Nous remercions Francisco Candal, CDC Technology Transfer Office, Atlanta en Géorgie pour la HBEC-5i cellules. Ce travail a été financé par le Wellcome Trust (4 ans bourse d&#39;études de doctorat à la CA et Senior Fellowship en sciences biomédicales de base aux JAR, numéro de la subvention 084 226).

Les recommandations générales Microvasculaires humaines du cerveau des cellules endothéliales (HBEC-5i) la culture a été précédemment décrit en 6, 8. P. falciparum ont été cultivées comme dans 9. Les deux HBEC-5i et P. falciparum cultures parasitaires doivent être conservés dans des conditions stériles en tout temps. Tous les réactifs doivent être pré-chauffé à 37 ° C. Nous vous recommandons de consulter régulièrement pour contamination par des mycoplasmes par PCR 10 (Minevera Biolabs, les instructions du fabricant de). Le protocole est résumé dans la figure 1. 1. Endothéliales de la culture cellulaire de routine <ol><li> Préparer les réactifs nécessaires. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Moyen de se préparer </td><td> Réactifs </td><td> Quantité </td></tr><tr><td> «Incomplète DMEM&quot; </td><td> DMEM-F12 de Ham </td><td> 500ml </td></tr><tr><td> &amp;nbsp; </td><td> L-glutamine 200 mM </td><td> 5ml </td></tr><tr><td></td><td> Pénicilline / streptomycine 100X </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td></td><td> NaOH 1M </td><td> 1,3 ml (ajuster le pH à 7,4) </td></tr><tr><td> &quot;DMEM complet&quot; </td><td> «Incomplète DMEM&quot; </td><td> 450ml </td></tr><tr><td></td><td> Fœtale sérum bovin inactivé à la chaleur </td><td> 50ml </td></tr><tr><td></td><td> Endothéliale supplément de croissance cellulaire </td><td> 5 ml </td></tr></tbody></table> <ol start="2"><li> Culture HBEC-5i dans un ventilé 25cm 2 flacon avec 10ml milieu DMEM complet dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Passage des cellules quand elles deviennent confluentes. Enlevez l&#39;ancien milieu par aspiration et laver deux fois avec du milieu DMEM incomplet ou de culture de tissus de qualité PBS (Ca 2 + et Mg 2 + libre) de pré-chauffé à 37 ° C. </li><li> Ajouter 1ml de pré-chauffé EssayezPSIN-EDTA (0,025% de trypsine, 0.5mm EDTA), tourbillon de couvrir la totalité du flacon et incuber pendant ~ 2 min à 37 ° C. </li><li> Vérifiez sous microscope inversé qu&#39;au moins 90% des cellules ont été détachées. Si nécessaire, doucement frapper le fond du flacon pour déloger les cellules adhérentes. Ajouter 10 ml de milieu DMEM complet de bloquer les cellules de la trypsine et transférer dans un tube 15ml conique. Centrifuger pendant 4 min à 300 g à température ambiante (RT). </li><li> Jeter le surnageant et remettre le culot avec 10 ml de milieu DMEM complet. Pipeter la solution de haut en bas pour bien remettre les cellules. </li><li> Ajouter 1 ou 2 ml de la suspension cellulaire dans un flacon de culture et d&#39;ajouter de nouveaux 8ml de milieu frais pour maintenir la culture. Évaluer la croissance de la culture tous les jours sous un microscope inversé et changement de milieu tous les 2 ou 3 jours avant qu&#39;il devienne jaune. </li></ol> 2. Préparation des cellules endothéliales pour une sélection <ol><li> Deux jours avant le jour de la sélectio<html> n, ajoutez la fibronectine dilué dans du PBS stérile (2 pg / cm 2) dans un (ou plusieurs) de 60 mm boîte de Petri. Incuber le plat pendant 5 à 20 min à 37 ° C, puis retirez la solution de fibronectine, qui peuvent être conservés à 4 ° C pendant un mois et réutilisés une fois. </li><li> Passage des cellules comme décrit dans les sections 1.3. à 1,5. En supposant que 100% des cellules confluentes ont été détachées et remises en suspension dans 10ml milieu DMEM complet (section 1.6., Resuspendre avec un volume équivalent de milieu si la confluence est plus faible, par exemple resuspendre avec 8ml si la confluence a été de 80%), ajouter 1,5 ml de la suspension cellules à la boîte de Pétri fibronectine revêtement et un autre 1,5 ml de milieu DMEM complet. </li><li> Placer le plat de Pétri ensemencés dans l&#39;incubateur. Note: Idéalement, la confluence se situera autour de 90% au moment de la sélection de deux jours plus tard. </li><li> Facultatif. Pour activer HBEC-5i, ajoutez le TNF (facteur de nécrose tumorale) des cytokines à une concentration finale de 50μg/ml 24 heures avant la sélection. </li></ol>e_title &quot;&gt; 3. Plasmodium falciparum culture de routine <ol><li> Préparer les réactifs nécessaires (voir tableau ci-dessous). Préparer des globules rouges (RBC) en séparant le sang entier (groupe O +) par passage à travers un filtre déleucocytation (voir «Méthodes de recherche sur le paludisme&quot; publication 11 pour la malaria parasites en culture générale). Laver deux fois par RBC par centrifugation à 400 g pendant 5 min et les remettre en suspension avec 10 ml de RPMI incomplète. Gardez lavés RBC à 4 ° C dans un milieu incomplet à l&#39;hématocrite de 50%. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Moyen de se préparer </td><td> Réactifs </td><td> Quantité </td></tr><tr><td> «Incomplète RPMI&quot; </td><td> RPMI 1640 (avec du bicarbonate) </td><td> 500ml </td></tr><tr><td></td><td> Hepes 1M </td><td> 12,5 ml </td></tr><tr><td></td><td> Glucose 20% </td><td> 5ml </td></tr><tr><td></td&gt; <td> L-glutamine 200 mM </td><td> 5ml </td></tr><tr><td></td><td> Gentamycine 50mg/ml </td><td> 250μl </td></tr><tr><td></td><td> NaOH 1M </td><td> 0,7 ml (ajuster le pH à 7,2) </td></tr><tr><td> «RPMI complet&quot; </td><td> «Incomplète RPMI&quot; </td><td> 450ml </td></tr><tr><td></td><td> Pooled humaine (non-immunes) de sérum </td><td> 50ml </td></tr></tbody></table> <ol start="2"><li> Culture P. falciparum infectés RBC avec un milieu RPMI complet à l&#39;hématocrite de 2% et incuber à 37 ° C avec 3% de CO 2, 1% O 2, et 96% de N 2. Faire frottis au Giemsa 11 quotidiens afin d&#39;évaluer le stade de développement des parasites (figure 2). </li><li> Régulièrement (environ une fois par semaine) de synchroniser la culture par le traitement de sorbitol 12. Le jour avant le test de sélection, afin d&#39;une culture au stade annulaire parasitémie 5% ou plus (idéalement au moins une0%). </li></ol> 4. Sélection de P. falciparum cytoadhesion aux cellules endothéliales <ol><li> Le jour du test, la culture de parasites doivent être au stade trophozoïte pigmentée (figure 2) (idéalement parasitémie de 10%) tandis que HBEC-5i la culture doit être de 50 à 100% de confluence (idéalement 90%). 30μl hématocrite de la culture de parasites est nécessaire par HBEC-5i boîte de Pétri. </li><li> Lavez les parasites à deux reprises par centrifugation (500 g pendant 5 min) 1.5ml de la culture du parasite. Rejeter le surnageant et resuspendre avec 10ml de fraîchement préparé, réchauffé, du milieu DMEM incomplète. Répétez la laver une seconde fois. Reprendre le volume cellulaire 30μl emballé avec 1.5ml d&#39;incomplet avec 1% de BSA DMEM. </li><li> Laver la vaisselle HBEC-5i revêtement de Petri à deux reprises aspirant moyen et ajouter 3 ml de DMEM incomplète. </li><li> Ajouter la solution de parasites à l&#39;antenne HBEC-5i et incuber à 37 ° C pendant 75min. Resuspendre les parasites deux fois (après 30 et 60 min) pendant l&#39;incubationen secouant délicatement le plat dans les quatre directions, ainsi que dans le sens horaire et anti-horaire. </li><li> Après incubation, laver la vaisselle 5 fois en aspirant moyen, en utilisant une pipette Pasteur en plastique à ajouter 3 ml de milieu DMEM chaudes incomplètes, et doux balancement. Si de nombreux plats sont utilisés, les garder sur une surface chaude, comme un grand flacon rempli d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Vérifiez le plat sous un microscope inversé. Si de nombreux infectés RBC sont encore visibles, faire plus de lave comme décrit ci-dessus. Manipuler la boîte de Pétri très soigneusement pour éviter tout risque de contamination. </li><li> Retirer moyennes du plat et ajouter 3ml de milieu RPMI chaud complet avec le volume des cellules 40μl emballée d&#39;uRBC frais. </li><li> Placer le plat dans une chambre hermétique incubation, de gaz pendant 3 min et le lieu de la chambre dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit. </li><li> Le lendemain, la récolte des parasites par un lavage avec du milieu RPMI incomplète, d&#39;une manière similaire à celle décrite à la section 4.4. mais plus vigoureusement. Keep tous les moyens utilisés (contenant resuspendues RBC) dans un tube 15ml conique. Vérifiez sous microscope inversé que tous les RBC ont été retirés de l&#39;antenne. </li><li> Pellet, les parasites, jeter le surnageant, remettre en suspension dans un milieu RPMI complet et 5ml placer le mélange dans un flacon de culture normaux. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Les parasites non sélectionnés présentent un faible niveau de se lier à HBEC-5i (figure 3A). Ainsi, après le premier tour de sélection, des parasites très peu seront récoltés et cela peut prendre jusqu&#39;à un mois de culture pour atteindre une parasitémie suffisante pour le second tour de sélection. Après chaque tour de sélection, les parasites de plus en plus de se lier aux cellules endothéliales et les sélections peut être répétée à intervalles de temps plus courte. Après 4-5 tours de sélection, les populations de parasites à haute liaison sont obtenus (figure 3). Dans nos mains, la liaison du HB3-HBEC d&#39;HBEC-5i ou TNF activée HBEC-5i était de simniveau de ILAR (données non présentées). Le protocole décrit ici a été testé avec 4 p. falciparum: HB3, IT/FCR3, 3D7 et DD2 (tableau 1). Seul ce dernier s&#39;est avéré incapable de se lier à HBEC-5i, même après 5 rondes de sélection. HB3 les parasites ont également été sélectionnés pour cytoadhérence à l&#39;homme cutanée et pulmonaire cellules endothéliales microvasculaires (HDMEC et HPMEC). Après quatre cycles de sélection, en utilisant la méthode décrite ici, une population à haut contraignant a été obtenu sur les deux HDMEC et HPMEC (figure 4). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig1.jpg" /> Figure 1. Aperçu du processus de sélection. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig2.jpg" /> Figure 2 phases de développement. De P. falciparum globules rouges infectés. Frottis au Giemsa visualisés au microscope à un grossissement de 1000X. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig3.jpg" /> Figure 3. Exemple typique de parasites liant à HBEC-5i. (A) La couche bleue est HBEC-5i fixé avec du glutaraldéhyde et colorées au Giemsa, visualisés au microscope à un grossissement de 1000X. Les photos ont été prises après la CISR uRBC et non liées ont été emportés. Le panneau de gauche montre un seul p. falciparum HB3 (non sélectionné) du parasite lié à HBEC-5i. Dans le panneau de droite, les parasites HB3-HBEC avait été sélectionné pour 5 tours. (B) Les données représentent la moyenne de deux expériences indépendantes, chacune réalisée en double. Le nombre de parasites liés par des cellules endothéliales a été compté. <img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/3122/3122table1.jpg" /> Tableau 1. Résumé des souches de Plasmodium falciparum qui ont été sélectionnées avec succès pour la liaison à HBEC-5i. Notez que HB3 a également été sélectionné sur le TNF-activé HBCE-5i. Après 5 rondes de sélection, la souche DD2 n&#39;a montré aucune augmentation dans la liaison au HBEC-5i comparé à désélectionné-DD2. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig4.jpg" /> Figure 4. Reliure de P. falciparum HB3 parasites dermiques (HDMEC) et pulmonaires (HPMEC) des cellules endothéliales, avant et après 4 tours de sélection. Bien que le milieu de culture pour HDMEC et HPMEC diffère légèrement (voir les instructions du fournisseur), le protocole utilisé pour la sélection a été identique à celle des HBEC-5i. Photos prises à un grossissement de 400x. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> DMEM-F12 de Ham </td><td> Sigma </td><td> D6421 </td><td> Pour milieu DMEM complet </td></tr><tr><td> L-glutamine 200 mM </td><td>GIBCO </td><td> 25030 </td><td> Pour un milieu DMEM et RPMI complet </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine 100X (10000 unités / ml et 10mg/ml) </td><td> ScienCell </td><td> 0503 </td><td> Pour milieu DMEM complet </td></tr><tr><td> Fœtale sérum bovin inactivé à la chaleur </td><td> ScienCell </td><td> 0025 </td><td> Pour milieu DMEM complet </td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA (0,025% de trypsine, 0.5mm EDTA) </td><td> ScienCell </td><td> 0103 </td><td></td></tr><tr><td> Endothéliale supplément de croissance cellulaire </td><td> ScienCell </td><td> 1052 </td><td> Pour milieu DMEM complet </td></tr><tr><td> La culture de tissus traités 60 mm x 15 mm boîte de Pétri </td><td> BD </td><td> 353002 </td><td></td></tr><tr><td> Fibronectine humaine </td><td> Millipore </td><td> FC010 </td><td> Utilisez à 2 pg / cm 2 </td></tr><tr><td> TNF </td><td> R &amp;D Systems </td><td> 210-TA </td><td> en option, utilisation à 50 pg / ml </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-167F </td><td> Pour un milieu RPMI complet </td></tr><tr><td> Gentamycine 50mg/ml </td><td> Lonza </td><td> 17-518Z </td><td> Pour un milieu RPMI complet </td></tr><tr><td> Hepes 1M </td><td> Lonza </td><td> BE17-737E </td><td> Pour un milieu RPMI complet </td></tr><tr><td> HDMEC </td><td> ScienCell </td><td> 2000 </td><td> Lignée cellulaire primaire </td></tr><tr><td> HPMEC </td><td> ScienCell </td><td> 3000 </td><td> Lignée cellulaire primaire </td></tr><tr><td> HBEC-5i </td><td></td><td></td><td> Obtenu à partir de Francisco Candal (fcandal@cdc.gov) </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Matériaux

