Les auteurs remercient grandement la plate-forme IBiSA PICT à l&#39;Institut Curie (CNRS UMR 144). Ce travail a été financé par des subventions de: le Conseil européen de la recherche à AM.LD (Strapacemi 243103), l&#39;Association Nationale pour la Recherche (ANR-09-Piri-0027-CPV), la fondation InNaBioSanté (Micemico) à MP et AM. LD et l&#39;ERC Strapacemi jeune subvention de chercheur à AM.LD.

Note importante: Ce protocole suppose que le moule contenant la forme pour les microcanaux désirés ont déjà été accomplis. Pour plus d&#39;informations sur la préparation du moule a été déjà publié 10. Ce protocole suppose aussi que la culture des pays en développement de la moelle osseuse est connu. Une. Fabrication de puces <ol><li> Mélanger l&#39;huile PDMS et l&#39;agent de durcissement dans un rapport pondéral 10:01 dans un gobelet en plastique. Mélanger soigneusement les deux composés. </li><li> Jetez le mélange sur les microcanaux d&#39;appui du moule. La hauteur totale doit être comprise entre 0,5-1 cm. </li><li> Retirer les bulles d&#39;air dans une cloche de pot sous vide pendant 1 heure. </li><li> PDMS durcir dans le moule, en plaçant celle-ci dans un four pendant 2 heures à 65 ° C. </li><li> Une fois que le PDMS est à température ambiante, couper un gros morceau autour de la structure avec une lame chirurgicale et le retirer du moule (figure 1A). </li><li> Percez des trous où les cellules seront injectées (généralement de 2 mm) et redimensionner le PDMSavec une lame chirurgicale pour s&#39;adapter à la taille des récipients en verre à fond dans lequel la migration sera évaluée (figure 1B). Avant de commencer, enlever la poussière résiduelle de l&#39;antenne à l&#39;aide du papier optique. Cela favorise la liaison de PDMS de verre décrit à l&#39;étape 1.10. </li><li> Nettoyez la puce PDMS redimensionnée contenant les canaux par collage et le pelage du ruban adhésif sur les côtés de la structure. </li><li> Soniquer les morceaux PDMS 30 sec à 70% d&#39;éthanol pour éliminer les poussières et les petites particules de PDMS. Séchez-les rapidement par la suite par soufflage d&#39;air propre. </li><li> Activer le PDMS (structures vers le haut) et des boîtes de culture à l&#39;air (ou d&#39;oxygène) traitement au plasma pendant 30 secondes à 300 mTorr. </li><li> Placez les deux surfaces activées au contact de coller définitivement les PDMS sur le substrat. Si nécessaire, l&#39;utilisation de pinces métalliques à presser légèrement sur ​​le dessus du PDMS pour forcer le contact entre le polymère et le verre de la cuvette (figure 1C). </li><li> Incuber la puce à l&#39;étuve à 65 ° C for 1 h à renforcer la liaison. </li></ol> 2. Revêtement de microcanaux <ol><li> Activer l&#39;ensemble de la structure par plasma dans l&#39;air à 300 mTorr pendant 1 min. Cela favorisera l&#39;entrée de liquide dans les canaux à l&#39;étape suivante. </li><li> Remplir rapidement les trous de la puce avec la fibronectine d&#39;entrée à 10 pg / ml dans l&#39;eau. D&#39;autres substrats tels que le PEG peuvent être utilisés pour modifier l&#39;adhérence des cellules aux parois du canal. Veillez à ce que le liquide se répand dans l&#39;ensemble de la structure. Ceci peut être facilement vérifié par l&#39;œil sous la lumière régulière ou en utilisant un microscope ordinaire de champ lumineux. NOTE: Dans les très petites structures, dont la diffusion est plus difficile, entrée de liquide dans les canaux peut être forcée en plaçant la structure dans une cloche de pot à vide pendant au moins 15 min. Pour vérifier l&#39;efficacité de l&#39;enrobage des substrats fluorescents peuvent être utilisés (figure 2). </li><li> Incuber 1 heure à température ambiante pour permettre l&#39;adsorption de la fibronectine ou tout autre revêtement de substévaluer les parois des canaux. </li><li> Lavez les structures 3x avec PBS pour éliminer le substrat nonbound. </li><li> Après le lavage, procéder au protocole 3 ou stocker la puce à 4 ° C pour une utilisation ultérieure (24 heures maximum). </li></ol> 3. Cellule Chargement en cours <ol><li> Retirer le PBS de la plaque et de remplir le microsystème avec du milieu cellulaire. Laissez incuber pendant 1 heure à saturer les canaux avec le milieu. NOTE: Pour les expériences portant sur des médicaments comme les inhibiteurs de molécules, il est conseillé de pré-incuber les canaux avec un milieu contenant le médicament à la bonne concentration. De plus, certains médicaments ont tendance à se solubiliser dans la structure PDMS qui réduit la concentration efficace. Certaines solutions ont été proposées pour contrer ce problème 11-12. </li><li> Retirer les PED flottants et récupérer les cellules semi-adhérentes par balayage avec un milieu de culture. Compter les cellules en utilisant un hématimètre. REMARQUE: Pour l&#39;imagerie noyau, un Hoechst 33342 coloration peut être obtenue au préalable par decubating 2 x 10 6 cellules pendant 30 min avec le colorant à 200 ng / ml dans du milieu complet. Laver deux fois par centrifugation pour éliminer l&#39;excès de colorant avant de poursuivre le protocole. </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min (temps et la vitesse peuvent être différents selon le type de cellule) et jeter le milieu. On dilue le culot pour atteindre une concentration de 20 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Éliminer l&#39;excès de milieu de la plaque et vider les trous d&#39;entrée dans la structure PDMS à l&#39;aide d&#39;une micropipette. Remplir les entrées avec 5 pl de solution de cellules pour atteindre une quantité de 1 x 10 5 cellules dans chaque trou d&#39;entrée. REMARQUE: La forte densité de cellule est nécessaire pour favoriser le contact des cellules avec les canaux. La faible densité de cellules peut donner lieu à un faible nombre de cellules à l&#39;intérieur des canaux et l&#39;échec de l&#39;expérience. </li><li> Incuber la puce pendant 30 min à 37 ° C dans l&#39;incubateur. Ajouter 2 ml de milieu complet à la boîte de test. NOTE: L&#39;ensemble de la structure de PDMS doit be couvert afin d&#39;éviter le séchage des cellules au cours de l&#39;expérience. Si 2 ml n&#39;est pas suffisant, ajouter plus de moyen pour couvrir complètement la structure PDMS. </li></ol> 4. Imagerie <ol><li> Nettoyer la surface externe du fond des plats avec le tissu de nettoyage de lentille avant de placer les plaques sous le microscope. </li><li> Pour analyser la migration en grand nombre de cellules, utiliser un grossissement de 10X et éclairage grand champ en CO 2 et la température équipée vidéo-microscope (Figure 3). Pour faciliter le suivi de la cellule, coloration de Hoechst et aux rayons UV peut être utilisé (voir l&#39;étape 3.2). La migration peut être également analysée en utilisant la microscopie confocale afin d&#39;obtenir une meilleure résolution des structures cellulaires au cours de la migration. </li><li> Pour la microscopie time-lapse à 10X, pour choisir une fréquence de temps selon la vitesse de cellule attendu (typiquement de 2 min pour les cellules dendritiques migrent à une vitesse de 5 um / min). Remarque: Le protocole décrit ici ne not comprennent l&#39;analyse des paramètres de migration cellulaire. Quelques points sont répertoriés dans la discussion d&#39;informer les lecteurs sur la façon de procéder pour extraire des informations à partir de films de time-lapse. </li></ol>

