Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH (5T32GM008275-22) et une bourse de l&#39;American Heart Association prédoctoral (à EAS); une bourse de l&#39;interface chimie-biologie du NIH (2T32GM071339-06A1) (à MED) et des subventions de la NIH (1DP2OD002177-01 et NS067354-0110), Le Ellison Medical Foundation et la Fondation Bill et Melinda Gates Foundation (JS).

1. Expression de Hsp104 <ol><li> Le plasmide utilisé pour la purification dans E. coli, pPROEX-HTB-Hsp104, contient les Hsp104 ouvert cadre de lecture sous le contrôle du promoteur inductible TRC 26. Le plasmide produit Hsp104 avec un N-terminale Sa 6-tag qui peut être enlevée par clivage de la protéase TEV. Transformez pPROEX-HTB-Hsp104 en codon optimisé E. coli BL21-CodonPlus-RIL cellules (Stratagene, Agilent Technologies) en utilisant une procédure de transformation bactérienne typique (par exemple, conformément aux instructions du fabricant). Il est important d&#39;utiliser un codon optimisé E. coli souche parce Hsp104 a un biais de codons inhabituels. </li><li> Inoculer une culture 100mL 2xYT (Recette USB.: 16g / L de peptone de caséine, extrait de levure 10g / L, 5g / L de NaCl, pH 7,0) additionné de 100μg/mL ampicilline et chloramphénicol 34μg/mL avec transformants frais et poussent nuit à 37 ° C avec agitation à 200rpm. </li><li> Inoculer 10 ml de la culture de la nuit en 6 X 1L 2xYT avec 100μg/mL ampicilline et chloramphénicol dans des flacons 34μg/mL 2L. Agiter à 250rpm à 37 ° C jusqu&#39;à DO 600 = 0.4 à 0.6. Arrêter de trembler et de réduire la température à 15 ° C. Laisser les cellules de s&#39;équilibrer unagitated pendant 30min dans l&#39;incubateur jusqu&#39;à ce qu&#39;il atteigne 15 ° C. Une fois à 15 ° C est atteinte induire l&#39;expression de protéines par addition d&#39;IPTG à une concentration finale de 1 mM. Reprendre agitation à 250rpm nuit (12-16 heures). </li></ol> 2. La récolte des cellules et Lysis <ol><li> Récolte des cellules par centrifugation (dans un rotor prérefroidi) à 4000 rpm pendant 20min à 4 ° C (nous utilisons un Sorvall RC 3BP + centrifugeuse). Les étapes suivantes doivent être effectuées immédiatement, car l&#39;activité est diminuée Hsp104 lorsque E. coli cellules sont congelées. Par ailleurs, toutes les mesures ultérieures doivent être effectuées sur la glace ou à 4 ° C. </li><li> Culots cellulaires Remettre en suspension dans prechilled (sur glace) 10mL de tampon de lyse (40 mM HEPES-KOH pH 7,4, KCl 500mm, 20mm MgCl 2, 2,5% (p / v) de glycérol, 20 mM imidazole, 5 um pepstatine A, cocktail complet inhibiteur de la protéase (1 EDTA sans tablet/50mL), et 2mm β-mercaptoéthanol). </li><li> Lyse des cellules avec un français de presse (EmulsiFlex) homogénéisateur qui utilise un échangeur de chaleur immergé dans l&#39;eau glacée. Avant utilisation, s&#39;assurer que tous les amas cellulaires ont été solubilisés. Après équilibration homogénéisateur avec un tampon de lyse, deux passes à travers le cylindre à une pression de 15,000-18,000 psi est suffisante pour la lyse complète. Si une presse française n&#39;est pas disponible, l&#39;incubation avec le lysozyme suivie par sonication peut être utilisée (voir la discussion). Enregistrer un petit échantillon de cellules lysées pour l&#39;analyse SDS-PAGE (1 microlitre) (lysat dans la Fig. 2). </li><li> Enlevez les débris cellulaires par centrifugation à 16000 rpm pendant 20min à 4 ° C (nous utilisons un RC5C Sorvall centifuge +). Conservez surnageant pour l&#39;étape suivante et enregistrez un petit échantillon (1 microlitre) de surnageant pour analyse SDS-PAGE (Charge Ni dans la Fig. 2). </li></ol> 3. Purification Hsp104 <ol><li> Mélanger surnageant de l&#39;étape 2.4 avec 12 mL (2 ml Ni-Sépharose billes par 1L de cellules) de lisier de 50% de tampon de lyse équilibrée Ni-Sépharose perles (GE). </li><li> Rotation de l&#39;échantillon lentement