Les auteurs tiennent à remercier le Dr Hui Zheng (Baylor College of Medicine) pour l&#39;APP ADNc. Ce travail a été financé par des subventions du NIH R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), le Mémorial John Sealy Fonds de dotation pour la recherche biomédicale (AFO), et le C. Jean et William D. Willis de recherche en neurosciences de dotation (ESS). JMB est un savant dans le programme de recherche translationnelle Scholar et un membre de l&#39;Université du Texas Medical Branch Claude E. Pepper Centre ancien indépendance Américains (soutenu par des subventions du NIH UL1RR029876 et P30-AG-024 832, respectivement).

<html> 1. Expression du recombinant domaine intracellulaire APP (AICD) <ol><li> Transform E. coli souche BL21 avec AICD humaine (résidus 649-695 de l&#39;APP, isoforme neuronale de numérotation) cloné dans le vecteur pGEX-4T-1 (GE Healthcare). Ce vecteur exprimera AICD que le fragment C-terminal d&#39;une protéine de fusion de glutathion-S-transférase (GST). Ce vecteur code également pour une séquence de clivage de la thrombine pour faciliter le retrait du fragment GST. Détails du clonage AICD dans pGEX-4T-1 peuvent être trouvées dans notre publication précédente 4. </li><li> D&#39;une seule colonie, inoculer 10 ml de bouillon LB avec ampicilline (100 pg / ml) et incuber une nuit à 37 ° C avec agitation vigoureuse. </li><li> Le lendemain matin, inoculer 400 ml de LB / ampicilline dans un ballon d&#39;un litre avec 5 ml de la culture d&#39;une nuit. </li><li> Incuber à 37 ° C avec une agitation vigoureuse jusqu&#39;à ce que la densité optique à 600 nm a atteint 0,4 à 0,6. Cela prend normalement 2 à 2,5 heures. </li></ol>contenu &quot;&gt; A ce stade, il peut être souhaitable de prendre un petit échantillon (~ 10 pi) pour suivre la purification par SDS-PAGE (voir la figure 1A, B). Chaque étape ultérieure de purification devrait également avoir une petite aliquote prélevée pour analyse par SDS-PAGE. <ol start="5"><li> Induire l&#39;expression de GST-AICD en ajoutant 0,4 mM d&#39;isopropyl-bêta-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Incuber à 37 ° C avec une agitation vigoureuse pendant 5 heures. </li><li> Centrifuger les cellules à 6000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Le culot cellulaire peut être conservé à -80 ° C pendant plusieurs mois à ce stade de la procédure. </li></ol> 2. Purification de la TPS-AICD <ol><li> Préparer 50 ml de tampon de lyse comme suit: 1 mM de dithiothréitol, 1 mM d&#39;acide éthylène diamine (EDTA), 0,1% de Triton-X100, 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), Complete cocktail inhibiteur de la protéase (Roche Applied Science), et un tampon phosphate salin. Refroidir sur glace. </li><li> Décongeler culot bactérien (s&#39;il a déjà été congelé) surglace. </li></ol> À ce stade, il est essentiel que toutes les mesures sont réalisées à 4 ° C pour limiter la protéolyse. Tous les tubes, les tampons et autres réactifs doivent être pré-refroidi. Si vous utilisez un presse française ou émulsifiant pour la lyse, ceux-ci doivent être pré-réfrigérés ainsi. <ol start="3"><li> Bien remettre en suspension le culot bactérien dans 20 ml de tampon de lyse. Une combinaison de tourbillonnement et trituration avec 10 ml pipette sur glace assurer la remise en suspension complète de la pastille. </li><li> Passez les cellules remises en suspension bactérienne à travers un émulsifiant (par exemple, Avestin EmulsiFlex-C3) ou de cellules pression française, de pré-réfrigérés à 4 ° C à 30000 psi. Passer le lysat par l&#39;émulsifiant une deuxième fois. Recueillir le lysat dans un pré-réfrigérés tube de 50 ml. </li></ol> Le principal avantage de ces deux instruments est qu&#39;ils minimiser l&#39;échauffement de l&#39;échantillon. La technique couramment utilisée de sonication produit une chaleur considérable à la pointe de la sonde de sonication etpeut se traduire par l&#39;agrégation de protéines recombinantes. <ol start="5"><li> Centrifuger le lysat à 15.000 xg pendant 30 min. Séparez-les et gardez le surnageant dans un pré-réfrigérés tube de 50 ml. </li><li> Ajouter 500 ul d&#39;une suspension de 50% de la glutathion-agarose (Sigma-Aldrich). Tourner pendant 30 min à 4 ° C. Alors que l&#39;échantillon est en rotation, faire tampon d&#39;élution frais: 50 mM Tris 7,8, 0,1% de Triton-X100, 0,5 mM de dithiothréitol, 10 mM de glutathion réduit. </li></ol> La seule étape du protocole, qui est exécuté à la température ambiante est l&#39;étape d&#39;élution. Ainsi, le tampon d&#39;élution est maintenue à la température ambiante. Tampon d&#39;élution doit être préparé. <ol start="7"><li> Verser la pâte dans lysat