<ol>
	<li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+a+physically+integrated+molecular+process.">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Schor, S. L., Allen, T. D., Harrison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+through+three-dimensional+gels+of+native+collagen+fibres:+collagenolytic+activity+is+not+required+for+the+migration+of+two+permanent+cell+lines.">Cell migration through three-dimensional gels of native collagen fibres: collagenolytic activity is not required for the migration of two permanent cell lines.</a> J. Cell. Sci. 41, 159-175 (1980).</li><li>Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decisions+about+dendritic+cells:+past,+present,+and+future.">Decisions about dendritic cells: past, present, and future.</a> Annu. Rev. Immunol. 30, 1-22 (2012).</li><li>Faure-Andr&#233;, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+dendritic+cell+migration+by+CD74,+the+MHC+class+II-associated+invariant+chain.">Regulation of dendritic cell migration by CD74, the MHC class II-associated invariant chain.</a> Science. 322 (5908), 1705-1710 (2008).</li><li>Renkawitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+force+transmission+in+amoeboid+cell+migration.">Adaptive force transmission in amoeboid cell migration.</a> Nat. Cell Biol. 11 (12), 1438-1443 (2008).</li><li>Jacobelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confinement-optimized+three-dimensional+T+cell+amoeboid+motility+is+modulated+via+myosin+IIA-regulated+adhesions.">Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions.</a> Nat. Immunol. 11 (10), 953-961 (2010).</li><li>Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchinson, T., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+stimulation+and+constrained+cell+migration+in+microfluidic+channels.">Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 7 (12), 1783-1790 (2007).</li><li>Moreau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo.">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).</li><li>Heuz&#233;, M. L., Collin, O., Terriac, E., Lennon-Dum&#233;nil, A. M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+in+confinement:+a+micro-channel-based+assay.">Cell migration in confinement: a micro-channel-based assay.</a> Methods Mol. Biol. 769, 415-434 (2011).</li><li>Ren, K., Zhao, Y., Su, J., Ryan, D., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convenient+method+for+modifying+poly(dimethylsiloxane)+to+be+airtight+and+resistive+against+absorption+of+small+molecules.">Convenient method for modifying poly(dimethylsiloxane) to be airtight and resistive against absorption of small molecules.</a> Anal. Chem. 82 (14), 5965-5971 (2010).</li><li>Ren, K., Dai, W., Zhou, J., Su, J., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Teflon+microfluidic+chips.">Whole-Teflon microfluidic chips.</a> PNAS. 108 (20), 8162-8166 (2011).</li><li>Maiuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+World+Cell+Race.">The first World Cell Race.</a> Curr Biol. 22 (17), 673-675 (2012).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Ici, nous décrivons un dispositif composé de microcanaux comme une méthode pour étudier les propriétés migratoires des grand nombre de cellules dans des expériences simples. Ce système expérimental imite les contraintes environnementales confinés trouvés dans les tissus par des cellules migratoires endogènes. Cependant, en forçant la migration dans une seule dimension, il facilite le suivi automatique de la cellule et l&#39;extraction de paramètres mesurables (Figure 5). Nous montrons éga...

