Les auteurs tiennent à remercier A. Benham pour aider à l&#39;élaboration du protocole. Ce travail a été financé par le NIH NS06747 subvention au BAB

1. Préparation de Worms pour l&#39;imagerie Ce segment du protocole est basé sur publia C. techniques de culture elegans 1,2, et est présenté dans la figure 1. <ol><li> Cultiver des vers sur des plaques de gélose peptone haute NGM (10 cm) ensemencées avec NA22 E. La bactérie E. jusqu&#39;à près de mourir de faim. Si immunocoloration, une plaque sera fiable de produire assez de vers pour 1 personne tache, compte tenu des pertes le long du chemin, et les critères stricts utilisés pour sélectionner des vers pour l&#39;imagerie (voir partie 2). </li><li> Vers la récolte en versant quelques millilitres de ddH 2 0 sur la plaque, en agitant brièvement, et verser le liquide dans un tube de 15 ml conique (répéter si nécessaire de transférer la plupart des vers dans le tube). Pellet en centrifugeuse clinique pendant 3 min, g 1000x. Laver à granulés 1-3x avec ddH 2 O jusqu&#39;à ce surnageant est clair pour éliminer les bactéries résiduelles. N&#39;utiliser que des pipettes de transfert en polypropylène pour supprimer surnageants, que les vers s&#39;en tenir à verre(À partir de ce étape, il est essentiel pour minimiser le temps entre les étapes pour éviter les pertes dans la viabilité des œufs). </li><li> Après le dernier lavage, le ver de remettre en suspension le culot dans 5 ml solution d&#39;hypochlorite de alcaline pour lyser les vers et les œufs de libération. Bercer doucement, et d&#39;examiner les tubes sous un microscope à dissection environ une fois par minute. Lorsque environ 50% des vers sont lysées (ils apparaissent tordues et brisées ouvert), mettre fin à la lyse par le remplissage du tube vers le haut avec le tampon d&#39;oeufs, retournant plusieurs fois, et la granulation pendant 3 min, g 1000x. Temps de lyse ne doit pas dépasser 5 minutes. </li><li> Enlever le surnageant avec une pipette de transfert, et se laver à granulés 3x avec le tampon d&#39;oeufs. </li><li> Pour séparer les œufs de débris, les faire flotter sur un coussin de saccharose à 30% dans le trou DDH 2 O: après le lavage final de l&#39;étape 1.4, retirez avec précaution le surnageant et remettre en suspension le culot dans 5 ml ddH 2 0. Ajouter 5 ml de saccharose à 60% stérile dans le trou DDH 2 O, et bien mélanger. Spin dans la centrifugeuse clinique 6 min, g 1000x. Oeufs permettra de recueillir au niveau du ménisque (ils have un aspect trouble), tandis que les débris de granules. </li><li> En utilisant une pipette de transfert en plastique, aspirer les oeufs dans un volume minimal et transfert à des boîtes de gélose non ensemencés NGM. Les oeufs qui adhèrent à côté du tube peut être rincé doucement et transférés ainsi. Une plaque de 10 cm ensemencés par la souche analysée est suffisante. </li><li> Incuber les plaques non ensemencés avec les oeufs nuit (~ 16 h) à 20 ° C. Purger la plaque pour les premières heures de la sécher en laissant le couvercle légèrement hors de quelques heures, mais être sûr de couvrir toute la nuit. </li><li> Après l&#39;éclosion, les larves L1 transférer le à un tube de 15 ml conique basale S (ajouter à la plaque basale quelques ml S, tourbillon, versez dans le tube). Pellet en centrifugeuse clinique (3 min, 1000x g), remettre en suspension dans un volume minimal de baso-S, et le transfert de plaques de 10 cm NGM gélose ensemencée avec NA22 bactéries. Utilisez 2 plaques ici pour chaque plaque d&#39;origine de l&#39;étape 1.1. Incuber jusque vers atteignent l&#39;âge de votre choix. </li><li> Surveiller les cultures une ou deux fois par jour. Si ils sont en danger of faim, de transférer à de nouvelles plaques NA22. Pour les vers de type sauvage N2, la famine est précédée par la formation d&#39;une ligne ou une vague de vers qui se déplace à travers la plaque, comme les animaux migrent en masse loin de la nourriture appauvries zones. Une fois cette forme, la nourriture sera complètement épuisé en quelques heures. </li><li> Worms sont maintenant prêts pour immunomarquage ou imagerie en temps réel. Fixation et coloration des vers en suspension est optimale car un grand nombre de vers intacts peuvent être visualisés facilement. Procédures de coloration sur la base du protocole de Finney et Ruvkun 3-6 sont préférable de congeler du crack procédures car un grand nombre de vers sont nécessaires pour l&#39;imagerie. </li></ol> 2. Imagerie confocale <ol><li> Monter vers sur des lames pour l&#39;imagerie confocale. Réglage de la densité de vers à quelques centaines par microlitre. Ajouter un tampon de 2% d&#39;agarose à S-basale entourée par un anneau mince de vaseline pour empêcher l&#39;évaporation au cours d&#39;imagerie (appliqué par l&#39;intermédiaire d&#39;une seringue de 3 ml équipé d&#39;un seuil de 25 aiguille de calibre). Aide d&#39;une pipettemicrolitres de la suspension quelques ver sur une lamelle (utiliser l&#39;anesthésie si des vers vivants d&#39;imagerie), et d&#39;abaisser le tampon d&#39;agarose sur la lamelle, la propagation des vers uniformément sur le pavé. </li><li> Sélectionnez les vers destinés à l&#39;imagerie. Choisir vers lequel les synapses d&#39;intérêt sont orientés vers la lentille d&#39;objectif, avec un déplacement radial de pas plus de ± 45 ° (où 0 ° signifie orientée directement vers l&#39;objectif). Effectuez cette évaluation rapide (quelques secondes) pour éviter le photoblanchiment. L&#39;échelle des cultures initiales est optimisé pour assurer des vers suffisantes seront satisfaire à ces critères géométriques. </li><li> Remplissez l&#39;imagerie confocale de l&#39;échantillon. Échantillons relativement plats qui peuvent être envisagées dans environ 14 0,4 ​​um d&#39;épaisseur sections produire les meilleurs résultats. Haute vitesse, des images à faible résolution (512 x 512 pixels) sont suffisants pour la collecte de données rapide précise. Éviter de saturer le détecteur avec les forces de signal excessives, car cela entraînerait une sous-estimation de la fluorescencesignaux. </li></ol> 3. D&#39;identification automatique et de l&#39;analyse des clusters individuels Synaptic <ol><li> Ouvrir les fichiers de sortie multi-TIF de la microscopie confocale en utilisant Volocity 4.0 (ou supérieur) logiciel (PerkinElmer). </li><li> Rogner les zones de l&#39;image qui ne contient pas la structure d&#39;intérêt (Image -&gt; Focus étendue -&gt; Découper la sélection&gt; Choisir zone d&#39;intérêt en utilisant «à main levée ROI outil - -&gt; Actions; la figure 2A). Remarque, Focus étendue produit une projection z-plan sur l&#39;écran de l&#39;ordinateur à l&#39;aide de votre analyse, mais n&#39;affecte pas les données sous-jacentes; la même chose est vraie pour les réglages de luminosité et de contraste, le cas échéant). </li><li> Mesurer la longueur de la zone analysée à l&#39;aide de l&#39;outil Ligne. La longueur de la ligne seront calculés et ajoutés à la table de données (figure 2B). </li><li> Identifier les objets en utilisant les &#39;objets par l&#39;intensité »de filtre (mode Mesures). Spécifiez un seuil tel que les grappes sont synaptiquesmis en évidence et non-synaptique de fond n&#39;est pas (figure 2C). Inclusion d&#39;un marqueur indépendant synaptique marqué avec une autre couleur peut aider à identifier sans ambiguïté les synapses. Synapses typiques vont de quelques-uns à quelques centaines de voxels. Régler le seuil de fois en utilisant un échantillon de contrôle, et l&#39;utiliser pour tous les échantillons subséquents. Seuillage chaque échantillon est séparément inacceptable, car elle introduit la possibilité de biais expérimentateur. Les objets sont sélectionnés et totalisées automatiquement (figure 2D). </li><li> Organiser et exporter les données. Éliminer les objets de 2 ou moins voxels, puisque ceux-ci sont généralement des taches de fond. Ceux-ci peuvent être éliminés par filtrage d&#39;autres, ou lors de l&#39;analyse ultérieure. Afin de faciliter leurs aval de déménagement, re-trier le fichier de données par la &#39;taille&#39; objet donc ils veulent tout regrouper. Exportez les données au format CSV, qui peut être ouvert par Microsoft Excel ou autres tableurs. Chaque image produit un fichier de sortie. </li><li> Si douce VolocityWare n&#39;est pas disponible, d&#39;autres méthodes pour analyser les Z-plan des projections de données confocale peut être utilisé (par exemple réf. 7, ou l&#39;analyse manuelle à l&#39;aide ImageJ), même si en 3 dimensions l&#39;information est perdue (voir Discussion). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs La méthode de quantification présenté doit être en mesure de faire la distinction entre les populations du cluster de luminosité différente et des volumes différents. Des images représentatives et correspondants les données quantitatives présentées dans la figure 3 montrent des exemples de différenciation sur la base de ces paramètres. En règle générale, les résultats doivent être conformes à ce qui est évident à l&#39;œil. Dans le cas de l&#39;UNC-49 récepteur GABA immunocoloration la corde nerveuse ventrale de C. elegans, tous les animaux en général est apparu très similaire en taille et en maturité, et le total des valeurs de fluorescence pour synaptiques un groupe de cinq vers (normalisé à la longueur de la moelle épinière analysés) a montré l&#39;erreur type<html> des valeurs d&#39;environ 10% de la moyenne 4. Une mutation génétique et d&#39;autres traitements expérimentaux (l&#39;exposition au médicament, par exemple) peuvent modifier non seulement le volume et les valeurs d&#39;intensité et de distributions de fréquence des grappes synaptiques, mais peut-être le développement du temps bien sûr et de la synchronie des vers, conduisant à une plus grande variabilité. Toutefois, les résultats quantitatifs doivent toujours refléter ce qui peut être apprécié visuellement et si elle n&#39;est pas, à l&#39;inspection des images et des objets identifiés par Volocity devrait révéler l&#39;endroit où l&#39;erreur s&#39;est produite et de proposer des mesures correctives telles que re-seuillage ou la suppression d&#39;objets artefactuelles. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig1.jpg" /> Figure 1. Préparation de synchrone C. cultures elegans. cultures synchrones sont obtenus à partir de cette procédure parce que C. arrestations de développement elegans et le stade larvaire L1 en l&#39;absence de nourriture, et reprend lorsque la nourriture est introduite. <html> ove_content &quot;&gt; <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig2.jpg" /> Figure 2. La quantification de puncta synaptique. <ol class="ualpha"><li> Régions d&#39;origine étrangère de l&#39;image sont rognés pour réduire la taille des fichiers et d&#39;accroître la spécificité. Panneau de gauche montre l&#39;image de départ, le panneau du milieu montre la région sélectionnée, panneau de droite montre l&#39;image après le recadrage. Signal rouge est UNC-49 immunofluorescence récepteur GABA, le signal vert est synaptobrévine-GFP (un marqueur présynaptique) exprimée en présynaptiques des neurones GABA 4. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2alarge.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . </li><li> Une ligne est tracée la longueur du segment moelle épinière à analyser, et sa longueur est automatiquement enregistré dans le tableau des résultats. Cette information est nécessaire pour normaliser les données synaptiques dues à la longueur de la moelle épinière analysable, qui peut varier de plusieurs fois si les vers se fragmenter pendant la coloration.www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2blarge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir la figure. </li><li> Un seuil est appliqué à identifier individuellement les clusters synaptiques. Le panneau de gauche montre l&#39;image avant de seuillage; des exemples de niveaux de seuillage différents sont présentés dans des panneaux séparés (signal vert omis). Chaque objet identifié est représenté sur l&#39;image en tant que région colorée. Notez la correspondance entre les groupes visuellement évidentes synaptiques dans le panneau le plus à gauche et les régions de couleur sur le panneau le plus à droite. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2clarge.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . </li><li> Chaque objet identifié est répertorié séparément dans le tableau des résultats. Objets individuels peuvent être sélectionnés, et sont mises en évidence sur l&#39;image pour l&#39;inspection, si désiré. Notez que la table contient des informations pour le rouge (&quot;rhodamine&quot;) et vert (&#39;EGFP ») des canaux; les informations du canal vert est potentiellement trompeuse, car les objets sontidentifiés sur la base strictement sur la fluorescence rouge. Cette analyse peut également être exécutées sur les images d&#39;une seule couleur. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2dlarge.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . </li></ol><img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig3.jpg" /> Figure 3. Des résultats représentatifs. Micrographies représentatives de type sauvage C. elegans colorés pour UNC-49 récepteurs GABA avant (A) et après (B) le traitement par le muscimol, un agoniste des récepteurs GABA qui provoque récepteurs deviennent contrerégulés après une longue exposition. Panneaux montrer des images recadrées avant (à gauche) et après (à droite) de seuillage et l&#39;enlèvement des taches de fond de petite taille. (C) Parcelles de paramètres quantitatifs synaptiques pour les spécimens présentés dans (A) et (B): fluorescence totale normalisé à la longueur du cordon nerveux (à gauche), et les histogrammes probabilité cumulative de contenu synapse fluorescence individuelle (au milieu) et le volume des synapses (right), démontrant une réduction statistiquement significative de la teneur et le volume synaptique induite par l&#39;exposition agoniste (n = 60 pour les synapses non traités, n = 115 synapses pour muscimol-traité, p &lt;0,001, test de Kolmogorov-Smirnov <a href="http://www.physics.csbsju.edu/stats/KS-test.html" target="_blank">http://www.physics.csbsju .edu / stats / KS-test.html</a> ).