et un jetable 5 &quot;colonne de chromatographie en polystyrène avec grossières (de 90 à 130 um) filtres (Evergreen Scientific). Laver la colonne 5 fois avec 3 ml de tampon phosphate salin. </li><li> Coiffer la partie inférieure de la colonne et ajouter 500 ul de tampon d&#39;élution à température ambiante. Coiffer la partie supérieure de l&#39;et faire tourner la colonne pendant 5 minutes à température ambiante. Recueillir l&#39;éluat dans un tube de 1,5 microcentrifugeuse réfrigérée ml. Répéter l&#39;élution deux fois plus (1,5 ml éluat total). </li><li> Dialyser l&#39;éluat dans un 10.000 membrane de dialyse poids moléculaire de coupure (par exemple, Thermo Scientific Slide-A-Lyzer dialyse cassettes) dans 4 litres d&#39;un tampon phosphate salin nuit à 4 ° C. Dialyse contre encore 4 litres de tampon phosphate salin à 4 ° C pendant 1 heure le jour suivant. </li><li> Éliminer la protéine à partir de la cassette de dialyse et d&#39;effectuer un test de quantification de protéines afin de déterminer le rendement de GST-AICD. Une purification typique de 400 ml de culture se traduira par des rendements de&gt; 20 mg de protéine purifiée à une concentration de 10-20 mg / ml. Aliquoter la protéine dans 200 aliquotes et congeler à -80 ° C. </li></ol> 3. Clivage de la thrombine de la TPS-AICD et purification de l&#39;AICD <ol><li> Dégel 200 pi d&#39;eau purifiée GST-AICD et ajouter 20 ul de 1 U / ul Thrombpo Incuber une nuit à 37 ° C. </li></ol> La qualité et la pureté de la thrombine varie considérablement selon les fabricants, et peut être une source importante de contamination. Nous utilisons la thrombine de GE Healthcare (voir tableau des réactifs). Après une nuit d&#39;incubation,&gt; 95% de la protéine de fusion devrait être clivé (figure 1B). <ol start="2"><li> Après clivage du jour au lendemain avec de la thrombine, il est probable qu&#39;une fraction de l&#39;AICD libéré a subi l&#39;agrégation et la solution peut paraître trouble. Décochez la matière agrégée par centrifugation à 20.000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Retirer le surnageant dans un tube de centrifugeuse pré-réfrigérés. </li><li> Ajouter 50 ul de 50% de glutathion-agarose boue et 50 ul de 50% de p-aminobenzamidine-agarose bouillie pour éliminer la TPS et de la thrombine, respectivement. Incuber avec rotation pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Centrifuger brièvement pour sédimenter les billes d&#39;agarose, et retirer le surnageant dans un nouveau tube. Extrait til TPS quatre fois plus de glutathion-agarose. Une seule extraction avec du p-aminobenzamidine-agarose est suffisante pour éliminer l&#39;U 20 de la thrombine. </li><li> Effectuer un essai de quantification des protéines sur 5 ul de l&#39;AICD purifié. Les rendements typiques d&#39;une culture de 400 ml sont 50-100 pg à une concentration de 0,2 à 0,5 mg / ml. Des rendements plus élevés sont possibles par clivage de plus grands volumes de TPS-AICD. </li></ol> Purifiée AICD doit être préparé pour la caractérisation biochimique / biophysique. Le matériau non utilisé doit être jeté. Il est également possible de concentrer l&#39;AICD par lyophilisation de l&#39;échantillon et la remise en suspension dans un plus petit volume de tampon 6. Si la détection de l&#39;AICD nécessite blot (par exemple après un piège filtre ou un test dot blot), récupération d&#39;antigène sur la membrane doit être effectué comme décrit par Pimplikar et Suryanarayana 12. 4. Agrégation de l&#39;AICD pour la microscopie à force atomique (AFM) <ol><li> Diluer fraîchement préparé AICD en phosphate une solution saline tamponnée à une concentration de 0,1 mg / ml dans un volume final de 15 ul. À ce stade, divers composés et / ou des protéines peuvent être ajoutés afin de déterminer si elles inhibent l&#39;agrégation AICD. Par exemple, nous avons montré que des concentrations équimolaires de ubiquilin-1 empêcher l&#39;agrégation de l&#39;AICD dans cet essai 4. </li></ol> Il est également possible d&#39;agréger des volumes de réaction plus importants pour des expériences biochimiques tels que les essais piège de filtre et diffusion de la lumière 4. Nous avons eu des succès effectuer des dosages piège de filtre sur les mélanges de réaction plus grande que 400 pi avec AICD dilués à des concentrations aussi faibles que 1 uM. <ol start="2"><li> Induire l&#39;agrégation thermique par l&#39;incubation des échantillons à 43 ° C sous agitation à 800 rpm dans un Thermomixer Eppendorf pendant 48 heures. Cette température a été choisie en fonction de chaperon tests qui examinent l&#39;agrégation thermique de la synthase modèle chaperon citrate 4,13 substrat. </li></ol><p