La migration est une fonction cellulaire complexe qui est important pour de nombreux processus physiologiques chez les organismes multicellulaires, y compris le développement, les réponses immunitaires, et la régénération des tissus. En outre, certaines situations pathologiques telles que l&#39;invasion tumorale et les métastases reposent sur ​​la motilité cellulaire 1. Pour ces raisons, la migration cellulaire est devenu un domaine d&#39;étude dans le cadre de la recherche à la fois fondamentale et translationnelle. In vivo, la plupart des tissus sont caractérisés par une matrice extracellulaire riche et haute densité cellulaire. La migration cellulaire par conséquent, dans des conditions physiologiques, se produit dans un environnement confiné complexe. Classiquement, probablement pour des raisons historiques et des limites techniques, la migration cellulaire a été étudiée dans les systèmes 2D plats qui ne se reproduisent pas beaucoup des propriétés de l&#39;environnement présentes dans les tissus, tels que l&#39;isolement. De plus, des facteurs comme l&#39;adhésion cellulaire, qui sont essentiels pour la motilité en 2D, ont été récemment montré à ne pas être necessacipalement requis pour la migration in vivo ou à l&#39;intérieur des gels, ce qui suggère que les mécanismes qui régissent la locomotion cellulaire en 2D et dans d&#39;autres environnements sont distincts 2. Plusieurs systèmes ont été développés pour imiter les propriétés complexes des tissus, le plus célèbre des gels de collagène les être, qui visent à récapituler les propriétés de la composition de la matrice extracellulaire 3. Ici, nous proposons des micro-canaux en tant que méthode complémentaire simple qui permet la migration des cellules d&#39;étude dans une dimension dans un environnement confiné. Dans ce système, les cellules migrent le long des microcanaux dans lesquels ils entrent spontanément. Cellules migratrices acquièrent alors la forme des canaux, l&#39;adoption d&#39;une géométrie tubulaire qui renforce probablement leur polarité. Le mouvement linéaire des cellules dans les canaux de la cellule permet un suivi automatique et l&#39;extraction des paramètres quantitatifs à partir d&#39;expériences. Du point de vue technique, ce système est facile et souple. Le Revêtementsg des parois de canal peut être manipulée, la taille et la forme des canaux peuvent être adaptées, et un grand nombre de cellules peut être analysée dans des expériences simples. Ce système peut également être mis à l&#39;échelle en place pour effectuer l&#39;analyse moyen de l&#39;écran de gamme de molécules impliquées dans la motilité cellulaire. Le protocole décrit ici a été normalisé en utilisant des cellules dendritiques (DC) comme un modèle cellulaire. Ces cellules sont la clé du système immunitaire car ils participent à l&#39;initiation et le maintien de réponses immunitaires spécifiques 4. In vitro, les PED ont été montré pour migrer spontanément dans des environnements confinés et sont donc un bon modèle pour étudier la motilité cellulaire dans des microcanaux 5,6 . Surtout, ce système peut être étendu pour analyser la migration de tout autre type de cellules mobiles comme les lymphocytes T, les neutrophiles, les cellules tumorales ou 9.7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="947">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:273px;">PolyDimethylSiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:131px;">GE Silicones</td>
			<td style="width:139px;">RTV615</td>
			<td style="width:405px;">Package of 90% silicone base and 10% curing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Core sample cutter</td>
			<td>Ted Pella Int.</td>
			<td>Harris Uni-Core&#160;</td>
			<td>Diameter 2,5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass-bottom dish</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Fluorodish FD 35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td>Branson Ultrasonics</td>
			<td>Branson 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC 32 G</td>
			<td>For small samples (35 dishes). A bigger version is also available</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)</td>
			<td>Susos</td>
			<td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y27632</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of cell migration in microfabricated channels