pendant 3 heures à 4 ° C tel que Ni-Sépharose demeure flottante et mousse est minimisé. Temps d&#39;incubation plus courtes sont possibles, mais va diminuer le rendement. A 4 ° C en présence d&#39;inhibiteurs de protéase, peu de dégradation se produit, et un temps de 3 heures d&#39;incubation Ni-Sépharose ne diminue pas l&#39;activité du produit final. Recueillir Ni-Sépharose par centrifugation pendant 2 min à 4 ° C à 2000 rpm (Eppendorf 5810R centrifugeuse). Enregistrer un petit échantillon de surnageant pour analyse SDS-PAGE (1 microlitre) et jeter le reste (flux de NI, par (FT) dans la Fig. 2). </li><li> Laver les récupérer Ni-Sépharose avec 25 volumes de colonne de tampon de lavage (40 mM HEPES-KOH pH 7,4, 150 mM KCl, 20 mM MgCl 2, 2,5% (p / v) de glycérol, 20 mM imidazole, 2 mM β-mercaptoéthanol), 5 volumes de colonne de tampon de lavage avec du KCl 1M pour éliminer les contaminants liés électrostatiquement à Hsp104, et 25 volumes de colonne de tampon de lavage. Recueillir Ni-Sépharose après chaque lavage par centrifugation pendant 2 min à 4 ° C à 2000 rpm (Eppendorf 5810R centrifugeuse). Après chaque cycle de lavage et de centrifugation, éliminer le tampon par aspiration. </li><li> Pour éluer Hsp104, mélanger Ni-Sépharose avec 1mL de tampon d&#39;élution (40 mM HEPES-KOH pH 7,4, 150 mM KCl, 20 mM MgCl 2, 2,5% (p / v) glycérol, 350mm imidazole, 2 mM β-mercaptoéthanol) par 1ml Ni-Sepharose et rotation à 4 ° C pendant 20 minutes. La forte concentration d&#39;imidazole perturbe le Ni-Bead Ses six interaction. Retirer Ni-Sépharose avec colonnes de centrifugation vide 1,2 ml (Bio-Rad) par centrifugation pendant 2 min à 4 ° C à 2000 rpm (Eppendorf 5810R centrifugeuse). Enregistrer 1 microlitre d&#39;éluat pour analyse SDS-PAGE (éluat Ni dans la Fig. 2). Pour chaque litre de cellules, ~ 15 mg de Hsp104 est obtenue à cette étape. </li><li> Éluat échange de tampon dans la mémoire tampon Q (20 mM Tris-HCl pH 8, 0,5 mm d&#39;EDTA, 5mM MgCl 2, 50 mM NaCl) à l&#39;aide MWCO 30000 Amicon Ultra (Millipore) 15ml unités concentrateur centrifuge. Tout d&#39;abord, concentré de protéines à ~ 1,5 ml puis ajouter 14.5mL de tampon Q pour diluer la protéine de 10 fois. Répétez 3 fois pour l&#39;échange de tampon. L&#39;augmentation du pH et de faible teneur en sel assure que Hsp104 a une forte charge négative. </li><li> Purifier Hsp104 via chromatographie échangeuse d&#39;anions en utilisant un tampon Q équilibrée des ressources Q 6 mL colonne (GE). Avant l&#39;injection, la protéine est filtré à travers un faible liaison protéique Millex GP PES membrane 0.22μM filtre seringue (Millipore). Nous employons un débit de 1mL/min. Laver faiblement protéines de liaison avec 1 volume de colonne de tampon de 20% Q + (20 mM Tris-HCl pH 8, 0,5 mm d&#39;EDTA, 5mM MgCl 2, 1 M de NaCl). Eluer Hsp104 avec gradient linéaire (20% -50% de tampon Q +) plus de 5 volumes de colonne (Fig. 3). Collecter des fractions de 1ml. Hsp104 et la plupart des variantes typiquement éluer à ~ 400mm de NaCl (31mS/cm). Enregistrer des échantillons de fractions de pic (1 microlitre) pour analyse SDS-PAGE (Fig. 3, en médaillon). </li><li> Pour retirer son 6-tag, les protéines d&#39;échange en utilisant le concentrateur Amicon centrifuge décrit ci-dessus (voir étape 3.5) dans le tampon de clivage (20mM HEPES-KOH pH 7,4, KCl 140mm, et 10mm MgCl 2). Utilisez proTEV protéase (Promega) ou AcTEV protéase (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. Pour Hsp104, nous avons constaté que des ratios plus élevés de la VET de protéase: Hsp104 sont nécessaires pour un clivage complet. Nous utilisons un ratio de 1 unité de protéase par 12μg Hsp104. Décolleté doit être effectuée à 30 ° C pendant 2-4 heures, suivie d&#39;une incubation de 16 heures à 4 ° C. La concentration finale de Hsp104 devrait se situer entre 20 75μM monomère. Appauvrissent tout