monocytes+and+promotes+monocyte+motility+and+transendothelial+migration+in+a+PI(3)K-dependent+manner.">HCMV activates PI(3)K in monocytes and promotes monocyte motility and transendothelial migration in a PI(3)K-dependent manner.</a> J. Leukoc. Biol. 76 (3), 65-76 (2004).</li><li>Smith, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+phosphatidylinositol+3-kinase+and+NF-kappaB+in+human+cytomegalovirus-mediated+monocyte+diapedesis+and+adhesion:+strategy+for+viral+persistence.">Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB in human cytomegalovirus-mediated monocyte diapedesis and adhesion: strategy for viral persistence.</a> J. Virol. 81, 7683-7694 (2007).</li><li>Bentz, G. L., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CMV+infection+of+endothelial+cells+induces+an+angiogenic+response+through+viral+binding+to+EGF+receptor+and+beta1+and+beta3+integrins.">Human CMV infection of endothelial cells induces an angiogenic response through viral binding to EGF receptor and beta1 and beta3 integrins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5531-5536 (2008).</li><li>Chan, G., Nogalski, M. T., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+EGFR+on+monocytes+is+required+for+human+cytomegalovirus+entry+and+mediates+cellular+motility.">Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22369-22374 (2009).</li><li>Nogalski, M. T., Chan, G., Stevenson, E. V., Gray, S., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCMV-Regulated+Paxillin+in+Monocytes+Links+Cellular+Pathogenic+Motility+to+the+Process+of+Viral+Entry.">HCMV-Regulated Paxillin in Monocytes Links Cellular Pathogenic Motility to the Process of Viral Entry.</a> J. Virol. 85, 1360-1369 (2011).</li><li>Turkevich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+nucleation+and+growth+processes+in+the+synthesis+of+colloidal+gold.">A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold.</a> Discuss. Faraday. Soc. 11, 55-75 (1951).</li><li>Frens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+and+sol+stability+in+mental+colloids.">Particle size and sol stability in mental colloids.</a> Colloid &#38; Polymer Science. 250, 736-741 (1972).</li><li>Frens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+nucleation+for+the+regulation+of+the+particle+size+in+monodisperse+gold+suspensions.">Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions.</a> Phys. Sci. 241, 20-22 (1973).</li><li>Zetter, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+capillary+endothelial+cell+migration.">Assay of capillary endothelial cell migration.</a> Methods Enzymol. 147, 135-144 (1987).</li><li>Scott, W. N., McCool, K., Nelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+the+production+of+gold+colloid+monolayers+for+use+in+the+phagokinetic+track+assay+for+cell+motility.">Improved method for the production of gold colloid monolayers for use in the phagokinetic track assay for cell motility.</a> Anal. Biochem. 287, 343-344 (2000).</li><li>Wang, S. Y., Mak, K. L., Chen, L. Y., Chou, M. P., Ho, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+blood+monocyte:+two+subpopulations+with+different+sizes,+phenotypes+and+functions.">Heterogeneity of human blood monocyte: two subpopulations with different sizes, phenotypes and functions.</a> Immunology. 77, 298-303 (1992).</li><li>Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+behavior+screen:+identification,+sorting,+and+enrichment+of+cells+based+on+motility.">A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility.</a> BMC Cell Biol. 6, 14 (2005).</li><li>Pan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+cytotoxicity+of+gold+nanoparticles.">Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles.</a> Small. 3, 1941-1949 (2007).</li><li>Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound-healing+assay.">Wound-healing assay.</a> Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Brooks, D. M., Brooks, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Invasion+Assay+Using+Matrigel(R).">In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R).</a> Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).</li><li>Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+DAPK+inhibits+cell+motility+by+blocking+the+integrin-mediated+polarity+pathway.">The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway.</a> J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).</li><li>Benazeraf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+random+cell+motility+gradient+downstream+of+FGF+controls+elongation+of+an+amniote+embryo.">A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo.</a> Nature. 466, 248-252 (2010).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le dosage de piste phagokinetic motilité présenté dans cet article est une méthode simple et très efficace pour l&#39;analyse quantitative de la migration cellulaire. Parce que plusieurs types de cellules peuvent être analysées 9-17, cette méthode présente l&#39;utilisation vaste potentiel dans de multiples disciplines. L&#39;utilisation de lamelles de verre colloïdales revêtues d&#39;or permet la mesure d&#39;une zone de route autorisée par une cellule mobile. Le test permet de mesurer l&#39;effe...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Lamelles de verre (15 mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-545-83 </td><td></td></tr><tr><td> Gélatine 300 Bloom </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-1890 </td><td></td></tr><tr><td> Trihydrate d&#39;acide tétrachloroaurique </td><td> Fisher Chemical </td><td> G54-1 </td><td> 14,5 mm (une solution de travail final) </td></tr><tr><td> Citrate de sodium </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP327-500 </td><td> 0,5% (solution de travail final) </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Fisher Scientific </td><td> O4042 </td><td> 3% (solution de travail final) </td></tr><tr><td> Boîte de 100 mm Tissue Culture </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802 </td><td></td></tr><tr><td> Plaques de 12 puits </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-29 </td><td></td></tr><tr><td> Plaques à 24 puits </td><td> Fisher Scientific </td><td> 07-200-84 </td><td></td></tr><tr><td> Four Techne Hybridiser HB-1D </td><td> LabPlanet </td><td> 2040500 </td><td> Le four de laboratoire standard sera suffisant </td></tr><tr><td> 10 pipettes sérologiques ml </td><td> Sarstedt </td><td> 86.1254.001 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet-Aid de remplissage / Distributeur </td><td> Drummond </td><td> 13-681-15 </td><td></td></tr><tr><td> P200 Single-Channel Pipette manuelle </td><td> Rainin </td><td> PR-200 </td><td></td></tr><tr><td> 200 Filtres barrière ml </td><td> CLP </td><td> BT200 </td><td></td></tr><tr><td> Logiciel ImageJ </td><td> <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">htt</a>p :/ / rsb.info.nih.gov / ij / </td><td></td><td> Licence: Public Domain </td></tr><tr><td> Nikon Eclipse TE300 avec un CoolSNAPfx photométriques monochrome 12-bit caméra CCD </td><td> Nikon </td><td></td><td> Discontinued; La spécification la plus comparable a Nikon Eclipse Ti, mais une extrémité inférieure Nikon 80i sera adapté aussi bien. Les autres marques également fournir des microscopes comparables. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Remarque: Les réactifs et équipements énumérés ci-dessous ont été utilisés par nous dans nos différentes études. Autres fournitures, des fournisseurs, des réactifs et de l&#39;équipement peut être utilisé, dans la mesure où ils ont des spécifications similaires. </td></tr></tbody></table>

