Ce protocole fournit un système d’affichage bactérien très efficace pour l’isolement des nouvelles variantes de BirA qui permet une biotinylation spécifique des protéines indigènes. Le principal avantage de la technique est qu’elle sélectionne des variantes BirA en utilisant la sélection de streptavidine à haute affinité. Cela garantit que les clones inactifs sont supprimés, créant ainsi un processus de sélection très efficace.
Pour commencer, dans un éditeur plasmide, concevoir l’amorce avant pour inclure les 30 derniers nucléotides du complément inverse de la séquence de codage peptidique, et ajouter la séquence de nucléotide liant plasmide à son extrémité à cinq premiers. Concevoir l’amorce inverse pour inclure les 30 premiers nucléotides du complément inverse de la séquence de codage peptidique, et ajouter la séquence de nucléotide liant plasmide à son extrémité à cinq premiers. Ensuite, pour configurer une réaction PCR de 20 microlitres, ajoutez les réacolteurs dans un tube PCR à paroi mince.
Transférez le tube à un cycleur thermique et effectuez pcr selon le manuscrit. Ensuite, exécutez cinq microlitres de la réaction PCR sur un gel agarose de 1% pour confirmer l’amplification d’un produit PCR de six kilobases, et procéder selon le manuscrit. Maintenant, pour synthétiser les mégaprimeurs mutants avec bira hexahistidine avant et arrière amorces, dans un tube PCR, ajouter un nanogramme de pBAD-BirA-eCPX avec la séquence peptidique cible préparée comme un modèle.
Configurer 35 cycles PCR avec une température d’annealing de 60 degrés Celsius selon les instructions du fabricant. Ensuite, exécutez cinq microlitres de la réaction d’amplification sur un gel d’agarose de 1% pour vérifier l’amplification d’un produit PCR de paire de 984-base. Purifier le produit PCR des 45 microlitres restants de la réaction d’amplification à l’aide d’un kit commercial de purification pcr, et utiliser un spectrophotomètre pour quantifier le rendement en ADN.
Dans un tube PCR à parois minces, ajouter les réhésifs dans les mégaprimeurs mutants préparés pour préparer la réaction de l’échantillon. Transférez le mélange de réaction à un cycleur thermique et exécutez le PCR selon le manuscrit. Conserver la réaction d’amplification à quatre degrés Celsius ou sur la glace.
Ensuite, ajoutez un microlitre d’enzyme de restriction Dpn1 directement à la réaction d’amplification, et mélangez doucement. Faites tourner le mélange de réaction et incubez pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Après deux heures, transformer les cellules E.coli compétentes T7 Express lysY/Iq dans un tube avec deux microlitres de la réaction Dpn1.
Tout d’abord, inoculer 100 millilitres de LB contenant 1% de glucose et 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline avec un millilitre de bibliothèque BirA, et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec secousses à 200 rpm. Puis, inoculer cinq millilitres de LB contenant 1% de glucose et 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline avec 100 microlitres de la culture nocturne. Incuber pendant deux heures et 30 minutes ou jusqu’à ce que la culture atteigne un OD600 d’environ 0,5.
Ensuite, induisez l’expression eCPX et BirA avec 0,2% de poids par volume L-arabinose, IPTG de 100 micromolaires et biotine de 100 micromolaires. Secouez la culture à 200 rpm pendant une heure à 37 degrés Celsius. Centrifuger la culture pendant 10 minutes à 5000 fois g, et enlever le supernatant.
Resuspendez les cellules en un millilitre de PBS glacé, et centrifugeuse à 5000 fois g pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et réutilisez les cellules dans 400 microlitres de PBS glacé et stockez les cellules sur la glace. Ensuite, transférez 10 microlitres des cellules résuspendues dans un tube de 1,5 millilitre étiqueté entrée.
Conserver sur la glace. Ensuite, lavez 20 microlitres de perles magnétiques streptavidin dans un millilitre de PBS glacé dans un tube, et placez le tube dans un séparateur de particules magnétiques benchtop pendant deux minutes, et retirez soigneusement le supernatant. Resuspendez les perles magnétiques streptavidin dans 20 microlitres de PBS glacé, et transférez la solution de perle aux 390 microlitres préparés précédents des cellules résuspendues.