reste Hsp104 His6-marqués et la protéase TEV avec Ni-Sepharose (GE) en ajoutant Ni-Sépharose en excès à la quantité de Hsp104 dans la réaction de clivage (supposons perles peuvent se lier 15mg de protéines par ml de résine emballé). Retirer perles avec colonnes de centrifugation vide (Bio-Rad) par centrifugation pendant 2min à 2000 rpm à 4 ° C. Prélever des échantillons avant et après clivage (1 microlitre) pour analyse SDS-PAGE pour assurer le clivage, et l&#39;élimination des protéines non clivée (fig. 4). </li><li> Bourse dans le buffer d&#39;exclusion stérique (20mm HEPES-KOH pH 7,4, KCl 140mm, 10 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 1mM DTT), en utilisant MWCO 30000 Amicon Ultra (Millipore) tel que décrit dans l&#39;étape 3.5. </li><li> Purifier davantage Hsp104 via chromatographie d&#39;exclusion stérique. Utilisez Superose taille du tampon d&#39;exclusion équilibrée 6 ou colonne Superdex 200 (tous deux de GE) (fig. 5). Avant l&#39;injection, la protéine est filtré à travers un faible liaison protéique Millex GP PES membrane 0.22μM filtre seringue (Millipore). Pour moins de 10mg de protéines, de l&#39;10/300 colonnes de taille (24ml) peuvent être utilisés et les fractions de 0,5 ml sont collectées. Pour les échantillons de plus de 10mg, la colonne de taille 12/60 (120ml) devraient être utilisés et fractions de 1 ml sont collectées. Reportez-vous aux instructions du fabricant pour des débits et des volumes d&#39;échantillons d&#39;être chargés. Après purification, les fractions sont regroupées Hsp104 comme indiqué dans la Fig. 5 et concentrée dans les unités de Amicon concentrateur centrifuge (Millipore). Hsp104 est stocké comme décrit ci-dessous. En raison de la perte de matière à séparer Hsp104 produits de dégradation et de contaminants le rendement final de purifier pleine longueur Hsp104 est ~ 1-3mg par litre de commencer la culture. </li></ol> 4. Hsp104 Disaggregase activité <ol><li> Après purification, il est de bonne pratique pour évaluer l&#39;activité Hsp104 dans un essai de désagrégation. Généralement, nous employons un dosage de la luciférase réactivation 2 (fig. 6). Dans cet essai, Hsp104 en conjonction avec le système de chaperon Hsp70 (Hsp70 et HSP40) désagrège urée-dénaturé agrégats luciférase de luciole 2. Soluble luciférase catalyse l&#39;oxydation de la luciférine à oxyluciférine, une réaction qui libère la lumière. Par la luminescence de surveillance, la réactivation relative, et donc la désagrégation, de la luciférase peut être déterminée. Hsp104 doit être capable de collaborer avec la synergie de co-chaperon Hsp70 système. Le montant de la luminescence récupéré dépend de la Hsp70 exacte: paire HSP40 utilisé. Nous avons régulièrement recours Hsp72 et HSP40 (Assay Designs). Au minimum, actif Hsp104 devrait produire une augmentation de 5 fois dans la réactivation de la luciférase par rapport à la réactivation par Hsp72: HSP40 seul (Fig. 6). Hsp104 préparations qui ne parviennent pas à atteindre ce niveau d&#39;activité sont jetés. </li></ol> 5. Hsp104 stockage <ol><li> Pour stockage à court terme, Hsp104 peuvent être conservés à 4 ° C dans d&#39;exclusion de taille de mémoire tampon. Cependant, l&#39;activité va diminuer après 2-3 jours à 4 ° C et fortement après 1 semaine à 4 ° C. Pour les essais de désagrégation nous recommandons que Hsp104 devrait être utilisé dès que possible après la purification. Idéalement, Hsp104 doit être utilisée immédiatement pour des essais de désagrégation amyloïde. </li><li> Si la protéine doit être stocké à long terme, Hsp104 est échangé dans un tampon de stockage (20mm HEPES-KOH pH 7,4, KCl 140mm, 10 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 1 mM de DTT, glycérol 10% (p / v)). Aliquotes 100 ul sont encliquetage congelés dans l&#39;azote liquide et stockés à -80 ° C. Cycles gel-dégel réduire drastiquement l&#39;activité Hsp104et devrait être évitée. Nous recommandons lentement dégel Hsp104 sur la glace. -Amyloïde disaggregase activité diminuer fortement après un mois à -80 ° C. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs et chiffres: <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Hsp104 est un disaggregase bifonctionnels. Désagrégation des agrégats désordonnés (indiqué sur la gauche) nécessite la coopération du système de chaperon Hsp70 (Hsp70 et HSP40) 2. Remodèle Hsp104 commandé agrégats amyloïdes (montré à droite) sans l&#39;aide de Hsp70 et HSP40 in vitro, mais Hsp70 et HSP40 peut améliorer Hsp104 activité contre 26,28 amyloïde. Pour les deux types de structures globales, Hsp104 couples ATP hydrolyse à la translocation du substrat à travers son canal central pour promouvoir la désagrégation. Boucles interstitielles Tyrosine portant engager et substrat de navette à travers le canal central 49-52. <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Analyse SDS-PAGE de Ni-sépharose étape de purification par affinité. Lysat, Charge Ni, Ni FT et des échantillons ont été fractionnés éluat Ni par SDS-PAGE en utilisant un 4-20% Tris-HCl 1.0mm Critère gel (Bio-Rad) et colorées au bleu de Coomassie . Notez que tous les Hsp104 est capable de se lier à la Ni-sépharose. Large gamme de marqueurs de poids moléculaire (Bio-Rad) sont représentés (voie de gauche). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Resource Q purification de Ni-sépharose éluat. Trace bleue représente l&#39;absorbance à 280nm et oligo-vert représente Tampon% Q + (maximum à 50%). Le premier pic, qui élue à 20% Q + contient des impuretés, des produits de dégradation et mal plié Hsp104. Le deuxième pic et les grandes contient correctement repliée et active Hsp104. Le débit était de 1mL/min. Dégradé de 20-50% Q + est de 30 minutes ou 5 volumes de colonne. En médaillon: fractions de pic sont résolus par analyse SDS-PAGE en utilisant un 40-20% de Tris-HCl 1.0mm Critère gel (Bio-Rad) et colorées au bleu de Coomassie. Large gamme de marqueurs de poids moléculaire (Bio-Rad) sont affichés (à gauche). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. Analyse SDS-PAGE de l&#39;étape proTEV clivage de la protéase. Sa 6-Hsp104 de Resource Q de purification a été traité avec de la protéase proTEV pendant 4 heures à 30 ° C puis 16 heures à 4 ° C. Les échantillons ont été fractionnés par l&#39;SDS-PAGE en utilisant un 40-20% de Tris-HCl 1.0mm Critère gel (Bio-Rad) et colorées au bleu de Coomassie. Notez que proTEV clivé Hsp104 migre plus rapidement. VET protéase et non clivée Hsp104 ont été épuisées avec Ni-Sépharose comme décrit dans l&#39;étape 3.7. Large gamme de marqueurs de poids moléculaire (Bio-Rad) sont affichés (à gauche). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig5.jpg" alt="Figure 5"/> Figure 5. Taille-exclusion purification de Hsp104. Clivées Hsp104 a encore été purifié par une colonne de Superose 6 filtration sur gel (10/300, GE). = Débit 0.4ml/min. Le sommet entre les lignes en pointillés représente fractions regroupées. En médaillon: fractions de pic sont résolus par analyse SDS-PAGE en utilisant un 40-20% de Tris-HCl 1.0mm Critère gel (Bio-Rad) et colorées au bleu de Coomassie. Large gamme de marqueurs de poids moléculaire (Bio-Rad) sont affichés (à gauche). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig6.jpg" alt="Figure 6"/> Figure 6. Dosage de la réactivation luciférase. Dénaturé agrégats luciférase de luciole (50 nM) ont été incubées soit avec Hsp72 et HSP40 (1 uM) (tous deux de Assay Designs), Hsp104 (6 microns monomère) ou Hsp104, Hsp72 et HSP40 pour 90min à 25 ° C. Luciférase dénaturé n&#39;est pleinement réactivé, en présence de deux Hsp104 et Hsp40/Hsp72. Luminescence récupéré est mesuré sur une plaque de Infini M1000 (Tecan) lecteur. Les valeurs représentent la moyenne ± SEM (n = 3).