a quantitative evaluation of cell migration by the phagokinetic track motility assay

La motilité cellulaire est un processus biologique important pour les deux organismes unicellulaires et multicellulaires. Il est essentiel pour le mouvement des organismes unicellulaires vers une source de nutriments ou de loin des conditions inappropriées, ainsi que dans les organismes multicellulaires pour le développement des tissus, la surveillance immunitaire et la cicatrisation des plaies, pour n&#39;en citer que quelques rôles 1,2,3. La déréglementation de ce processus peut entraîner de graves maladies neurologiques, cardio-vasculaires et immunologiques, ainsi que exacerbé la formation de tumeurs et la propagation 4,5. Moléculaire, polymérisation de l&#39;actine et de recyclage des récepteurs ont été montré à jouer un rôle important dans la création d&#39;extensions cellulaires (lamellipodes), qui animent le mouvement vers l&#39;avant de la cellule 6,7,8. Cependant, de nombreuses questions sur la migration des cellules biologiques restent sans réponse. Le rôle central de la motilité cellulaire sur la santé humaine et la maladie souligne l&#39;importance de comprendre le mec spécifiquehanisms impliqués dans ce processus et fait des méthodes précises d&#39;évaluation de la motilité cellulaire particulièrement important. Microscopes sont généralement utilisés pour visualiser le mouvement des cellules. Cependant, les cellules se déplacent assez lentement, ce qui rend la mesure quantitative de la migration des cellules d&#39;un processus consommateur de ressources nécessitant de coûteux appareils photographiques et des logiciels pour créer quantitatives temps périmé films de cellules mobiles. Par conséquent, la possibilité d&#39;effectuer une mesure quantitative de la migration cellulaire qui est rentable, non-laborieux, et qui utilise l&#39;équipement de laboratoire commun est une grande nécessité pour de nombreux chercheurs. Le dosage piste phagokinetic motilité utilise la capacité d&#39;une cellule mobile pour dégager des particules d&#39;or de sa trajectoire pour créer une piste mesurable sur une lamelle de verre enduit d&#39;or colloïdal, 9,10. Avec l&#39;utilisation de logiciels librement disponibles, plusieurs pistes peuvent être évalués pour chaque traitement pour accomplir les exigences statistiques. Le test peut être utilisé pour évaluermotilité de nombreux types de cellules, comme les cellules cancéreuses, 11,12 fibroblastes 9, 13, neutrophiles cellules musculaires squelettiques 14, 15, kératinocytes trophoblastes 16, les cellules endothéliales et les monocytes 17, 10,18-22. Le protocole implique la création de lames recouvertes de nanoparticules d&#39;or (Au ​​°) qui sont générés par une réduction de l&#39;acide chloroaurique (3 Au +) par le citrate de sodium. Cette méthode a été développée par Turkevich et al., En 1951 23, puis améliorée dans les années 1970 par Frens et al. 24,25. À la suite de cette étape de réduction chimique, des particules d&#39;or (10-20 nm de diamètre) précipiter à partir du mélange réactionnel et peuvent être appliqués à des lamelles de verre qui sont alors prêts à être utilisés dans des analyses de migration cellulaires 9,26,27. En général, le dosage piste phagokinetic motilité est une mesure rapide, quantitative et facile de la motilité cellulaire. En outre, ilpeut être utilisé comme un simple test à haut débit, pour une utilisation avec types de cellules qui ne se prêtent pas à temps caduc imagerie, ainsi que d&#39;autres utilisations en fonction des besoins du chercheur. Ensemble, la capacité de mesurer quantitativement la motilité cellulaire de plusieurs types de cellules, sans la nécessité pour les microscopes coûteux et des logiciels, ainsi que l&#39;utilisation de matériel de laboratoire et produits chimiques commun, faire l&#39;essai de piste phagokinetic motilité un choix solide pour les scientifiques ayant un intérêt dans la compréhension cellulaire motilité.