Mélanger en pipetting doucement. Puis, incuber pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Placez une colonne avec des sphères ferrrommagnétiques dans un séparateur de particules magnétiques, et lavez-la avec cinq millilitres de PBS glacé.
Transférer les cellules et les perles magnétiques de streptavidine du tube dans la colonne fixée dans le séparateur. Une fois que le réservoir de colonne est vide, lavez la colonne avec un volume total de cinq millilitres de PBS glacé à 500 microlitres à chaque fois. Après cela, retirez la colonne du séparateur et placez-la dans un tube de 1,5 millilitre.
Pipette un millilitre de PBS glacé sur la colonne, et utiliser le piston pour élucider les cellules étiquetées magnétiquement. Ensuite, placez le tube de 1,5 millilitre dans un séparateur de dessus de banc et lavez la cellule étiquetée magnétiquement avec un millilitre de PBS glacé. Resuspendez doucement les cellules étiquetées magnétiquement dans un millilitre du PBS glacé.
Transférer 10 microlitres de la resuspension dans un tube de 1,5 millilitre étiqueté sortie. Inoculer 100 millilitres de LB contenant 1% de glucose et 100 microgrammes par ampicilline millilitre avec les cellules étiquetées magnétiquement, et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec secousses à 200 rpm. Le lendemain, combinez 10 millilitres de la culture nocturne en LB avec du glycérol jusqu’à une concentration finale de 15 % et stockez à moins 80 degrés Celsius pour faire des stocks de congélateur.
Utilisez 100 microlitres de la culture de nuit pour la prochaine ronde de sélection. Maintenant, ajoutez 990 microlitres de PBS glacé aux échantillons d’entrée et de sortie, et étiquetez les tubes entrée 10 à moins deux et sortie 10 à moins deux, respectivement. Effectuer 10 dilutions périodiques des deux échantillons dans du PBS glacé jusqu’à ce qu’une dilution finale de 10 à moins 10 soit atteinte dans l’échantillon d’entrée et de 10 à moins quatre dans l’échantillon de sortie.
Plaque 100 microlitres d’échantillons de l’entrée 10 à la moins six, entrée 10 à moins huit, entrée 10 à moins 10, sortie 10 à moins deux, sortie 10 à moins trois, et sortie 10 à moins quatre sur les plaques individuelles LB-ampicilline, et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le matin, comptez le nombre de colonies sur les plaques avec des colonies clairement séparées. Multipliez le nombre de colonies avec le facteur de dilution pour obtenir le nombre de concentrations bactériennes par 100 microlitres.
Dans ce protocole, après génération d’une bibliothèque mutée aléatoirement des variantes de BirA, l’expression de BirA et d’eCPX-AP a été induite. Des bactéries ont été incubées avec le réagent d’affinité, des bactéries non liées ont été jetées, et des bactéries choisies ont été amplifiées. La tache occidentale de bactéries exprimant pBAD-BirA-eCPX-AP a produit une bande streptavidine-réaction de 22 kilodalton compatible avec le poids moléculaire de l’eCPX dans les cultures non induites et induites.
Cependant, ils n’étaient pas présents dans bira hexahistidine. La biotinylation de surface forte dans les bactéries exprimant eCPX-AP a causé l’agrégation sur l’addition des perles magnétiques de streptavidine et la formation d’une pastille au fond du tube, qui n’a pas été observée avec eCPX avec la lysine aux bactéries d’expression de mutation d’alanine. L’analyse du précipité du retrait de streptavidin a montré un dégagement clair de 22 kilodalton streptavidin-réaction et bande anti-hexahistidine dans les échantillons des cultures d’eCPX-AP mais pas eCPX-AP avec la lysine aux cultures de mutation d’alanine.
De même, le nombre de bactéries liées aux perles de streptavidine était significativement plus élevé dans l’eCPX-AP que la lysine eCPX-AP aux cultures de mutation d’alanine. L’étape la plus importante est un lavage rigoureux des bactéries liées à la streptavidine. Un lavage rigoureux garantit que seules les bactéries avec de la biotine affichée en surface sont sélectionnées.
Une fois qu’un enrichissement clair des bactéries est observé, les clones isolés peuvent être mutés davantage et ainsi développer des variantes bira très actives qui permettent une biotinylation spécifique des protéines indigènes.