<ol>
	<li>Scherf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+variation+in+malaria:+in+situ+switching,+relaxed+and+mutually+exclusive+transcription+of+var+genes+during+intra-erythrocytic+development+in+Plasmodium+falciparum.">Antigenic variation in malaria: in situ switching, relaxed and mutually exclusive transcription of var genes during intra-erythrocytic development in Plasmodium falciparum.</a> Embo. J. 17, 5418-5426 (1998).</li><li>MacPherson, G. G., Warrell, M. J., White, N. J., Looareesuwan, S., Warrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cerebral+malaria.+A+quantitative+ultrastructural+analysis+of+parasitized+erythrocyte+sequestration.">Human cerebral malaria. A quantitative ultrastructural analysis of parasitized erythrocyte sequestration.</a> Am. J. Pathol. 119, 385-401 (1985).</li><li>Seydel, K. B., Milner, D. A., Kamiza, S. B., Molyneux, M. E., Taylor, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+and+intensity+of+parasite+sequestration+in+comatose+Malawian+children.">The distribution and intensity of parasite sequestration in comatose Malawian children.</a> J. Infect. Dis. 194, 208-208 (2006).</li><li>Taylor, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiating+the+pathologies+of+cerebral+malaria+by+postmortem+parasite+counts.">Differentiating the pathologies of cerebral malaria by postmortem parasite counts.</a> Nat. Med. 10, 143-145 (2004).</li><li>van der Heyde, H. C., Nolan, J., Combes, V., Gramaglia, I., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+hypothesis+for+the+genesis+of+cerebral+malaria:+sequestration,+inflammation+and+hemostasis+leading+to+microcirculatory+dysfunction.">A unified hypothesis for the genesis of cerebral malaria: sequestration, inflammation and hemostasis leading to microcirculatory dysfunction.</a> Trends. Parasitol. 22, 503-508 (2006).</li><li>Dorovini-Zis, K., Prameya, R., Bowman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+characterization+of+microvascular+endothelial+cells+derived+from+human+brain.">Culture and characterization of microvascular endothelial cells derived from human brain.</a> Lab. Invest. 64, 425-436 (1991).</li><li>Rowe, J. A., Claessens, A., Corrigan, R. A., Arman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+to+human+cells:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+implications.">Adhesion of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes to human cells: molecular mechanisms and therapeutic implications.</a> Expert reviews in molecular medicine. 11, e16-e16 (2009).</li><li>Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum:+involvement+of+additional+receptors+in+the+cytoadherence+of+infected+erythrocytes+to+microvascular+endothelial+cells.">Plasmodium falciparum: involvement of additional receptors in the cytoadherence of infected erythrocytes to microvascular endothelial cells.</a> Exp. Parasitol. 84, 42-55 (1996).</li><li>Corrigan, R. A., Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+variation+in+early+innate+cytokine+induction+by+Plasmodium+falciparum.">Strain variation in early innate cytokine induction by Plasmodium falciparum.</a> Parasite. Immunol. 32, 512-527 (2010).</li><li>Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+mycoplasma+contamination+in+Plasmodium+falciparum+cultures+and+methods+for+its+detection+and+eradication.">Implications of mycoplasma contamination in Plasmodium falciparum cultures and methods for its detection and eradication.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 92, 177-180 (1998).</li><li>Moll, K., Ljungstr&#246;m, I., Perlmann, H., Scherf, A., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Malaria Research. , (2009).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li><li>Herricks, T., Antia, M., Rathod, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deformability+limits+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells.">Deformability limits of Plasmodium falciparum-infected red blood cells.</a> Cell. Microbiol. , (2009).</li><li>Nakamura, K., Hasler, T., Morehead, K., Howard, R. J., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum-infected+erythrocyte+receptor(s)+for+CD36+and+thrombospondin+are+restricted+to+knobs+on+the+erythrocyte+surface.">Plasmodium falciparum-infected erythrocyte receptor(s) for CD36 and thrombospondin are restricted to knobs on the erythrocyte surface.</a> J. Histochem. Cytochem. 40, 1419-1422 (1992).</li><li>Wassmer, S. C., Cianciolo, G. J., Combes, V., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LMP-420,+a+new+therapeutic+approach+for+cerebral+malaria.">LMP-420, a new therapeutic approach for cerebral malaria.</a> Med. Sci. (Paris). 22, 343-345 (2006).</li><li>Wassmer, S. C., Combes, V., Candal, F. J., Juhan-Vague, I., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+potentiate+brain+endothelial+alterations+induced+by+Plasmodium+falciparum.">Platelets potentiate brain endothelial alterations induced by Plasmodium falciparum.</a> Infect. Immun. 74, 645-653 (2006).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

