Les subventions: NIH CA165263, CA150197 NIH, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0120999 Centre pour la biophotonique Science &amp; Technology (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ Gras), les recherches Conseil de la Norvège, Leiv Eiriksson Travel Grant 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung reconnaît également le soutien du Fonds Auburn Communauté Cancer dotation. RJ Gras reconnaît également le soutien de l&#39;J. McDonald dotation. Nous remercions le Dr Jenny Wei-Jen Kung et le Dr Bor-wen Wu à DesigneRx pour l&#39;approvisionnement généreux de l&#39;ADI.

1. Partie 1: Culture de cellules et d&#39;étiquetage immuno-fluorescent <ol><li> Cultivez CWR22 Rv1 cellules tumorales de la prostate de l&#39;homme sur le verre de lamelles (# 1.5 ou 170 um d&#39;épaisseur) placées dans des plaques 6 puits, avec RPMI (Mediatech, VA) contenant 10% de sérum de veau fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine / glutamine. </li><li> Induire l&#39;autophagie en traitant des échantillons choisis avec l&#39;arginine déiminase (ADI, 0,3 pg / ml) dans un tampon phosphate salin (PBS). </li><li> Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde 4% (PFA, Fisher Scientific, NH) dilué dans du PBS, 100 pl par lamelle, pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Laver les cellules 3x avec 1 ml HBS / BSA. </li><li> Perméabiliser cellules avec 0,05% de saponine (Sigma, MO) dans HEPES (HBS) / BSA, 100 pi par lamelle, pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Avant d&#39;immuno-marquage, des échantillons de blocs avec 2,5% de caséine (Sigma, MO) dans HBS / BSA, 100 pi par lamelle, pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Incuber les cellules fixées avec des anticorps primaires dilués dans 2,5% de caséine / HBS / BSA, 100 pi par coverslip, O / N à 4 ° C. </li><li> Laver les cellules 3x avec 1 ml HBS / BSA. </li><li> Incuber les cellules fixées avec des anticorps secondaires dilués dans 2,5% de caséine / HBS / BSA, 100 pi par lamelle, pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Laver les cellules 3x avec 1 ml HBS / BSA. </li><li> Monter les lamelles préparés sur des lames de microscope en verre régulièrement avec de l&#39;or SlowFade ou prolonger réactif antifade Gold (Invitrogen, CA) contenant 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). </li><li> Bords Seal lamelle vernis à ongles. Pour de meilleurs résultats d&#39;imagerie, laisser le temps (idéalement O / N) pour les supports anti-décoloration de pénétrer à fond les cellules. </li><li> Surface de la lamelle propre avec du méthanol et / ou le chloroforme. </li><li> Ajouter l&#39;huile d&#39;immersion (indice de réfraction 1.520 lorsque l&#39;imagerie à 37 ° C, ou lorsque 1.516 imagerie à température ambiante) à l&#39;1,42 NA objectif 60X (Olympus, Japon). </li><li> glissière de position sur la platine du microscope et d&#39;établir mise au point avec les cellules d&#39;intérêt. </li></ol> 2. Partie 2: Préparation des cellules pour l&#39;imagerie en direct <ol><li> Cultivez CWR22 Rv1 cellules exprimant la protéine fluorescente verte couplé à chaîne légère 3 (LC3-GFP) dans des milieux de culture RPMI contenant 10% de FBS et 1% d&#39;antibiotiques sur 35 mm de boîtes de culture à fond de verre revêtues de poly-D-lysine (MatTek, MA). Les cellules doivent être étalées à une densité suffisante pour faciliter la prolifération rapide, mais pas autant que les cellules sont envahies et agglomérées au moment de l&#39;imagerie. </li><li> Traiter les échantillons de cellules sélectionnées avec ADI (0,3 pg / ml) dans du PBS. </li><li> Environ 1 heure avant l&#39;imagerie, diluer 1,5 l de Lysotracker Red DND-99 (Invitrogen, CA) avec 20 ml de RPMI. contenant 10% de FBS et 1% d&#39;antibiotiques. Utiliser des solutions contenant des DJA pour les échantillons sélectionnés. Chauffer tous les médias à 37 ° C avant d&#39;ajouter dans la boîte de culture. </li><li> Incuber les cellules avec du RPMI contenant Lysotracker Red DND-99 pour 15-45 min à 37 ° C. </li><li> Environ 30 minutes avant l&#39;imagerie, allumer l&#39;enceinte de l&#39;environnement WeatherStation et laisser s&#39;équilibrer à 37 ° C et 5% de CO 2 (avec Humidifair IED). </li><li> Laver les cellules avec du PBS et remplacer le support à la norme RPMI contenant seulement 10% de FBS et 1% d&#39;antibiotiques. Ajouter ADI à des échantillons comme indiqué. </li><li> Plats mont 35 mm lamelle à fond dans la culture adaptateur personnalisé (Applied Precision Inc., WA) et la position sur la platine du microscope. Utilisez l&#39;huile d&#39;immersion (indice de réfraction 1.520) sur la lentille de l&#39;objectif 1,42 NA 60X, et positionner la boîte de culture monté sur la scène. </li></ol> 3. Partie 3: microscopie et analyse Déconvolution Le protocole de cette section suppose l&#39;utilisation de la DeltaVision Personal DV microscope de déconvolution et associé Softworx Application Suite (Applied Precision Inc., WA). <ol><li> Activer le système de microscope, comprenant poste d&#39;acquisition et de commande de l&#39;instrument. Ouvrez l&#39;application