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Chronologie: Pour Hsp104 activité maximale, nous recommandons que le schéma de purification entière soit achevée aussi rapidement que possible. Cependant, le nombre d&#39;étapes de purification rend un horaire exigeant qui ne peuvent pas toujours être pratique. Si les étapes de purification sont effectués aussi rapidement que possible, le temps de la fin de l&#39;expression du jour au lendemain grâce à l&#39;2-4 heures d&#39;incubation à 30 ° C avec TEV protéase est d&#39;environ 9-11 heures. Un lieu...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> BL21-CodonPlus-RIL cellules compétentes </td><td> Stratagene, Agilent Technologies </td><td> 230255 </td></tr><tr><td> 2xYT bouillon </td><td> USB </td><td> 75864 </td></tr><tr><td> Complète, mini, de l&#39;EDTA-libres comprimés inhibiteur de protéase </td><td> Roche </td><td> 1836170 </td></tr><tr><td> Pepstatine A </td><td> Sigma </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> Ni-Sépharose 6 Fast Flow </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5318-02 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 centrifuges unités de filtration (MWCO 30000) </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> Resource Q - colonne de 6ml </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1179-01 </td></tr><tr><td> proTEV protéase </td><td> Promega </td><td> V6052 </td></tr><tr><td> AcTEV protéase </td><td> Invitrogen </td><td> 12575015 </td></tr><tr><td> Superose 6 10/300 GL </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5172-01 </td></tr><tr><td> HSP40 </td><td> Assay Designs </td><td> PSP-400 </td></tr><tr><td> Hsp72 </td><td> Assay Designs </td><td> ADI-NSP-555 </td></tr></tbody></table>