La caractéristique de paludisme cérébral est la séquestration de P. falciparum CISR dans le cerveau microvascularisation 2, 3. Toutefois, dans les cultures in vitro de P. falciparum seulement mal aux cytoadhere HBEC-5i, un modèle pour l&#39;endothélium cérébral microvasculaires humaines. Ici, nous avons développé un test simple pour enrichir une population pour la liaison à HBEC-5i, un plus &quot;in vivo comme« phénotype. Trois des 4 P. falciparum ont été sélectionnées avec succès en utilisant cette méthode. Par ailleurs, HB3 a également été sélectionné sur HDMEC et HPMEC, indiquant que ce protocole peut être utilisé pour différents types et des parasites de cellules endothéliales. Différentes hypothèses peuvent expliquer l&#39;absence de liaison avec la souche DD2. Le plus probable étant le fait que cette ligne parasite est knobless, ce qui entrave profondément la cytoadhérence 13, 14. Nous recommandons les parasites en culture non sélectionnés aux côtés des pro sélectionCESS pour fournir un contrôle pour comparaison. Cela permettra, par exemple, en comparant le transcriptome de parasites contraignants et non contraignants, avec l&#39;espoir de découvrir des candidats ligand parasitaire. Le TNF est une cytokine trouve à un niveau élevé de patients atteints de paludisme cérébral et a été montrer à induire l&#39;expression des protéines de surface de nombreux HBEC-5i (Claessens et al, en préparation et 8, 15, 16). Dans ce cas, le montant des CISR lié a été similaire dans la normale HBEC-5i comparé à activé HBEC-5i. Ce «modèle séquestration» peut également être utilisé pour étudier l&#39;interaction moléculaire entre la CISR et les cellules endothéliales, ainsi que l&#39;effet de la putative anti-cytoadhérence médicaments. Dans ce cas, nous recommandons plaquage HBEC-5i dans les petits puits, comme «chambre de diapositives 8-même&quot; (BD 354 628) ou «CultureWell&quot; (Sigma C7735-20EA).