Montré est un exemple de photos prises au microscope optique montrant une zone de piste effacée par une seule cellule (un monocyte de nos expériences est illustré à la figure 2). Cellules non-mobiles de créer typique de petite taille, de forme ovale ou un cercle en forme de tracts autour d&#39;eux indiquant un faible niveau basal de mouvement de ces cellules non stimulées (Figures 2A et 2B). En revanche, les cellules très mobiles [dans notre système, le cytomégalovirus humain ...

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay at JoVE.com

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Le test de motilité phagokinetic piste est une méthode utilisée pour évaluer le mouvement des cellules. Plus précisément, le test mesure chimiokinèse (motilité cellulaire aléatoire) au fil du temps de manière quantitative. Le dosage tire parti de la capacité des cellules à créer une piste mesurable de leur mouvement sur colloïdales revêtues d&#39;or lamelles.

Une évaluation quantitative de la migration cellulaire par le test de motilité piste Phagokinetic

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

a-quantitative-evaluation-cell-migration-phagokinetic-track-motility

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.8K vues.  Louisiana State University Health Sciences Center. Le test de motilité phagokinetic piste est une méthode utilisée pour évaluer le mouvement des cellules. Plus précisément, le test mesure chimiokinèse (motilité cellulaire aléatoire) au fil du temps de manière quantitative. Le dosage tire parti de la capacité des cellules à créer une piste mesurable de leur mouvement sur colloïdales revêtues d'or lamelles.

Vidéo: A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true quantitative analysis of cellular inflammation. Flow cytometry is a quick alternative method to quantify immune cells in the injured brain or spinal cord tissue. Historically, flow cytometry has been used to quantify immune cells collected from blood or dissociated spleen or thymus, and only a few studies have attempted to quantify immune cells in the injured spinal cord by flow cytometry using fresh dissociated cord tissue. However, the dissociated spinal cord tissue is concentrated with myelin debris that can be mistaken for cells and reduce cell count reliability obtained by the flow cytometer. We have advanced a cell preparation method using the OptiPrep gradient system to effectively separate lipid/myelin debris from cells, providing sensitive and reliable quantifications of cellular inflammation in the injured spinal cord by flow cytometry. As described in our recent study (Beck &amp; Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47), the OptiPrep cell preparation had increased sensitivity to detect cellular inflammation in the injured spinal cord, with counts of specific cell types correlating with injury severity. Critically, novel usage of this method provided the first characterization of acute and chronic cellular inflammation after SCI to include a complete time course for polymorphonuclear leukocytes (PMNs, neutrophils), macrophages/microglia, and T-cells over a period ranging from 2 hours to 180 days post-injury (dpi), identifying a surprising novel second phase of cellular inflammation. Thorough characterization of cellular inflammation using this method may provide a better understanding of neuroinflammation in the injured CNS, and reveal an important multiphasic component of neuroinflammation that may be critical for the design and implementation of rational therapeutic treatment strategies, including both cell-based and pharmacological interventions for SCI.

Quantification of cellular inflammation in the injured/pathological CNS by flow cytometry is complicated by lipid/myelin debris that can have similar size and granulation to cells, decreasing sensitivity/accuracy. We have advanced a cell preparation method to remove myelin debris and improve cell detection by flow cytometry in the injured spinal cord.

Évaluation quantitative des cellules immunitaires dans le tissu blessés médullaires par cytométrie en flux: une nouvelle utilisation pour un procédé de purification cellulaire

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Recherche

Immunologie et infection

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Analyses quantitatives de tous influenza de type A hémagglutinines virales et les neuraminidases utilisant des anticorps Universal en simples essais slot blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

La détection de virus infectieux à partir terrain recueillies par les moustiques Assay culture cellulaire Vero

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

La migration des cellules dendritiques de surveillance utilisant l&#39;imagerie par résonance 19F / 1H magnétique

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

In vitro Essai de coculture pour évaluer la migration transépithéliale des neutrophiles induite par l’agent pathogène

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

Évaluation quantitative des neutrophiles migrations humaines à travers une culture d&#39;épithélium de la vessie

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Évaluation de conformation du VIH-1 trimère glycoprotéines d&#39;enveloppe l&#39;aide d&#39;un base de cellules test ELISA

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Haut-débit quantitative en temps réel RT-PCR analyse pour déterminer les profils d&#39;expression de types I et III sous-types d&#39;interféron

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Les analyses qualitatives et quantitatives pour la détection et la caractérisation des antimicrobiens en protéines

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...