Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche des Instituts canadiens de recherche en santé (IRSC, la RdP-86 749). L. Liu est récipiendaire du Prix de nouveau chercheur des IRSC (MSH-95374).

1. Préparation de Chemoattractant en gel d&#39;agarose <ol><li> Pipeter 10 mL de 2 × PBS dans un tube conique de 50 ml, et de se réchauffer le tube en le plaçant dans un bécher contenant de l&#39;eau chaude. </li><li> Pipeter 10 mL d&#39;eau distillée et ajouter 0,4 g de poudre d&#39;agarose dans un autre tube conique de 50 ml (avec son bouchon légèrement desserré) et chauffer le mélange jusqu&#39;à ce que d&#39;ébullition dans un four à micro-ondes (pour ~ 1 min dans un four à micro-ondes de 700 watts) . </li><li> Ajouter le réchauffé 2 × PBS à la solution d&#39;agarose du tube, agiter la solution mixte et garder au chaud dans le bécher d&#39;eau chaude. </li><li> Solution chimioattractive Micropipette (par exemple, 10 ul de 0,5 ug d&#39;chimiokines CXC MIP-2 ou de 12 pi de 1 WKYMVm mM) dans le couvercle d&#39;un tube de 1,5 ml Eppendorf contenant d&#39;encre 3 ul Inde et bien mélanger par aspiration à l&#39;aide d&#39;une micropipette (éviter bulle d&#39;air). </li><li> Coupez l&#39;extrémité pointe d&#39;un cône de pipette 200 ul et micropipette 110 pi d&#39;agarose solution (42 ° C) dans le couvercle et bien mélanger immédiatement en utilisant une autre extrémité de la pipette (éviter bulle d&#39;air). </li><li> Stocker le gel de chimioattractive contenant à +4 ° C. </li></ol> 2. Préparation du crémaster pour la microscopie intravitale (figure 1) <ol><li> Anesthetize une souris adulte mâle par une injection ip d&#39;un mélange de 10 mg / kg de xylazine et de 200 mg / kg de chlorhydrate de kétamine. </li><li> Rasez la zone devant le pied droit veine jugulaire externe et la face antérieure du scrotum avec un rasoir électrique. Après l&#39;anesthésie, il est important d&#39;accorder une attention spéciale et de soins à la souris anesthésiée. Une lampe de chaleur peut être utilisée pour empêcher la souris de l&#39;hypothermie. La souris doit être exempt de réflexes douleur. </li><li> Faire une incision horizontale, trouver et cathétériser la veine jugulaire en utilisant un tube PE-10 rempli de 100 salines héparine U / ml. Cathétérisme de la veine jugulaire est nécessaire pour l&#39;administration d&#39;anesthésiques et de médicaments supplémentaires si nécessaire. </li><li> Fixer les jambes arrières de souris avec du ruban ombilical avec la souris à plat ventre sur une planche faite maison crémaster (figure 1). </li><li> Branchez le conseil d&#39;administration à un circulateur d&#39;eau à 37 ° C pour garder le muscle crémaster et le corps de la souris chaude. </li></ol> Remarque: Toutes les procédures de 2,6 à 2,14 doit être réalisée très doucement 5. <ol start="6"><li> Faire une incision dans la peau du scrotum pour exposer le muscle crémaster gauche. Soigneusement disséquer le muscle du fascia associé. </li><li> Superfuse crémaster à 37 ° C-réchauffé bicarbonate de solution saline tamponnée (131,9 NaCl, KCl 4,7, 1,2 MgSO 4, 20 NaHCO 3, en mM, pH 7,4) en utilisant une pompe péristaltique. </li><li> Attachez un fil de suture 4-0 face à l&#39;extrémité distale du muscle crémaster pour le maintenir vers le bas sur le piédestal de verre visionnement clair du conseil crémaster. </li><li> Cautériser le crémaster longitudinalement. Avec de suture 4-0, tenir le plat de muscle et le fixer sur les bords sur le piédestal. Séparez le testicule et l&#39;épididyme du muscle sous-jacent et les déplacer dans la cavité abdominale. </li><li> Superfuse le muscle à ~ 0,6 ml / min avec le tampon de 37 ° C-perfusion réchauffés et couvrir les muscles exposés avec un 22 × 22 mm lamelle de verre. </li><li> Placez le plateau crémaster sur la platine du microscope, examiner le muscle sous le microscope, de trouver une veinule adaptée postcapillaires (Sélectionnez la veinule qui est droit et non ramifié et a un taux de cisaillement normal et un diamètre de 25 à 40 um) et ajuster la caméra vidéo pour permettre à la veinule pour être visualisées dans une position verticale à chaque extrémité gauche ou à droite de l&#39;écran de télévision. </li><li> Après 30 min de l&#39;équilibre, d&#39;enregistrer les images vidéo de la veinule sélectionnés postcapillaires pendant 5 min comme données de contrôle de base à l&#39;aide d&#39;un enregistreur vidéo. </li><li> Arrêter la surfusion et enlever la lamelle sur le muscle. </li><li> Placez une ~ 1-3 mm de taille chimiotactique-contenant du gel sur la surface