class="jove_content"Agrégation&gt; thermique est une méthode couramment utilisée pour induire la transition structurale d&#39;une protéine à partir d&#39;un natif d&#39;une structure non-natif (ce qui est généralement riche en feuillet bêta) qui aboutit à la formation d&#39;agrégats intermoléculaires. Agrégation thermique est également utilisé pour examiner la fonction de chaperons moléculaires, qui protègent les segments hydrophobes de former des interactions intermoléculaires inapproprié (et donc de retarder ou d&#39;empêcher l&#39;agrégation thermique). <ol start="3"><li> Diluer l&#39;échantillon de 20 fois dans de l&#39;eau déminéralisée et place 2 pl sur du mica fraîchement clivé. Sécher l&#39;échantillon dans un dessiccateur durant la nuit. Il sera nécessaire de déterminer empiriquement la dilution optimale pour l&#39;imagerie, et donc plusieurs dilutions allant de 10 - à 100 fois serait prudent. </li><li> Visualisez l&#39;AICD agrégés en utilisant l&#39;AFM exploitation en mode tapping 14. Les leviers utilisés sont revêtues d&#39;or micro leviers de nitrure de tranchants (MSNL, Bruker) avec un rayon de pointe nominal de 2 nm. Typique tapant amplitudes au courstion d&#39;imagerie sont 10-20 nm à la fréquence de résonance des leviers (30-50 kHz). </li></ol> Nous avons constaté que la qualité d&#39;image et de contraste d&#39;agrégats de protéines différentes dépendait de la force appliquée et la durée de l&#39;expérience. Afin de minimiser la perturbation de la pointe d&#39;échantillon, on maintient la force appliquée relativement basse en conservant un rapport de consigne au-dessus de 95% et de limiter le balayage de chaque échantillon de 5-10 min. Traitement de l&#39;image a été réalisée avec le logiciel WSxM (Nanotec). Traitement d&#39;image standard reposait d&#39;avion soustraction et d&#39;aplatissement. Nos laboratoires utilisent une «maison construite&quot; AFM 15 couplé à un système de balayage de sonde contrôle commercial microscope (Nanotec). 5. Les résultats représentatifs L&#39;expression et l&#39;enrichissement relatif de la TPS AICD est illustré à la figure 1A. Après la lyse, la majorité de la protéine de fusion est présente dans la fraction soluble, et par conséquent l&#39;extraction de Inclusile corps n&#39;est pas nécessaire. La matière éluée de la colonne d&#39;agarose glutathion est&gt; 95% de pureté. Dans la préparation de la figure 1, la concentration de la protéine éluée de la colonne était de 14,5 mg / ml, et le rendement est de 22 mg (à partir d&#39;une culture de départ de 400 ml). Le clivage de 200 pi de cette préparation pendant la nuit avec 20 U de thrombine donné lieu à près de 100% clivage de la protéine de fusion (figure 1B). La quantité de thrombine utilisée est suffisamment faible pour ne pas être détectable par coloration au bleu de Coomassie (voir «clivée» figure 1B voie,). Suppression de la thrombine et de la TPS a entraîné une certaine perte de matériel, mais il était&gt; 90% pur avec un rendement de cette préparation de 70 ug de l&#39;AICD à une concentration de 0,35 mg / ml. Figure 1C montre le diagramme pour l&#39;agrégation de l&#39;AICD et une analyse ultérieure. Agrégats AICD imagées par AFM sont généralement sphéroïde / amorphe, et varient en taille de 50 à 100 nm (figure 1D, F). Agrégéesmatériau n&#39;est pas détectable lorsqu&#39;une quantité équimolaire du chaperon ubiquilin-1 est ajouté à la réaction de coagulation (figure 1E) 4. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4204/4204fig1.jpg" /> Figure 1. Purification et l&#39;agrégation de l&#39;AICD. A) au bleu de Coomassie coloration des échantillons prélevés à chaque étape du processus de purification. Pour les échantillons non induits et induits, 20 ul de bactéries totales ont été effectuées sur le gel. Pour la fraction surnageante, 5 pl de lysat (d&#39;un volume total de 20 ml) ont été effectués sur le gel. Pour la fraction de culot, le culot a été remis en suspension dans 20 ml de tampon de lyse, et 5 pi de ce matériel ont été soumis à une sonication dans un sonicateur bain-marie pendant 30 min à 4 ° C avant le chargement sur le gel. Pour le flux continu, 5 ul ont été effectués sur le gel. Les quantités d&#39;éluat chargés sur le gel sont indiqués. B) Gel teinté bleu de Coomassie de non clivée et clivée TPS-AICD (2 pi) et de 1 et 5 m &amp;u; l purifiée AICD. C) Organigramme de purification AICD, l&#39;agrégation et l&#39;analyse. D, E) représentant l&#39;image de l&#39;AFM thermiquement agrégées AICD en l&#39;absence (D) et en présence (E) de la protéine chaperon moléculaire ubiquilin-1. F) Histogramme de la distribution en taille des agrégats AICD.