selection of plasmodium falciparum parasites for cytoadhesion to human brain endothelial cells

La plupart des décès dus au paludisme humain sont causées par des parasites au stade sanguin de Plasmodium falciparum. Le paludisme cérébral, la complication la plus mortelle de la maladie, se caractérise par une accumulation de Plasmodium falciparum globules rouges infectés (CISR) au stade trophozoïte pigmentée dans la microvascularisation du cerveau 2-4. Cette obstruction microvasculaire (séquestration) conduit à l&#39;acidose, l&#39;hypoxie et nuisibles cytokines inflammatoires (examiné en 5). Séquestration se trouve également dans la plupart des tissus microvasculaires du corps humain 2, 3. Le mécanisme par lequel CISR fixent sur les parois des vaisseaux sanguins est encore mal comprise. Le immortalisé microvasculaires du cerveau humain lignée cellulaire endothéliale (HBEC-5i) a été utilisé comme un modèle in vitro de la barrière sang-cerveau 6. Toutefois, le Plasmodium falciparum CISR attachent seulement mal aux HBEC-5i in vitro, contrairement à la sequestrat densesions qui se produit dans les cas de paludisme cérébral. Nous avons donc développé un test pour sélectionner le panoramique (enrichissement) de divers P. falciparum pour l&#39;adhésion à HBEC-5i afin d&#39;obtenir des populations de haute liant les parasites, les plus représentatifs de ce qui se passe in vivo. Un échantillon d&#39;une culture de parasites (mélange d&#39;CISR et non infectés RBC) au stade trophozoïte pigmentée est lavées et incubées sur une couche de HBEC-5i cultivés sur une boîte de Pétri. Après incubation, le plat est délicatement lavés et exempts de uRBC CISR non consolidés. Frais uRBC sont ajoutés à la CISR quelques attaché à HBEC-5i et incubées pendant la nuit. Comme parasites au stade schizonte éclater, les mérozoïtes envahir à nouveau RBC et ces parasites stade anneau sont récoltés le jour suivant. Les parasites sont cultivées jusqu&#39;à suffisamment de matériau est obtenu (généralement de 2 à 4 semaines) et un nouveau cycle de sélection peut être effectuée. Selon le P. falciparum souche, 4 à 7 tours de sélection sont nécessaires afin d&#39;obtenir une populationoù la plupart des parasites se lient à HBEC-5i. Le phénotype de liaison est progressivement perdu après quelques semaines, indiquant un interrupteur dans la surface de la variante du gène d&#39;antigène d&#39;expression, donc la sélection régulière sur HBEC-5i est nécessaire pour maintenir le phénotype. En résumé, nous avons développé un test de sélection rendu P. falciparum parasites plus «adhésif cérébrale du paludisme&quot; phénotype. Nous avons été en mesure de sélectionner 3 des 4 P. falciparum sur HBEC-5i. Ce test a également été utilisée avec succès pour sélectionner des parasites pour la liaison à l&#39;homme cutanée et pulmonaire, les cellules endothéliales. Surtout, cette méthode peut être utilisée pour sélectionner des populations de parasites spécifiques de tissus en vue d&#39;identifier des ligands parasitaires candidat pour la liaison à l&#39;endothélium cérébral. En outre, ce test peut être utilisé pour dépister putative anti-séquestration de drogues 7.