purification of hsp104, a protein disaggregase

Hsp104 est un hexamère AAA + 1 à partir de protéines de la levure, qui couple l&#39;hydrolyse d&#39;ATP à la protéine de désagrégation 2-10 (Fig. 1). Cette activité confère deux grands avantages sélectifs. Tout d&#39;abord, la renaturation des agrégats désordonnés par Hsp104 permet la survie de la levure après diverses protéines-repliement souligne, notamment 3,5,11,12 choc thermique. Deuxièmement, le remodelage des fibrilles amyloïdes bêta par la Croix-Hsp104 permet d&#39;exploiter la levure prions myriades (amyloïdes infectieux) comme un réservoir de bénéfique et héritable variation phénotypique 13-22. Remarquablement, Hsp104 remodèle directement oligomères preamyloid et fibrilles amyloïdes, y compris ceux comprenant des protéines prion de levure et de SUP35 URE2 23-30. Cette fonctionnalité amyloïde remodelage est une facette spécialisée de la levure Hsp104. Le E. orthologue coli, CLPB, ne parvient pas à transformer ou oligomères preamyloid fibrilles amyloïdes 26,31,32. Orthologues Hsp104 se trouvent dans tous les règnes de la vie, sauf, perplexingly, les animaux. En effet, si les cellules animales possèdent aucun système enzymatique que la désagrégation de protéines aux couples de renaturation (plutôt que de la dégradation) demeure inconnue 33-35. Ainsi, nous et d&#39;autres ont proposé que Hsp104 pourrait être développé comme un agent thérapeutique pour diverses maladies neurodégénératives liées au mauvais repliement de protéines spécifiques dans les oligomères preamyloid toxiques et fibrilles amyloïdes 4,7,23,36-38. Il n&#39;y a pas de traitements qui ciblent directement les espèces agrégées associées à ces maladies. Pourtant, Hsp104 dissout oligomères toxiques et fibrilles amyloïdes composé d&#39;alpha-synucléine, qui sont liés à la maladie de Parkinson 23 ainsi que les formes de PrP amyloïde 39. Surtout, Hsp104 réduit l&#39;agrégation des protéines et améliore la neurodégénérescence dans des modèles rongeurs de la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington 23 38. Idéalement, pour optimiser le traitement et de minimiser les effets secondaires, Hsp104 serait conçu et potentialisé de façon sélective remodeler agrégats spécifiques au centre de la maladie en question 4,7. Cependant, la compréhension limitée structurelles et mécanistiques sur la manière dont Hsp104 désagrège un tel répertoire varié de structures agrégées et les protéines non liées frustre ces efforts 30,40-42. Pour comprendre la structure et le mécanisme de Hsp104, il est essentiel d&#39;étudier la protéine pure et reconstituer son activité disaggregase avec des composants minimes. Hsp104 est une protéine 102kDa avec un pI de 5,3 ~, qui hexamerizes, en présence de l&#39;ADP ou l&#39;ATP, ou à des concentrations élevées de protéines en l&#39;absence de 43-46 nucléotides. Ici, nous décrivons un protocole optimisé pour la purification de très actif, stable Hsp104 de E. coli. L&#39;utilisation de E. coli permet simplifiée production à grande échelle et à notre méthode peut être effectuée rapidement et de manière fiable pour de nombreuses variantes Hsp104. Notre protocole augmente Hsp104 pureté et simplifie son 6-tag retrait par rapport à un procédé de purification préalable de E. coli 47. Par ailleurs, notre protocole est plus facile et pratique de deux protocoles les plus récents 26,48.

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Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Ici, nous décrivons un protocole pour la purification de la très active Hsp104, un AAA + hexamérique protéines de la levure, qui couple l&#39;hydrolyse d&#39;ATP à la désagrégation des protéines. Ce schéma exploite une construction His6-marqués pour la purification d&#39;affinité à partir<em&gt; E. coli</em&gt; Suivie par chromatographie échangeuse d&#39;anions, His6-tag retrait avec la protéase TEV, et chromatographie d&#39;exclusion stérique.