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	<li>De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretases:+enzymes+with+therapeutic+potential+in+Alzheimer+disease.">The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease.</a> Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).</li><li>Chang, K. A., Suh, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+roles+of+amyloid+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein.">Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein.</a> BMB reports. 43, 656-663 (2010).</li><li>McLoughlin, D. M., Miller, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FE65+proteins+and+Alzheimer's+disease.">The FE65 proteins and Alzheimer's disease.</a> J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).</li><li>Stieren, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquilin-1+is+a+molecular+chaperone+for+the+amyloid+precursor+protein.">Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).</li><li>Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-induced+structural+changes+in+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+detected+by+NMR.">Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR.</a> J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).</li><li>Ramelot, T. A., Gentile, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+structure+of+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+indicates+preordering+of+structure+for+binding+to+cytosolic+factors.">Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors.</a> Biochem. 39, 2714-2725 (2000).</li><li>Radzimanowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+intracellular+domain+of+the+amyloid+precursor+protein+in+complex+with+Fe65-PTB2.">Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2.</a> EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).</li><li>Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+alters+gene+expression+and+induces+neuron-specific+apoptosis.">The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis.</a> Gene. 475, 1-9 (2011).</li><li>von Rotz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+APP+intracellular+domain+forms+nuclear+multiprotein+complexes+and+regulates+the+transcription+of+its+own+precursor.">The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor.</a> J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).</li><li>Hamid, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+modulates+cellular+calcium+homeostasis+and+ATP+content.">Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content.</a> J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).</li><li>Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APP+intracellular+domain+impairs+adult+neurogenesis+in+transgenic+mice+by+inducing+neuroinflammation.">APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation.</a> PLoS ONE. 5, e11866 (2010).</li><li>Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+APP+intracellular+domain+in+brain+tissue.">Detection of APP intracellular domain in brain tissue.</a> Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).</li><li>Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chaperone+function+using+citrate+synthase+as+nonnative+substrate+protein.">Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein.</a> Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).</li><li>Hansma, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+atomic+force+microscopy+of+DNA.">Recent advances in atomic force microscopy of DNA.</a> Scanning. 15, 296-299 (1993).</li><li>Valbuena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasi-simultaneous+imaging/pulling+analysis+of+single+polyprotein+molecules+by+atomic+force+microscopy.">Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy.</a> Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).</li><li>Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction,+purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+human+Fe65-PTB2+in+complex+with+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain.">Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain.</a> Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).</li><li>Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein+interacts+with+flotillin-1,+a+lipid+raft+protein.">The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).</li><li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Notch1+signaling+by+the+APP+intracellular+domain+facilitates+degradation+of+the+Notch1+intracellular+domain+and+RBP-Jk.">Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk.</a> J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).</li><li>Lazarov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport,+amyloid+precursor+protein,+kinesin-1,+and+the+processing+apparatus:+revisited.">Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited.</a> J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).</li><li>Kakuda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equimolar+production+of+amyloid+beta-protein+and+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+from+beta-carboxyl-terminal+fragment+by+gamma-secretase.">Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase.</a> J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).</li><li>Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+under+the+atomic+force+microscope.">Amyloid under the atomic force microscope.</a> Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans ce protocole, nous avons décrit une procédure pour l&#39;obtention de l&#39;AICD très pur pour analyses structurales, biophysiques et biochimiques. Cette procédure ne nécessite pas de matériel sophistiqué et chromatographie est donc accessible à la plupart des laboratoires. D&#39;autres groupes ont purifié AICD 5-7,16, y compris la TPS-AICD 17-19, pour des analyses biochimiques / structurelle. Inconvénients aux protocoles précédents incluent une mauvaise solubilité de l&#39;AICD <...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> pGEX-4T-1 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9545-49 </td><td></td></tr><tr><td> La thrombine </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-0846-01 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicilline </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1760 </td><td></td></tr><tr><td> Réactif de Bradford dosage des protéines </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Bleu de Coomassie </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6758 </td><td></td></tr><tr><td> Le glutathion-agarose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G4510 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> p-aminobenzamidine-agarose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7155 </td><td></td></tr><tr><td> Complete cocktail inhibiteur de la protéase </td><td> Roche </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> Cassettes de dialyse Slide-A-lyseur </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66380 </td><td></td></tr><tr><td> Colonnes de chromatographie </td><td> Evergreen Scientific </td><td> 208-3367-050 </td><td></td></tr><tr><td> Émulsifiant </td><td> Avestin, Inc </td><td> EmulsiFlex-C3 </td><td> Fortement recommandé </td></tr><tr><td> Eppendorf Thermomixer </td><td> Eppendorf </td><td> 022670107 </td><td></td></tr><tr><td> Disques de mica </td><td> Ted Pella </td><td> 50-12 </td><td></td></tr><tr><td> Cantilevers AFM </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td><td></td></tr><tr><td> WSxM logiciel </td><td> Nanotec </td><td> N / A </td><td> Free téléchargement </td></tr></tbody></table>

purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain

La protéine précurseur de l&#39;amyloïde (APP) est une protéine transmembranaire de type I associée à la pathogenèse de la maladie d&#39;Alzheimer (MA). APP est caractérisé par un grand domaine extracellulaire et un domaine cytoplasmique court appelé le domaine intracellulaire APP (AICD). Au cours de maturation à travers la voie sécrétoire, l&#39;APP peut être clivée par des protéases appelées α, β, γ-sécrétase et 1. Séquentiel clivage protéolytique de l&#39;APP et de β γ-sécrétase conduit à la production d&#39;un peptide protéolytique petit Aß appelé, qui est amyloïdogénique et le constituant de noyau de plaques séniles. L&#39;AICD est aussi libérée de la membrane après traitement sécrétase, et à travers les interactions avec Fe65 et Tip60, peut translocation vers le noyau de participer à la régulation de la transcription de gènes cibles multiples 2,3. Interactions protéine-protéine impliquant l&#39;AICD peut affecter le trafic, le traitement et les fonctions cellulaires de holo-APP et son C-termifragments al. Nous avons récemment montré que l&#39;AICD peut agrégat in vitro, et ce processus est inhibé par le ubiquilin-1-AD en cause chaperon moléculaire 4. Conformément à ces résultats, l&#39;AICD a mis en évidence des domaines hydrophobes et est intrinsèquement désordonnés in vitro 5,6, mais il obtient une structure secondaire stable lorsqu&#39;elle est liée à Fe65 7. Nous avons proposé que ubiquilin-1 empêche inappropriées interactions inter-et intramoléculaire de l&#39;AICD, empêchant l&#39;agrégation in vitro et dans des cellules intactes 4. Alors que la plupart des études portent sur le rôle de l&#39;APP dans la pathogénie de la MA, le rôle de l&#39;AICD dans ce processus n&#39;est pas clair. Expression de l&#39;AICD a été montré pour induire l&#39;apoptose 8, pour moduler les voies de signalisation 9, et de réguler la signalisation calcique 10. La surexpression de l&#39;AICD et Fe65 dans un modèle de souris transgénique induit la maladie d&#39;Alzheimer, comme la pathologie 11, et récemment l&#39;AICD a été détecté en soutien-gorgedans les lysats par western blot en utilisant des techniques appropriées de récupération d&#39;antigène 12. Pour faciliter les études structurales, biochimiques et biophysiques de l&#39;AICD, nous avons développé une procédure pour produire des quantités importantes de protéine recombinante AICD très pur. En outre, nous décrivons une méthode pour induire l&#39;agrégation in vitro thermique de l&#39;AICD et l&#39;analyse par microscopie à force atomique. Les méthodes décrites sont utiles pour la caractérisation biochimique, biophysique et structurale de l&#39;AICD et les effets de chaperons moléculaires sur l&#39;agrégation AICD.

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Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Une méthode pour purification à grande échelle du domaine intracellulaire APP (AICD) est décrite. Nous décrivons également une méthodologie pour induire<em&gt; In vitro</em&gt; AICD l&#39;agrégation et la visualisation par microscopie à force atomique. Les méthodes décrites sont utiles pour la caractérisation biochimique / structurelle de l&#39;AICD et les effets de chaperons moléculaires sur son agrégation.