La méthode décrite ici permet l&#39;étude de la migration des cellules sous confinement dans une dimension. Il est basé sur l&#39;utilisation de canaux micro-usinés, qui imposent un phénotype de cellules polarisées par des contraintes physiques. Une fois à l&#39;intérieur des canaux, les cellules n&#39;ont que deux possibilités: aller de l&#39;avant ou vers l&#39;arrière. Cette migration simplifié dans lequel la directivité est limitée facilite le suivi automatique des cellules et l&#39;extraction des paramètres quantitatifs pour décrire le mouvement des cellules. Ces paramètres comprennent la vitesse de la cellule, les changements de direction, et les pauses pendant le mouvement. Microcanaux sont également compatibles avec l&#39;utilisation de marqueurs fluorescents et sont donc appropriés pour étudier la localisation des organites intracellulaires et des structures au cours de la migration cellulaire à haute résolution. Enfin, la surface des canaux peut être fonctionnalisé avec des substrats différents, ce qui permet le contrôle des propriétés adhésives des canaux ou l&#39;étude des haptotaxis. En résumé, le système havant que décrit est destiné à analyser la migration des grands nombres de cellules dans des conditions dans lesquelles à la fois la géométrie et la nature biochimique de l&#39;environnement sont contrôlées, ce qui facilite la normalisation et la reproductibilité des expériences indépendantes.

Dans chaque expérience, la surface du PDMS est revêtue d&#39;une molécule adaptée à l&#39;intérêt de l&#39;étude. Figure 2 montre les canaux revêtus d&#39;une molécule fluorescente, PLL-g-PEG, avant et après le lavage (étape 2.4). Une telle expérience permet de contrôler l&#39;homogénéité du revêtement dans les canaux. Après chargement de la cellule, la microscopie vidéo peut être effectuée pour suivre la migration cellulaire. Figure 3A...

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Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

Une méthode quantitative pour étudier la migration spontanée des cellules dans un micro-environnement confiné à une dimension est décrite. Ce procédé tire parti de canaux micro-usinés et peut être utilisée pour étudier la migration d&#39;un grand nombre de cellules dans des conditions différentes dans des expériences simples.