du muscle crémaster dans une zone de 350 um d&#39;présélectionnés et parallèle à la veinule observés postcapillaires, ajouter la lamelle de tenir le gel en place et superfuse le tissu musculaire à un niveau très rythme lent (≤ 10 pl / min) pour permettre l&#39;établissement d&#39;un gradient de chimiotactique qui est libérée lentement et formé à partir du gel. </li><li> Enregistrement de l&#39;image vidéo pendant 90 min après l&#39;addition du gel contenant chimiotactique. Pendant l&#39;enregistrement, ajuster et garder le focus sur le microscope à adhérer, en rampant, et transmigrant chemotaxing leucocytes à l&#39;intérieur de la veinule et dans le tissu musculaire. </li><li> Après l&#39;expérience, importer le fichier vidéo sur un ordinateur pour analyse. </li></ol> 3. Suivi cellule à l&#39;aide ImageJ <ol><li> Sur un ordinateur, d&#39;extraire et de convertir la vidéo au format AVI (par exemple, l&#39;utilisation gratuite bitRipper logiciel pour convertir des DVD vidéo en fichier AVI). </li><li> Utilisez un logiciel de montage vidéo pour générer le film du temps écoulé. Par exemple, utiliser Windows Movie Maker pour faire un film du temps écoulé (à 1 / 512 ou 1 / 1024 time-lapse unet de 30 fps taux) de l&#39;original, vidéo en temps réel. Convertissez et enregistrez le temps écoulé décompressé film pour le format DV-AVI. </li><li> Enregistrer les images de calibration du micromètre dans le cadre même microscope, importer des images à l&#39;ordinateur, ouvrez les images avec ImageJ. En ImageJ, le nombre total de pixels apparaissent sur la partie supérieure gauche de l&#39;écran (par exemple, 720 × 480 pixels). Mesurer la taille de l&#39;écran à deux axes X et Y (par exemple, 200 × 150 um). De cela, calculer le nombre de pixels par um (par exemple, x = 720/200 = 3,6 pixels / um, et y = 480/150 = 3,2 pixels / um). </li><li> Pour importer le film, ouvrez ImageJ nouveau, cliquez sur «File-Import-Utiliser des films QuickTime Plug-in&quot;, sélectionnez le film à analyser et cliquez sur &quot;OK&quot; à l&#39;interface de &quot;Opener film QT&quot;. </li><li> Cliquez sur &quot;Plugins-Manuel de suivi&quot; pour suivre les cellules. Remplissez les informations pertinentes dans les champs au fond avant de suivi début. En bref, <ol><li> L&#39;intervalle de temps (en secondes) = fold-time-lapse/30 (Par exemple, une 1020 × time-lapse serait de 1020 à 1030 = 34 sec / frame interval). </li><li> X / Y = étalonnage de la mesure um / pixel en utilisant l&#39;étalonnage de l&#39;image du micromètre. </li><li> z = 0 de calibration (comme le muscle de souris crémaster est une couche extrêmement mince de ramper tissus et de cellules et de migration sont environ 2D sous champ lumineux transillumination). </li><li> Recherche de taille carrée pour le centrage = 1. </li><li> Dot taille / Ligne largeur / Taille de police: ils peuvent être ajustés si nécessaire. </li></ol></li><li> Sélectionnez un point stable et clair comme point de référence. Ce point de référence peut être n&#39;importe quel point claire et petite structure qui reste inchangé et stable tout au long de l&#39;expérience tout entière. Cliquez sur &quot;Ajouter une Piste&quot; pour suivre le point de référence de la première à la dernière image et cliquez sur &quot;Track End&quot;. Les données apparaissent sur le tableau des résultats automatiquement. </li><li> Suivre la migration des neutrophiles rampants et un par un: cliquez sur &quot;Ajouter une Piste&quot; pour suivre la cellule de son apparence dans le tissu à sa disparition dans chaque image et cliquez sur &quot;Track Fin&quot; pour terminer et enregistrer les résultats dans Microsoft Excel. </li></ol> 4. Analyse des paramètres de recrutement des neutrophiles <ol><li> Ouvrez le fichier de résultats dans Microsoft Excel, et analyser les données (prendre les changements de point de référence dans l&#39;analyse). </li><li> Ramper intraluminale <ol><li> Crawling distance: la distance totale de la cellule se traîne dans la lumière à partir du site initial adhérente au site de transmigration optimale (um). </li><li> Crawling vitesse: ramper distance / temps (um / min). </li></ol></li><li> Migration trans <ol><li> Temps de la Transmigration: à partir du moment de la cellule commence à transmigrer à travers l&#39;endothélium au moment où le corps de la cellule entière est juste en dehors de la veinule et aucun corps cellulaire peut être vu dans la lumière (min ou sec). </li><li> Détachement du temps: à partir du moment du corps cellulaire entier est juste à l&#39;extérieur de