Purification de Hsp104, une protéine Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

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Research

JoVE Journal

Biology

17.3K vues.  University of Pennsylvania. Ici, nous décrivons un protocole pour la purification de la très active Hsp104, un AAA + hexamérique protéines de la levure, qui couple l'hydrolyse d'ATP à la désagrégation des protéines. Ce schéma exploite une construction His6-marqués pour la purification d'affinité à partir E. coli Suivie par chromatographie échangeuse d'anions, His6-tag retrait avec la protéase TEV, et chromatographie d'exclusion stérique.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Recherche

Biologie

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification de la M. magneticum Strain AMB-1 Protein magnétosome Associated MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated anti-cancer drugs or antibiotics, is a current serious problem in public health. This multidrug resistance is largely due to energy-dependent drug efflux pumps. The pumps expel anti-cancer drugs or antibiotics into the external medium, lowering their intracellular concentration below a toxic threshold. We are studying multidrug resistance in Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic bacterial pathogen that causes infections in patients with many types of injuries or illness, for example, burns or cystic fibrosis, and also in immuno-compromised cancer, dialysis, and transplantation patients. The major MDR efflux pumps in P. aeruginosa are tripartite complexes comprised of an inner membrane proton-drug antiporter (RND), an outer membrane channel (OMF), and a periplasmic linker protein (MFP) 1-8. The RND and OMF proteins are transmembrane proteins. Transmembrane proteins make up more than 30% of all proteins and are 65% of current drug targets. The hydrophobic transmembrane domains make the proteins insoluble in aqueous buffer. Before a transmembrane protein can be purified, it is necessary to find buffer conditions containing a mild detergent that enable the protein to be solubilized as a protein detergent complex (PDC) 9-11. In this example, we use an RND protein, the P. aeruginosa MexB transmembrane transporter, to demonstrate how to express a recombinant form of a transmembrane protein, solubilize it using detergents, and then purify the protein detergent complexes. This general method can be applied to the expression, purification, and solubilization of many other recombinantly expressed membrane proteins. The protein detergent complexes can later be used for biochemical or biophysical characterization including X-ray crystal structure determination or crosslinking studies.

In this protocol we demonstrate the expression, solubilization, and purification of a recombinantly expressed membrane protein, MexB, as a soluble protein detergent complex. MexB is a multidrug resistance membrane transporter from the opportunistic bacterial pathogen Pseudomonas aeruginosa.

Expression, Solubilisation détergent, et purification d&#39;un transporteur membranaire, la protéine MexB multirésistance

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction chromatography (HIC) commonly requires experimental determination (referred to as screening or "scouting") in order to select the most suitable chromatographic medium for purifying a given protein 1. The method presented here describes an automated approach to scouting for an optimal HIC media to be used in protein purification.
HIC separates proteins and other biomolecules from a crude lysate based on differences in hydrophobicity. Similar to affinity chromatography (AC) and ion exchange chromatography (IEX), HIC is capable of concentrating the protein of interest as it progresses through the chromatographic process. Proteins best suited for purification by HIC include those with hydrophobic surface regions and able to withstand exposure to salt concentrations in excess of 2 M ammonium sulfate ((NH4)2SO4). HIC is often chosen as a purification method for proteins lacking an affinity tag, and thus unsuitable for AC, and when IEX fails to provide adequate purification. Hydrophobic moieties on the protein surface temporarily bind to a nonpolar ligand coupled to an inert, immobile matrix. The interaction between protein and ligand are highly dependent on the salt concentration of the buffer flowing through the chromatography column, with high ionic concentrations strengthening the protein-ligand interaction and making the protein immobile (i.e. bound inside the column) 2. As salt concentrations decrease, the protein-ligand interaction dissipates, the protein again becomes mobile and elutes from the column. Several HIC media are commercially available in pre-packed columns, each containing one of several hydrophobic ligands (e.g. S-butyl, butyl, octyl, and phenyl) cross-linked at varying densities to agarose beads of a specific diameter 3. Automated column scouting allows for an efficient approach for determining which HIC media should be employed for future, more exhaustive optimization experiments and protein purification runs 4.
The specific protein being purified here is recombinant green fluorescent protein (GFP); however, the approach may be adapted for purifying other proteins with one or more hydrophobic surface regions. GFP serves as a useful model protein, due to its stability, unique light absorbance peak at 397 nm, and fluorescence when exposed to UV light 5. Bacterial lysate containing wild type GFP was prepared in a high-salt buffer, loaded into a Bio-Rad DuoFlow medium pressure liquid chromatography system, and adsorbed to HiTrap HIC columns containing different HIC media. The protein was eluted from the columns and analyzed by in-line and post-run detection methods. Buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection increased the functionality of the system and reproducibility of the experimental approach.