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Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Une<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle pour la séquestration du paludisme cérébral est décrit<sup&gt; 1</sup&gt;.<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Globules rouges infectés sont sélectionnés pour la liaison à des cellules humaines immortalisées microvasculaires cérébrales endothéliales. Les parasites sélectionnés montrent un phénotype distinct. Le processus de sélection peuvent être appliqués en utilisant diverses<em&gt; P. falciparum</em&gt; Souches et lignées cellulaires endothéliales.

Sélection des Plasmodium falciparum Parasites des Cytoadhesion aux cellules du cerveau endothéliales humaines

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

18.9K vues.  University of Edinburgh. Une In vitro Modèle pour la séquestration du paludisme cérébral est décrit 1. Plasmodium falciparum Globules rouges infectés sont sélectionnés pour la liaison à des cellules humaines immortalisées microvasculaires cérébrales endothéliales. Les parasites sélectionnés montrent un phénotype distinct. Le processus de sélection peuvent être appliqués en utilisant diverses P. falciparum Souches et ...

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An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infection modèle pour étudier<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-VIH-1 dans les interactions de l&#39;homme primaires dérivées de monocytes cellules immunitaires

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

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Immunologie et infection

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully understood and several hypotheses have been put forward, including mechanical obstruction of microvessels by P. falciparum-parasitized red blood cells (pRBC). Indeed, during the intra-erythrocytic stage of its life cycle, P. falciparum has the unique ability to modify the surface of the infected erythrocyte by exporting surface antigens with varying adhesive properties onto the RBC membrane. This allows the sequestration of pRBC in multiple tissues and organs by adhesion to endothelial cells lining the microvasculature of post-capillary venules 1. By doing so, the mature forms of the parasite avoid splenic clearance of the deformed infected erythrocytes 2 and restrict their environment to a more favorable low oxygen pressure 3. As a consequence of this sequestration, it is only immature asexual parasites and gametocytes that can be detected in peripheral blood.
Cytoadherence and sequestration of mature pRBC to the numerous host receptors expressed on microvascular beds occurs in severe and uncomplicated disease. However, several lines of evidence suggest that only specific adhesive phenotypes are likely to be associated with severe pathological outcomes of malaria. One example of such specific host-parasite interactions has been demonstrated in vitro, where the ability of intercellular adhesion molecule-1 to support binding of pRBC with particular adhesive properties has been linked to development of cerebral malaria 4,5. The placenta has also been recognized as a site of preferential pRBC accumulation in malaria-infected pregnant women, with chondrotin sulphate A expressed on syncytiotrophoblasts that line the placental intervillous space as the main receptor 6. Rosetting of pRBC to uninfected erythrocytes via the complement receptor 1 (CD35)7,8 has also been associated with severe disease 9.
One of the most recently described P. falciparum cytoadherence phenotypes is the ability of the pRBC to form platelet-mediated clumps in vitro. The formation of such pRBC clumps requires CD36, a glycoprotein expressed on the surface of platelets. Another human receptor, gC1qR/HABP1/p32, expressed on diverse cell types including endothelial cells and platelets, has also been shown to facilitate pRBC adhesion on platelets to form clumps 10. Whether clumping occurs in vivo remains unclear, but it may account for the significant accumulation of platelets described in brain microvasculature of Malawian children who died from CM 11. In addition, the ability of clinical isolate cultures to clump in vitro was directly linked to the severity of disease in Malawian 12 and Mozambican patients 13, (although not in Malian 14).
With several aspects of the pRBC clumping phenotype poorly characterized, current studies on this subject have not followed a standardized procedure. This is an important issue because of the known high variability inherent in the assay 15. Here, we present a method for in vitro platelet-mediated clumping of P. falciparum with hopes that it will provide a platform for a consistent method for other groups and raise awareness of the limitations in investigating this phenotype in future studies. Being based in Malawi, we provide a protocol specifically designed for a limited resource setting, with the advantage that freshly collected clinical isolates can be examined for phenotype without need for cryopreservation.

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

This method investigates the platelet-mediated clumping phenotype of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (pRBC) in clinical isolates. This is performed by isolating and co-incubating platelet-rich plasma and a suspension of pRBC.