la veinule (immédiatement après la transmigration) au point dans le temps lorsque la cellule perd le contact avec la veinule (la queue se rétracte) (min ou sec). </li></ol></li><li> Chimiotactisme dans le tissu <ol><li> Distance de migration: la somme de la distance de la cellule se déplace du point de départ au point final de la migration dans les tissus (um). </li><li> Vitesse de migration: la distance de migration dans les tissus / heure (um / min). </li><li> Distance de chimiotactisme: la somme de la distance de la cellule migre dans l&#39;axe x dans le tissu (um). </li><li> Vitesse de chimiotactisme: chimiotactisme distance / temps (um / min). </li><li> Chimiotactisme indice: le ratio de division de la distance par chimiotactisme la distance de migration dans les tissus. </li></ol></li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Bien que la microscopie intravitale bightfield est utilisé pour l&#39;étude des interactions leucocytes-endothélium et peuvent ne pas être nécessairement pour les neutrophiles, nous a confirmé que, par nos études histologiques, plus de 95% des cellules neutrophiles recrutés dans les muscles crémaster chimioattractive traités étaient effectivement neutrophiles . Dans ce rapport, l&#39;aide sélective chimiotactiques neutrophiles, nous présentons les procédures de suivi du recrutement des neutrophiles in vivo. Plus précisément, nous décrivons un protocole de suivi de ramper intraluminale neutrophiles, migration trans, et le chimiotactisme dans le tissu musculaire chez des souris anesthésiées crémaster utilisant la microscopie time-lapse vidéo intravitale et ImageJ. Le gel chimioattractive contenant agarose sur le muscle crémaster libère lentement chimioattractant et permet un gradient chimiotactique être établi dans les tissus. Chimiotactique des neutrophiles induit des interactions cellulaires des neutrophiles-endothélium dans les veinules post crémastérien chez la souris. L&#39;expérience entière est visualisée sous un microscope fond clair debout intravitale avec des images vidéo projetées par une caméra vidéo couleur à un écran de télévision et enregistrées par un enregistreur vidéo. Nous avons déterminé les neutrophilesramper intraluminale, migration trans et la migration et le chimiotactisme dans le tissu musculaire en réponse à des neutrophiles chimioattractive MIP-2 et WKYMVm préparé en gel d&#39;agarose (figure 2). Nous avons constaté que MIP-2 (à 0,5 uM) et WKYMVm (à 0,1 mM) a suscité des neutrophiles ramper intraluminale à une vitesse similaire, la migration des neutrophiles transendothéliale et le détachement de la veinule de longueur de temps comparable, la migration des neutrophiles et le chimiotactisme dans le tissu musculaire à peu près au même vitesse et avec des index similaires chimiotactisme des polynucléaires neutrophiles (p&gt; 0,05, test t de Student). <img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. La représentation schématique d&#39;un système de microscope intravitale. Le muscle crémaster la souris est extériorisé sur le piédestal visionnement clair du conseil d&#39;administration crémaster sur scène microscope et perfusées avec 37 ° C-réchauffé bicarbonate de solution saline tamponnée. Le microscope droit est relié à une caméra CCD vidéo couleur pour fond clair intravitale microscopie. Un monochrome profonde refroidi caméra numérique CCD est également connecté au port de microscope pour la microscopie à fluorescence intravitale, les images à partir de laquelle sont directement traitées par un ordinateur. <img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Paramètres de recrutement de neutrophiles fond clair microscopie intravitale. Recrutement des neutrophiles a été induite par la libération progressive de chimiotactique des neutrophiles MIP-2 ou WKYMVm dans la préparation gel d&#39;agarose placé 350 um adjacent à la veinule postcapillaires. Temps écoulé-données vidéo ont été analysés par ImageJ après traitement à l&#39;enregistrement vidéo en temps réel de l&#39;expérience. Neutrophiles ramper intraluminale (A), le temps de la transmigration et le temps de détachement (B), la vitesse et la vitesse de migration dans les tissus chimiotactisme (C), et l&#39;indice de chimiotactisme dans le muscle crémaster (D) ont été déterminés après l&#39;administration de la MIP-2 ou WKYMVm gel d&#39;agarose sur crémaster chez les souris C57BL / 6 (n = 3, # des cellules suivi = 22 (en A et B) et 27 (en C et D) respectivement pour le MIP-2, et = 26 (en A et B) et 44 ( en C et D) respectivement pour WKYMVm).