<ol>
	<li>Christensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells.">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33, 503-514 (2002).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li><li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122, 2517-2527 (1996).</li><li>Davis, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+lysosomal+trafficking+as+a+mechanism+for+regulating+GABAA+receptor+abundance+at+synapses+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).</li><li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans.">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li><li>Rowland, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+terminals+independently+regulate+synaptic+clustering+and+autophagy+of+GABAA+receptors+in+Caenorhabditis+elegans.">Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).</li><li>Burbea, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+and+AP180+regulate+the+abundance+of+GLR-1+glutamate+receptors+at+postsynaptic+elements+in+C.+elegans.">Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans.</a> Neuron. 35, 107-120 (2002).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+regulated+by+the+insulin-like+signaling+pathway+underlies+salt+chemotaxis+learning+in+Caenorhabditis+elegans.">Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).</li><li>Sankaranarayanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity.">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li><li>McDonald, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+functional+characterization+of+fluorescent,+N-terminally+tagged+CB1+receptor+chimeras+for+live-cell+imaging.">Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging.</a> Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).</li><li>Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+neuropeptide+release+induced+by+octopamine+without+Ca2++entry+into+the+nerve+terminal.">Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La méthode présentée ici est conçu pour extraire quantitatives multi-paramètres de données pour de grandes populations de synapses dans C. elegans, tout en maximisant la cohérence au sein des groupes de traitement. Trois caractéristiques contribuent à ces objectifs. Tout d&#39;abord, immunomarquage est effectué sur les populations de vers synchrones afin de s&#39;assurer que tous les animaux ont le même âge. Cette étape est cruciale, car la régulation du développement des niveaux d&#39;expression...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du logiciel </td><td> Entreprise </td><td></td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Volocity v4.0 ou supérieur </td><td> PerkinElmer / Improvision </td><td></td><td> Vérifiez votre installation locale de base d&#39;imagerie pour l&#39;accès à ce logiciel. Logiciel de démonstration est disponible sur le site Web de PerkinElmer. Cette méthode ne requiert que le module de quantification de Volocity. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 2. Réactifs et équipements spécifiques. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Tampon Egg </td><td> NaCl KCl CaCl 2 MgCl 2 HEPES (Ajuster le pH à 7,3) </td> &lt;td&gt; 118 mM 48 mM 2 mM 2 mM 24 mM </td></tr><tr><td> Hypochlorite alcaline (pour 5 ml) </td><td> Eau de javel fraîche (jeter bouteille 30 jours après ouverture) NaOH 10 N ddH 2 O </td><td> 1,0 ml 0,25 ml 3,75 ml </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 1. Solutions. </td></tr></tbody></table>