La purification et l&#39;agrégation de la protéine précurseur amyloïde domaine intracellulaire

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

purification-aggregation-amyloid-precursor-protein-intracellular

Research

JoVE Journal

Medicine

11.7K vues.  University of Texas Medical Branch. Une méthode pour purification à grande échelle du domaine intracellulaire APP (AICD) est décrite. Nous décrivons également une méthodologie pour induire In vitro AICD l'agrégation et la visualisation par microscopie à force atomique. Les méthodes décrites sont utiles pour la caractérisation biochimique / structurelle de l'AICD et les effets de chaperons moléculaires sur son agrégation.

Vidéo: Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis. Since the clinical presentation of this disease is so variable and non-specific, the associated risks of these biopsies are too great for the diagnostic yield. Other sites that have a lower biopsy risk, such as skin or gingival, are also relatively invasive and expensive. In addition, these biopsies may not always have sufficient amyloid deposits to establish a diagnosis. Fat pad aspiration has demonstrated good clinical correlation with low cost and minimal morbidity. However, there are no standardized protocols for performing this procedure or processing the aspirated specimen, which leads to variable and nonreproducible results. The most frequently utilized modality for detecting amyloid in tissue is an apple-green birefringence on Congo red stained sections using a polarizing microscope. This technique requires cell block preparation of aspirated material. Unfortunately, patients presenting in early stage of amyloidosis have minimal amounts of amyloid which greatly reduces the sensitivity of Congo red stained cell block sections of fat pad aspirates. Therefore, ultrastructural evaluation of fat pad aspirates by electron microscopy should be utilized, given its increased sensitivity for amyloid detection. This article demonstrates a simple and reproducible procedure for performing anterior fat pad aspiration for the detection of amyloid utilizing both Congo red staining of cell block sections and electron microscopy for ultrastructural identification.

Fat pad aspiration is a preferred, minimally invasive, and low cost approach as compared to other methods to detect amyloid for diagnosis of systemic amyloidosis. This video article demonstrates a procedural outline for performing fat pad aspiration with appropriate processing of the specimen for the optimal diagnostic outcome.

Exécution et traitement des FNA coussinet adipeux antérieure de l&#39;amyloïde

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

Recherche

Médecine

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

Biomarqueurs dans un modèle animal pour Révéler Corrélats neuronaux, hématologiques et du comportement de stress post-traumatique

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability in industrialized countries. Replacement of degenerated photoreceptors by cell transplantation represents a possible treatment option in future clinical applications. Indeed, recent preclinical studies demonstrated that immature photoreceptors, isolated from the neonatal mouse retina at postnatal day 4, have the potential to integrate into the adult mouse retina following subretinal transplantation. Donor cells generated a mature photoreceptor morphology including inner and outer segments, a round cell body located at the outer nuclear layer, and synaptic terminals in close proximity to endogenous bipolar cells. Indeed, recent reports demonstrated that donor photoreceptors functionally integrate into the neural circuitry of host mice. For a future clinical application of such cell replacement approach, purified suspensions of the cells of choice have to be generated and placed at the correct position for proper integration into the eye. For the enrichment of photoreceptor precursors, sorting should be based on specific cell surface antigens to avoid genetic reporter modification of donor cells. Here we show magnetic-associated cell sorting (MACS) - enrichment of transplantable rod photoreceptor precursors isolated from the neonatal retina of photoreceptor-specific reporter mice based on the cell surface marker CD73. Incubation with anti-CD73 antibodies followed by micro-bead conjugated secondary antibodies allowed the enrichment of rod photoreceptor precursors by MACS to approximately 90%. In comparison to flow cytometry, MACS has the advantage that it can be easier applied to GMP standards and that high amounts of cells can be sorted in relative short time periods. Injection of enriched cell suspensions into the subretinal space of adult wild-type mice resulted in a 3-fold higher integration rate compared to unsorted cell suspensions.

Cell transplantation represents a strategy for the treatment of retinal degeneration characterized by photoreceptor loss. Here we describe a method for enrichment of transplantable photoreceptors and their subretinal grafting into adult mice.