<ol>
	<li>Liu, L., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+leukocyte+recruitment:+organ-specific+mechanisms+of+action.">Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action.</a> Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).</li><li>Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+leukocyte+recruitment:+an+in+vivo+perspective.">The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective.</a> J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).</li><li>Phillipson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraluminal+crawling+of+neutrophils+to+emigration+sites:+a+molecularly+distinct+process+from+adhesion+in+the+recruitment+cascade.">Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade.</a> J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).</li><li>Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulators+of+leucocyte+chemotaxis+during+inflammation.">Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation.</a> Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery.">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li><li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entering+the+Portal:+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope.">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li><li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo.">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li><li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis.">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration.">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li><li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+accelerates,+but+is+not+required+for,+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP.">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Microscopie intravitale est l&#39;outil indispensable pour révéler les mécanismes cellulaires et moléculaires de recrutement des leucocytes pendant l&#39;inflammation. La visualisation quantitative pour la détermination des interactions leucocytes-endothélium dans les microvaisseaux des tissus translucides tels que le muscle crémaster et le mésentère reste le gold standard pour l&#39;application de la technique de 1,5. La microscopie à fond clair conventionnels intravitale a beaucoup uniques caract?...

Tableau: Matériaux, réactifs et équipements spécifiques <table border="1"><tr><td> Nom du réactif / équipements </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Des tuyaux en polyéthylène, PE10 </td><td> Becton Dickinson </td><td> 427401 </td><td> ID 0.28mm x 0,61 mm OD </td></tr><tr><td> Encre de Chine </td><td> Speedball Art </td><td> Super Black </td><td> Pigments de carbone sans colorants 100% noir </td></tr><tr><td> Cautère </td><td> Aaron médicale </td><td> AA03 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> Bayer HealthCare, Bayer Inc </td><td> DIN 02169592 </td><td></td></tr><tr><td> Le chlorhydrate de kétamine </td><td> Bioniche Animal Health Canada Inc </td><td> DIN 01989529 </td><td></td></tr><tr><td> Murin MIP-2 recombinante </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 452-M2 </td><td></td></tr><tr><td> WKYMVm </td><td> Phoenix Pharma, Inc </td><td> 072-12 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td><td> Ultrapure </td></tr><tr><td> Héparine </td><td> Sigma </td><td> H-3393 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope droit </td><td> Olympus </td><td> BX61WI </td><td></td></tr><tr><td> 3CCD caméra vidéo couleur </td><td> SONY </td><td> DXC-990 </td><td></td></tr><tr><td> HD-DVD enregistreur vidéo </td><td> LG Electronics Inc </td><td> RH398H-M </td><td></td></tr><tr><td> Moniteur TV </td><td> LG Electronics Inc </td><td> 22LG30 </td><td></td></tr><tr><td> Circulateur d&#39;eau </td><td> Thermo Scientific </td><td> DC10 HAAKE </td><td></td></tr><tr><td> Pompe péristaltique </td><td> Gilson; Pharmacia </td><td> Gilson Minipuls 3; Pharmacia P-3 </td><td></td></tr><tr><td> Conseil crémaster </td><td> Université de la Saskatchewan </td><td></td><td> Home-made </td></tr></table>