Un protocole simple pour agglutination des plaquettes induite par des<em&gt; Plasmodium falciparum</emLes érythrocytes&gt; infectées dans une ressource Mauvais réglage

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolement et analyse de Brain-séquestrés de leucocytes<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-souris infectées

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

Séparation de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Late Phase érythrocytes infectés par des moyens magnétiques

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Test pour mesurer l&#39;adhésion des neutrophiles à Activé cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires dans des conditions statiques

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolement des cellules dendritiques myéloïdes et les cellules épithéliales du thymus humain

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

High Yield purification de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Mérozoïtes Pour utilisation en opsonisants Anticorps dosages

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Méthodes pour étudier le rôle de réglementation de petits ARN ribosomal et l&#39;occupation des<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von Willebrand Factor (VWF). This glycoprotein changes its molecular conformation in response to shear stress, thereby exposing binding sites for a broad spectrum of host-ligand interactions. In general, culturing of primary endothelial cells under a defined shear flow is known to promote the specific cellular differentiation and the formation of a stable and tightly linked endothelial layer resembling the physiology of the inner lining of a blood vessel. Thus, the functional analysis of interactions between bacterial pathogens and the host vasculature involving mechanosensitive proteins requires the establishment of pump systems that can simulate the physiological flow forces known to affect the surface of vascular cells.
The microfluidic device used in this study enables a continuous and pulseless recirculation of fluids with a defined flow rate. The computer-controlled air-pressure pump system applies a defined shear stress on endothelial cell surfaces by generating a continuous, unidirectional, and controlled medium flow. Morphological changes of the cells and bacterial attachment can be microscopically monitored and quantified in the flow by using special channel slides that are designed for microscopic visualization. In contrast to static cell culture infection, which in general requires a sample fixation prior to immune labeling and microscopic analyses, the microfluidic slides enable both the fluorescence-based detection of proteins, bacteria, and cellular components after sample fixation; serial immunofluorescence staining; and direct fluorescence-based detection in real time. In combination with fluorescent bacteria and specific fluorescence-labeled antibodies, this infection procedure provides an efficient multiple component visualization system for a huge spectrum of scientific applications related to vascular processes.

This study describes the microscopic monitoring of pneumococcus adherence to von Willebrand factor strings produced on the surface of differentiated human primary endothelial cells under shear stress in defined flow conditions. This protocol can be extended to detailed visualization of specific cell structures and quantification of bacteria by applying differential immunostaining procedures.

Infection de Pneumococcus des cellules endothéliales humaines primaires dans le flux constant

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

Meningococcal meningitis is a life-threatening infection that occurs when Neisseria meningitidis (meningococcus, Nm) can gain access to the central nervous system (CNS) by penetrating highly specialized brain endothelial cells (BECs). As Nm is a human-specific pathogen, the lack of robust in vivo model systems makes study of the host-pathogen interactions between Nm and BECs challenging and establishes a need for a human based model that mimics native BECs. BECs possess tighter barrier properties when compared to peripheral endothelial cells characterized by complex tight junctions and elevated trans-endothelial electrical resistance (TEER). However, many in vitro models, such as primary BECs and immortalized BECs, either lack or rapidly lose their barrier properties after removal from the native neural microenvironment. Recent advances in human stem-cell technologies have developed methods for deriving brain-like endothelial cells from induced pluripotent stem-cells (iPSCs) that better phenocopy BECs when compared to other in vitro human models. The use of iPSC-derived BECs (iPSC-BECs) to model Nm-BEC interaction has the benefit of using human cells that possess BEC barrier properties, and can be used to examine barrier destruction, innate immune activation, and bacterial interaction. Here we demonstrate how to derive iPSC-BECs from iPSCs in addition to bacterial preparation, infection, and sample collection for analysis.

Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells

The protocol described here highlights the major steps in the differentiating induced pluripotent stem-cell derived brain-like endothelial cells, the preparation of Neisseria meningitidis for infection, and sample collection for other molecular analyses.

Neisseria meningitidis Infection de cellules endothéliales cérébrales dérivées de cellules souches pluripotentes induites

Meningococcal meningitis is a life-threatening infection that occurs when Neisseria meningitidis (meningococcus, Nm) can gain access to the central ...