Transplantation sous-rétinienne de cellules précurseurs de photorécepteurs purifiées par MACS dans la rétine adulte de la souris

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. Clinically, more than 50% of SCI affect the cervical spine1. As a consequence of the primary injury, a cascade of secondary mechanisms including inflammation, apoptosis, and demyelination occur finally leading to tissue scarring and development of intramedullary cavities2,3. Both represent physical and chemical barriers to cell transplantation, integration, and regeneration. Therefore, shaping the inhibitory environment and bridging cavities to create a supportive milieu for cell transplantation and regeneration is a promising therapeutic target4. Here, a contusion/compression model of cervical SCI using an aneurysm clip is described. This model is more clinically relevant than other experimental models, since complete transection or ruptures of the cord are rare. Also in comparison to the weight drop model, which in particular damage the dorsum columns, circumferential compression of the spinal cord appears advantageous. Clip closing force and duration can be adjusted to achieve different injury severity. A ring spring facilitates precise calibration and constancy of clip force. Under physiological conditions, synthetic self-assembling peptides (SAP) self-assemble into nanofibers and thus, are appealing for application in SCI5. They can be injected directly into the lesion minimizing damage to the cord. SAPs are biocompatible structures erecting scaffolds to bridge intramedullary cavities and thus, equip the damaged cord for regenerative treatments. K2(QL)6K2 (QL6) is a novel SAP introduced by Dong et al.6 In comparison to other peptides, QL6 self-assembles into &#946;-sheets at neutral pH6.14 days after SCI, after the acute stage, SAPs are injected into the center of the lesion and neural precursor cells (NPC) are injected into adjacent dorsal columns. In order to support cell survival, transplantation is combined with continuous subdural administration of growth factors by osmotic micro pumps for 7 days.

Treating cervical spinal cord injury with both self-assembling peptides (SAP) and neural precursor cells (NPC), together with growth factors, is a promising approach to promote regeneration and recovery. A contusion/compression aneurysm clip rat model of cervical SCI and combined treatment involving SAP injection and NPC transplantation is established.

Utilisation synergique des cellules neurales précurseurs et peptides d&#39;auto-assemblage dans la partie expérimentale moelle épinière cervicale blessures

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. ...

Assessment of Spontaneous Alternation, Novel Object Recognition and Limb Clasping in Transgenic Mouse Models of Amyloid-&#946; and Tau Neuropathology

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional motor behaviors in transgenic mouse models of &#946;-amyloidosis and tauopathy. The paradigm includes tests for spontaneous alternation in a Y-maze, novel object recognition, and limb clasping. These tests were selected because they: 1) interrogate function of cognitive or motor domains and the correlate neural circuitry relevant to the human disease state, 2) have clearly defined endpoints, 3) have easily implementable quality control checks, 4) can be run in a moderate throughput format, and 5) require little intervention by the investigator. These methods are designed for investigators looking to screen compounds for activity in short-term and working memory tasks, or functional motor behaviors associated with Alzheimer's disease mouse models. The methods described here use behavioral tests that engage a number of different brain regions including hippocampus and various cortical areas. Investigators that desire cognitive tests that specifically assess cognition mediated by a single brain region could use these techniques to supplement other behavioral tests.

Assessment of Spontaneous Alternation, Novel Object Recognition and Limb Clasping in Transgenic Mouse Models of Amyloid-&amp;#946; and Tau Neuropathology

Described here is a staged, behavioral screening approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional motor behaviors in transgenic mouse models of &#946;-amyloidosis and tauopathy. These methods are optimized to screen compounds for activity in short-term and working memory tasks.

Évaluation de l&#39;alternance spontanée, reconnaissance récente d&#39;objets et assemblage des membres dans les modèles de souris transgéniques de la neuropathologie amyloïde-β et tau

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional ...

Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or in buffer (washed platelets), by the use of one or a combination of agonists. The use of washed platelets separated from their plasma environment and in the absence of anticoagulants allows for studying intrinsic platelet properties. Among the large panel of agonists, arachidonic acid (AA), adenosine di-phosphate (ADP), thrombin and collagen are the most frequently used. The aggregation response is quantified by measuring the relative optical density (OD) over time of platelet suspension under continuous stirring. Platelets in homogeneous suspension limit the passage of light after the addition of an agonist, platelet shape change occurs producing a small transitory increase in OD. Following this initial activation step, platelet clots form gradually, allowing the passage of light through the suspension as a result of decreased OD. The aggregation process is ultimately expressed as a percentage, compared to the OD of platelet-poor plasma or buffer. Rigorous calibration is thus essential at the beginning of each experiment. As a general rule: calibration to 0% is set by measuring the OD of a non-stimulated platelet suspension while measuring the OD of the suspension medium containing no platelets represents a value of 100%. Platelet aggregation is generally visualized as a real-time aggregation curve. Turbidimetry is one of the most commonly used laboratory techniques for the investigation of platelet function and is considered as the historical gold standard and used for the development of new pharmaceutical agents aimed at inhibiting platelet aggregation. Here, we describe detailed protocols for 1) preparation of human washed platelets and 2) turbidimetric analysis of collagen-induced aggregation of human washed platelets pretreated with the food dye Brilliant Blue FCF that was recently identified as an inhibitor of Pannexin1 (Panx1) channels.