tracking neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in tissue by intravital video microscopy

Le recrutement des leucocytes circulants à partir du flux sanguin vers les tissus enflammés est un processus crucial et complexe de 1,2 inflammation. Dans le veinules post des tissus enflammés, les leucocytes d&#39;abord d&#39;attache et rouler sur la surface luminale de veinules mur. Rouler arrestation leucocytes sur l&#39;endothélium et subissent adhésion ferme en réponse à chimiokine ou chimiotactiques autre sur la surface des veinules. Beaucoup de leucocytes adhérents relocaliser sur le site initial de l&#39;adhésion au site d&#39;extravasation jonctionnelle dans l&#39;endothélium, un processus appelé intraluminale ramper 3. Suite à ramper, se déplacer à travers l&#39;endothélium des leucocytes (transmigration) et migrent dans les tissus extravasculaires vers la source de chimiotactique (chimiotactisme) 4. Microscopie intravitale est un outil puissant pour la visualisation des interactions leucocytes-endothélium in vivo et révèle les mécanismes cellulaires et moléculaires du recrutement des leucocytes 2,5. Dans ce rapport, nous fournissons une description détaillée de l&#39;utilisation de la microscopie intravitale fond clair de visualiser et de déterminer le processus détaillé de recrutement des neutrophiles chez la souris crémaster muscle en réponse à la pente d&#39;un facteur chimiotactique des neutrophiles. Pour induire le recrutement de neutrophiles, un petit morceau de gel d&#39;agarose (~ 1 mm 3 dimensions) contenant chimiotactique des neutrophiles MIP-2 (CXCL2, une chimiokine CXC) ou WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, un analogue synthétique des peptides bactériens) est placé sur le tissu musculaire adjacent à la veinule observés postcapillaires. Avec le temps écoulé, la photographie vidéo et l&#39;ordinateur le logiciel ImageJ, neutrophiles ramper intraluminale sur l&#39;endothélium, la migration des neutrophiles transendothéliale et de la migration et le chimiotactisme dans les tissus sont visualisés et suivis. Ce protocole permet une analyse fiable et quantitative de nombreux paramètres tels que le recrutement de neutrophiles vitesse de ramper intraluminale, le temps de la transmigration, le temps de détachement, la vitesse de migration, la vitesse et l&#39;indice de chimiotactisme chimiotactisme dans les tissus. Nous démontrons que l&#39;utilisation de ce protocole, ces paramètres peuvent être le recrutement de neutrophiles stable déterminée et la locomotion cellule unique commodément suivi in vivo.