An automated method for identifying suitable hydrophobic interaction chromatography (HIC) media to be used in the process of protein purification is presented. The method utilizes a medium-pressure liquid chromatography system including automated buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection.

Automatisé d&#39;interaction hydrophobe Chromatographie sur colonne de sélection pour l&#39;utilisation dans la purification des protéines

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

Purification chromatographique des ribosomes de levure hautement active

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Protein Purification Orthogonal Animé par une étiquette d&#39;affinité bispécifiques petits

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identification des partenaires protéine interagissant Utilisation Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases Alzheimer's disease (A&beta;, tau), Parkinson's Disease (&alpha;-synuclein), Huntington's disease (polyglutamine, huntingtin), and others. Protein aggregation is thought to occur due to disturbed proteostasis, i.e. the imbalance between the arising and degradation of misfolded proteins. Of note, the same proteins are found aggregated in sporadic forms of these diseases that are mutant in rare variants of familial forms.
Schizophrenia is a chronic progressive brain condition that in many cases goes along with a permanent and irreversible cognitive deficit. In a candidate gene approach, we investigated whether Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), a gene cloned in a Scottish family with linkage to chronic mental disease1, 2, could be found as insoluble aggregates in the brain of sporadic cases of schizophrenia3. Using the SMRI CC, we identified in approximately 20 % of cases with CMD but not normal controls or patients with neurodegenerative diseases sarkosyl-insoluble DISC1 immunoreactivity after biochemical fractionation. Subsequent studies in vitro revealed that the aggregation propensity of DISC1 was influenced by disease-associated polymorphism S704C4, and that DISC1 aggresomes generated in vitro were cell-invasive5, similar to what had been shown for A&beta;6, tau7-9, &alpha;-synuclein10, polyglutamine11, or SOD1 aggregates12. These findings prompted us to propose that at least a subset of cases with CMD, those with aggregated DISC1 might be protein conformational disorders.
 Here we describe how we generate DISC1 aggresomes in mammalian cells, purify them on a sucrose gradient and use them for cell-invasiveness studies. Similarly, we describe how we generate an exclusively multimeric C-terminal DISC1 fragment, label and purify it for cell invasiveness studies. Using the recombinant multimers of DISC1 we achieve similar cell invasiveness as for a similarly labeled synthetic &alpha;-synuclein fragment. We also show that this fragment is taken up in vivo when stereotactically injected into the brain of recipient animals.

The generation, purification and cell invasion of intracellular, cytoplasmic full length DISC1 protein aggresomes from cell cultures and of a labeled, multimeric recombinant DISC1 protein fragment in E. coli are described. Cell invasiveness is shown for recipient cells in cell culture and for neurons in vivo after stereotactical brain inoculation.

Production, de conditionnement, et la caractérisation des cellules invasives Espèces protéine DISC1

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification méthode sans la détermination de l&#39;affinité de liaison par thermophorèse Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identifier les interactions protéine-protéine dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Têtes de Tandem Affinity Purification adultes (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...