Etude de la migration cellulaire dans les canaux microfabriqués

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.8K vues.  Institut Curie.  Une méthode quantitative pour étudier la migration spontanée des cellules dans un micro-environnement confiné à une dimension est décrite. Ce procédé tire parti de canaux micro-usinés et peut être utilisée pour étudier la migration d'un grand nombre de cellules dans des conditions différentes dans des expériences simples. 

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Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Plates-formes pour la culture cellulaire microfabriqués mécanique dynamique

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Recherche

Bio-ingénierie

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Créer deux dimensions Substrats motifs pour le confinement des protéines et de cellules

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

Champ électrique contrôlé par les migrations des Réalisé cellules progénitrices neurales dans des environnements 2D et 3D

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Création de dégradés et adhésifs solubles pour la migration des cellules d&#39;imagerie par microscopie à fluorescence

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to investigate mechanisms governing cell adhesion under dynamic flow conditions. For instance, cancer cells labeled with multiple fluorophores can be perfused over a potentially reactive substrate to model mechanisms of cancer metastasis. However, multi-channel single camera systems and color cameras exhibit shortcomings in image acquisition for real-time live cell analysis. To overcome these limitations, we used a dual camera emission splitting system to simultaneously capture real-time image sequences of fluorescently labeled cells in the flow chamber. Dual camera emission splitting systems filter defined wavelength ranges into two monochrome CCD cameras, thereby simultaneously capturing two spatially identical but fluorophore-specific images. Subsequently, psuedocolored one-channel images are combined into a single real-time merged sequence that can reveal multiple target molecules on cells moving rapidly across a region of interest.

Dual camera emission splitting systems for two-color fluorescence microscopy generate real-time image sequences with exceptional optical and temporal resolution, a requirement of certain live cell assays including parallel plate flow chamber adhesion assays. When software is employed to merge images from simultaneously acquired emission channels, pseudocolored image sequences are produced.

Capture simultanément en temps réel des images en deux canaux d&#39;émission en utilisant un système de fractionnement double caméra émission: Applications à l&#39;adhésion cellulaire

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

L&#39;utilisation de puces microfluidiques pour l&#39;imagerie en direct et l&#39;étude des réponses blessures en<em&gt; Drosophila</em&gt; Larves

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Analyse de la migration cellulaire dans un tridimensionnelle Matrice Collagène

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

Système de Gel concentrique à étudier le rôle biophysique de Matrix microenvironnement sur 3D migration cellulaire

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not occur. With conventional templates, the absence of internal micro-channels results in the lack of cell infiltration, distribution, and inhabitance deep inside the templates. Hence, a highly porous and uniformly interconnected trabecular-bone-like template with micro-channels (biogenic microenvironment template; BMT) has been developed to address these obstacles. The novel BMT was created by innovative concepts (capillary action) and fabricated with a sponge-template coating technique. The BMT consists of several structural components: inter-connected primary-pores (300-400 &#181;m) that mimic pores in trabecular bone, micro-channels (25-70 &#181;m) within each trabecula, and nanopores (100-400 nm) on the surface to allow cells to anchor. Moreover, the BMT has been documented by mechanical test study to have similar mechanical strength properties to those of human trabecular bone (~3.8 MPa)12.
The BMT exhibited high absorption, retention, and habitation of cells throughout the bridge-shaped (&#928;) templates (3 cm height and 4 cm length). The cells that were initially seeded into one end of the templates immediately mobilized to the other end (10 cm distance) by capillary action of the BMT on the cell media. After 4 hr, the cells homogenously occupied the entire BMT and exhibited normal cellular behavior. The capillary action accounted for the infiltration of the cells suspended in the media and the distribution (active migration) throughout the BMT. Having observed these capabilities of the BMT, we project that BMTs will absorb bone marrow cells, growth factors, and nutrients from the periphery under physiological conditions.
The BMT may resolve current limitations via rapid infiltration, homogenous distribution and inhabitance of cells in large, volumetric templates to repair massive skeletal defects.

A step-by-step generic process to create a bone-like template with engineered micro-channels is presented. High absorption and retention capabilities of the template are demonstrated by capillary action via micro-channels.

Modèles distinctif action capillaire par des micro-canaux en os comme peuvent améliorer le recrutement des cellules pour la restauration de la Grande Bony Défaut

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Préparation de la 3D collagène Gels et microcanaux pour l&#39;étude des interactions 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...