We describe a straightforward method for the isolation of washed platelets from human blood followed by agonist-induced platelet aggregation measurements by turbidimetry. As an example we apply this method for studying the aggregation response of human platelets to collagen after a pre-incubation with the Pannexin1 channel inhibitor Brilliant Blue FCF.

Turbidimétrie sur Human Washed: L&#39;effet Plaquettes du Pannexin1 inhibiteur bleu brillant FCF sur l&#39;agrégation induite par le collagène

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum (SR) serves as a Ca2+ reservoir for contraction, which reuptakes intracellular Ca2+ during relaxation. The SR Ca2+ reserve available for beats is determinate for cardiac contractibility, and the removal of intracellular Ca2+ is critical for cardiac diastolic function. Under some pathophysiological conditions, such as diabetes and heart failure, impaired calcium clearance and SR Ca2+ store in cardiomyocytes may be involved in the progress of cardiac dysfunction. Here, we describe a protocol to evaluate SRCa2+ reserve and diastolic Ca2+ removal. Briefly, a single cardiomyocyte was enzymatically isolated, and the intracellular Ca2+ fluorescence indicated by Fura-2 was recorded by a calcium imaging system. To employ caffeine for inducing total SR Ca2+ release, we preset an automatic perfusion switch program by interlinking the stimulation system and the perfusion system. Then, the mono-exponential curve fitting was used for analyzing decay time constants of calcium transients and caffeine-induced calcium pulses. Accordingly, the contribution of the SR Ca2+-ATPase (SERCA) and Na+-Ca2+ exchanger (NCX) to diastolic calcium removal was evaluated.

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Here, we describe a protocol to evaluate sarcoplasmic reticulum Ca2+ reserve and diastolic calcium removal function in cardiomyocytes by a calcium imaging system.

Évaluation de réticulum sarcoplasmique Calcium réserve et intracellulaires de Calcium diastolique enlèvement dans les Cardiomyocytes ventriculaires isolées

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

In Vivo Imagerie des souris journaliste Cx3cr1gfp/gfp avec domaine Spectral Optical Coherence Tomography et numérisation Laser ophtalmologique

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier integrity. However, their tissue-specific functions in the heart are not well understood. Moreover, there is currently no protocol utilizing readily accessible materials to isolate and purify pericytes of cardiac origin. Our protocol focuses on using the widely used mammalian model, the mouse, as our source of cells. Using the enzymatic digestion and mechanical dissociation of heart tissue, we obtained a crude cell mixture that was further purified by fluorescence activating cell sorting (FACS) by a plethora of markers. Because there is no single unequivocal marker for pericytes, we gated for cells that were CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Following purification, these primary cells were cultured and passaged multiple times without any changes in morphology and marker expression. With the ability to regularly obtain primary murine cardiac pericytes using our protocol, we hope to further understand the role of pericytes in cardiovascular physiology and their therapeutic potential.

We have optimized a protocol to isolate and purify murine cardiac pericytes for basic research and investigation of their biology and therapeutic potential.

Isolement et purification des périphytes cardiaques murines

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Isolement par ultracentrifugeuse de vésicules extracellulaires à partir d’ADSC humaines

Purification and Characterization of Extracellular Vesicles from Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research suggests that their regenerative function may be attributed to cell-cell contact and cell paracrine effects. The paracrine effect is an important way for cells to interact and transfer information over short distances, in which extracellular vesicles (EVs) play a functional role as carriers. There is significant potential for ADSC EVs in regenerative medicine. Multiple studies have reported on the effectiveness of these methods. Various methods for extracting and isolating EVs are currently described based on principles such as centrifugation, precipitation, molecular size, affinity, and microfluidics. Ultracentrifugation is regarded as the gold standard for isolating EVs. Nevertheless, a meticulous protocol to highlight precautions during ultracentrifugation is still absent. This study presents the methodology and crucial steps involved in ADSC culture, supernatant collection, and EV ultracentrifugation. However, even though ultracentrifugation is cost-effective and requires no further treatment, there are still some inevitable drawbacks, such as a low recovery rate and EV aggregation.

Pleins feux sur l’auteur : Normalisation et amélioration de l’extraction et de la purification des vésicules extracellulaires à partir d’ADSC humaines

This protocol describes all procedures, from culturing human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) and collecting supernatant to extracting extracellular vesicles (EVs) using ultracentrifugation.

Purification et caractérisation de vésicules extracellulaires à partir de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research ...