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Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

Nous décrivons un protocole de fond clair microscopie intravitale pour la mesure dynamique des interactions cellulaires des neutrophiles-endothélium lors du recrutement des neutrophiles en réponse à la source d&#39;un facteur chimiotactique des neutrophiles in vivo. Neutrophiles ramper intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus de souris crémaster sont visualisés avec la photographie vidéo en temps-caduque et suivis avec ImageJ.

Suivi des rampants neutrophiles intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus par microscopie intravitale Vidéo

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

tracking-neutrophil-intraluminal-crawling-transendothelial-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.5K vues.  University of Saskatchewan. Nous décrivons un protocole de fond clair microscopie intravitale pour la mesure dynamique des interactions cellulaires des neutrophiles-endothélium lors du recrutement des neutrophiles en réponse à la source d'un facteur chimiotactique des neutrophiles in vivo. Neutrophiles ramper intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus de souris crémaster sont visualisés avec la photographie vidéo en temps-caduque et suivis avec ImageJ.

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Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

Neutrophiles pièges extracellulaires: Comment générer et de les visualiser

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Recherche

Immunologie et infection

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Microscopie intravitale du ganglion lymphatique inguinal

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

In vitro Essai de coculture pour évaluer la migration transépithéliale des neutrophiles induite par l’agent pathogène

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

Évaluation quantitative des neutrophiles migrations humaines à travers une culture d&#39;épithélium de la vessie

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Très Résolu microscopie intravitale Striped-éclairage de centres germinaux

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&amp;#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Imagerie intravitale de neutrophiles Amorçage Utilisation de IL-1ß conduit promoteur-DsRed Souris Reporter

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil migration and chemotaxis owing to their advantages in real-time visualization, precise control of chemical concentration gradient generation, and reduced reagent and sample consumption. Recently, a growing effort has been made by the microfluidic researchers toward developing integrated and easily operated microfluidic chemotaxis analysis systems, directly from whole blood. In this direction, the first all-on-chip method was developed for integrating the magnetic negative purification of neutrophils and the chemotaxis assay from small blood volume samples. This new method permits a rapid sample-to-result neutrophil chemotaxis test in 25 min. In this paper, we provide detailed construction, operation and data analysis method for this all-on-chip chemotaxis assay with a discussion on troubleshooting strategies, limitations and future directions. Representative results of the neutrophil chemotaxis assay testing a defined chemoattractant, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), and sputum from a chronic obstructive pulmonary disease (COPD) patient, using this all-on-chip method are shown. This method is applicable to many cell migration-related investigations and clinical applications.

This article provides the detailed method of performing a rapid neutrophil chemotaxis assay by integrating the on-chip neutrophil isolation from whole blood and the chemotaxis test on a single microfluidic chip.

Une méthode intégrale pour l&#39;analyse rapide de la chimiotaxie des neutrophiles directement à partir d&#39;une goutte de sang

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

In Vitro Formation canine piège extracellulaire neutrophiles : Analyse dynamique et Quantitative par microscopie de Fluorescence

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

Imagerie cellulaire Interaction dans la muqueuse trachéale au cours de l’infection par le Virus grippal à l’aide de la microscopie intravitale biphotonique

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...