automated quantification of synaptic fluorescence in c. elegans

La force Synapse se réfère à l&#39;amplitude des réponses postsynaptiques à la libération de neurotransmetteurs présynaptiques des événements, et a un impact majeur sur la fonction circuit global de neurones. Synapse force dépend de façon critique sur l&#39;abondance des récepteurs de neurotransmetteurs en cluster sur les sites synaptiques sur la membrane postsynaptique. Les niveaux de récepteurs sont établis développemental, et peut être modifié par le trafic des récepteurs entre les pools de surface localisée, subsynaptic, et intracellulaires, ce qui représente d&#39;importants mécanismes de la plasticité synaptique et la neuromodulation. Des méthodes rigoureuses pour quantifier synapse-localisée abondance des récepteurs de neurotransmetteurs sont indispensables pour étudier le développement et la plasticité synaptique. La microscopie à fluorescence est une approche optimale, car elle préserve l&#39;information spatiale, en distinguant synaptique de la non-synaptiques piscines, et la discrimination entre les populations de récepteurs localisés à différents types de synapses. La génétique organisme modèle Caenorhabditis elegans est particulièrement bien adapté pour ces études en raison de la petite taille et leur relative simplicité de son système nerveux, sa transparence, et la disponibilité de puissantes techniques génétiques, permettant l&#39;examen des synapses indigènes chez les animaux intacts. Nous présentons ici une méthode pour quantifier marquage fluorescent récepteurs de neurotransmetteurs synaptiques dans C. elegans. Sa principale caractéristique est l&#39;identification automatique et l&#39;analyse des synapses individuelles en trois dimensions dans plusieurs fichiers de sortie d&#39;avion confocaux microscope, la position tabulation, volume, intensité de la fluorescence et de fluorescence totale pour chaque synapse. Cette approche présente deux avantages principaux sur une analyse manuelle de z-plan des projections de données confocale. Tout d&#39;abord, parce que chaque plan de l&#39;ensemble des données est inclus confocale, pas de données sont perdues à z-plan de projection, généralement basées sur les moyennes d&#39;intensité de pixels ou maxima. Deuxièmement, l&#39;identification des synapses est automatisé, mais peut être inspecté par l&#39;expérimétrique comme les produits d&#39;analyse de données, permettant l&#39;extraction rapide et précise des données provenant de grands nombres de synapses. Des centaines de milliers de synapses par l&#39;échantillon peut être facilement obtenue, la production de grands ensembles de données afin de maximiser la puissance statistique. Considérations pour la préparation de C. elegans pour l&#39;analyse et l&#39;exécution de l&#39;imagerie confocale pour minimiser la variabilité entre les animaux au sein des groupes de traitement sont également discutés. Bien que développé pour analyser C. récepteurs post-synaptiques elegans, cette méthode est généralement utile pour tout type de synapse-localisée protéines, ou même, tout signal de fluorescence qui est localisée aux pôles discrets, puncta, ou les organites. La procédure est réalisée en trois étapes: 1) la préparation d&#39;échantillons, 2) l&#39;imagerie confocale, et analyse d&#39;image 3). Les étapes 1 et 2 sont spécifiques à C. elegans, tandis que l&#39;étape 3 est généralement applicable à tout signal de fluorescence dans ponctuée micrographies confocales.

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Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

L&#39;abondance des récepteurs de neurotransmetteurs dans les synapses en cluster influe fortement sur la force synaptique. Cette méthode permet de quantifier les récepteurs des neurotransmetteurs marquage fluorescent en trois dimensions avec une seule synapse résolution<em&gt; C. elegans</em&gt;, Permettant à des centaines de synapses d&#39;être rapidement caractérisé au sein d&#39;un échantillon unique sans distorsions introduites par z-plan de projection.

Quantification automatisée de la fluorescence dans Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

automated-quantification-of-synaptic-fluorescence-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

10.2K vues.  University of Toledo. L'abondance des récepteurs de neurotransmetteurs dans les synapses en cluster influe fortement sur la force synaptique. Cette méthode permet de quantifier les récepteurs des neurotransmetteurs marquage fluorescent en trois dimensions avec une seule synapse résolution C. elegans, Permettant à des centaines de synapses d'être rapidement caractérisé au sein d'un échantillon unique sans distorsions introduites par z-plan de projection.

Vidéo: Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant mechanism(s) of toxicity are still unclear. A&beta; is also deposited intramuscularly in Inclusion Body Myositis, a severe human myopathy. The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express human A&beta;. Depending on the tissue or timing of A&beta; expression, transgenic worms can have readily measurable phenotypes that serve as a read-out of A&beta; toxicity. For example, transgenic worms with pan-neuronal A&beta; expression have defects is associative learning (Dosanjh et al. 2009), while transgenic worms with constitutive muscle-specific expression show a progressive, age-dependent paralysis phenotype (Link, 1995; Cohen et al. 2006). One particularly useful C. elegans model employs a temperature-sensitive mutation in the mRNA surveillance system to engineer temperature-inducible muscle expression of an A&beta; transgene, resulting in a reproducible paralysis phenotype upon temperature upshift (Link et al. 2003). Treatments that counter A&beta; toxicity in this model [e.g., expression of a protective transgene (Hassan et al. 2009) or exposure to Ginkgo biloba extracts (Wu et al. 2006)] reproducibly alter the rate of paralysis induced by temperature upshift of these transgenic worms. Here we describe our protocol for measuring the rate of paralysis in this transgenic C. elegans model, with particular attention to experimental variables that can influence this measurement.

Assaying &amp;#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express the human &beta;-amyloid peptide (A&beta;). Induced expression of A&beta; in C. elegans muscle leads to a rapid, reproducible paralysis phenotype that can be used to monitor treatments that modulate A&beta; toxicity.

Dosage β-amyloïde toxicité utilisant un transgéniques C. elegans</emModèle>

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

Recherche

Neurosciences

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

In vivo laser axotomie en C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Diffusion latérale et l&#39;exocytose des protéines membranaires dans des neurones en culture évaluée à l&#39;aide de récupération de fluorescence et de fluorescence de perte de photoblanchiment

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Suivi et évaluation comportementale

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Un indicateur moléculaire de l&#39;adaptation à long terme olfactive dans<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Étiquetage immunologique post-enrobage des protéines synaptiques dans l&#39;hippocampe cultures Slice

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

En imagerie calcique in vivo des neurones en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Visualisation neuroblaste Cytocinèse cours<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenèse

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

Imagerie in vivo de Dauer spécifique neuronale Rénovation en C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has proven to be an invaluable model organism in helping to tackle this challenge, from inspiring technological approaches,&#160;building the human brain connectome, to actually shedding light on the specific molecular drivers of basic functional patterns. The bulk of the behavioral studies in C. elegans have been performed on solid substrates. In liquid, animals exhibit behavioral patterns that include movement at a range of speeds in 3D, as well as partial body movements, such as a posterior curl without anterior shape change, which introduce new challenges for quantitation. The steps of a simple procedure, and use of a software that enables high-resolution analysis of C. elegans swim behavior, are presented here. The software, named CeleST, uses a specialized computer program that tracks multiple animals simultaneously and provides novel measures of C. elegans locomotion in liquid (swimming). The measures are mostly grounded in animal posture and based on mathematics used in computer vision and pattern recognition, without computational requirements for threshold cut-offs. The software tool can be used to both assess overall swimming prowess in hundreds of animals from combined small batch trials and to reveal novel phenotypes even in well-characterized genetic mutants. The preparation of specimens for analysis with CeleST is simple and low-tech, enabling wide adaptation by the scientific community. Use of the computational approach described here should therefore contribute to the greater understanding of behavior and behavioral circuits in the C. elegans model.

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

An efficient and simple methodology for computer-based analysis of nematode swimming behavior in liquid is described. The method requires little to no investment for C. elegans laboratories. The hardware used is standard, and the computer software for the behavioral analysis (CeleST) is an open source one.

Analyse automatisée de<em&gt; C. elegans</em&gt; Comportement Swim Utiliser Celest Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...