Resolve3D pour initialiser la platine du microscope et allumer la source de lumière au xénon. Laisser 10 min pour la source lumineuse pour se réchauffer et atteindre des conditions stables. </li><li> Ajouter unegoutte d&#39;huile à immersion (indice de réfraction de 1,520 pour les échantillons vivantes à 37 ° C ou de 1,516 pour les échantillons fixes à TA) sur l&#39;1,42 lentille 60X d&#39;objectif NA, et échantillon de lame centrale (couvercle visage de glissement vers le bas) par rapport à la lentille d&#39;objectif. </li><li> En utilisant soit éclairage sur fond clair ou externe et la mise au point grossière bouton de réglage, élever lentement la lentille d&#39;objectif jusqu&#39;à ce que le bourrelet de l&#39;huile d&#39;immersion est en contact avec le verre de recouvrement inverse. (De ce point, la couche de cellules devrait venir en discussion au sein de quelques tours de mise au point fine bouton de réglage). Lorsque vous travaillez avec des échantillons fixés sur les lames, il est recommandé d&#39;éviter les cellules à l&#39;intérieur ou à proximité de zones avec des bulles. Lors de la visualisation avec des échantillons vivants sur le plat à fond de verre, éviter de déplacer la lentille de l&#39;objectif à l&#39;extérieur de la limite de la lamelle de verre. </li><li> Autophagosomes peuvent être identifiés par le signal eGFP (vert). Les lysosomes sont identifiés par Lysotracker Rouge (échantillon en direct) ou anticorps fluorescents anti-Lamp1 (échantillon fixe). Les noyaux cellulaires sont identifiés par DAPI stAining (échantillon fixe). </li><li> Sélectionnez le champ de vision souhaité. Idéalement, les cellules doivent présenter une bonne signal fluorescent dans tous les canaux appropriés et suffisamment attachés et étalé sur la surface de la lamelle afin que le contenu intracellulaires sont faciles à visualiser. De petits ajustements à x latéraux, y et z-focus peuvent être contrôlés par l&#39;ordinateur via l&#39;interface Acquire3D. Réglez binning 1x1 ou 2x2 pour, selon le champ de vision souhaité (plus de cellules peuvent être vus sur le terrain lorsque binning est mis à 2x2). </li><li> Pour une image donnée à travers la partie centrale d&#39;une cellule, définissez les paramètres d&#39;exposition (par exemple, la puissance de transmission% et le temps d&#39;exposition) tels que l&#39;intensité maximale de pixel ne dépasse pas 3.000 points. En règle générale, la transmission de% doit être réglé aussi bas que possible, sans augmenter le temps d&#39;exposition correspondant plus de 1 sec. Répétez cette procédure pour chaque couleur de fluorescence à imager et pour chaque champ séparé de vue pour obtenir les images de haute qualité. </li><li> Réglez le ulimites REPP et inférieure de la pile Z de par réglage de la mise au point juste un peu plus haut et en bas de l&#39;échantillon de cellules, respectivement. Le nombre total d&#39;images dans un pays donné Z-stack sera donc déterminé par ces limites et par l&#39;espacement entre les couches (valeur par défaut: 0,2 um). </li><li> Afin de minimiser les artefacts de mouvement lors de l&#39;acquisition de l&#39;image, nous vous recommandons de régler le mode d&#39;acquisition d&#39;image de «longueur d&#39;onde alors z-stack» pour les échantillons fixes, et «z-stack alors longueur d&#39;onde&quot; pour des échantillons vivants. </li><li> Images de fluorescence sont déconvoluées utilisant Softworx (Applied Precision, WA) et plus tard analysées à l&#39;aide Volocity (Improvision, maintenant Perkin Elmer, MA). </li></ol> 4. Partie 4: Super-résolution, Structured-éclairage (OMX) Microscopie Le protocole de cette section s&#39;appliquent à l&#39;utilisation du microscope à éclairage structuré OMX (Applied Precision, WA). <ol><li> Allumez l&#39;interrupteur principal et les lasers souhaités (410 nm, 488 nm et / ou 532 nm). Attendre 20 min pour les lasers à stabiliser thermiquement. </li><li> Ajouter l&#39;huile d&#39;immersion (indice de réfraction 1.516 pour les échantillons fixes à RT) sur la lentille de 1,42 NA objectif 60X. Si des bulles apparaissent dans la gouttelette d&#39;huile, nettoyez l&#39;objectif et ajouter de l&#39;huile à nouveau. </li><li> Placez la lame échantillon sur la scène et, si nécessaire, laissez 10 min pour les cellules à s&#39;installer sur la lamelle. </li><li> Initialiser le programme d&#39;acquisition. Utilisez un éclairage par fluorescence pour ajuster la mise au point jusqu&#39;à un contour net de la cellule peut être vu. (Il convient de veiller en tout temps à minimiser l&#39;exposition de cellules à fluorescence excitation, jusqu&#39;à l&#39;acquisition de l&#39;image réelle). </li><li> Une analyse de la mosaïque en spirale peut être acquise pour avoir un aperçu plus grandes zones de l&#39;échantillon pour sélectionner des cellules ou des régions d&#39;intérêt. Il est recommandé d&#39;utiliser des temps d&#39;exposition courts (1-10 msec) et de faible puissance d&#39;excitation (0,1-1% transmission) lors de l&#39;analyse de l&#39;échantillon ou de trouver des cibles. </li><li> Identifier autophagosomes par GFP-LC3 fluorescence. Identifier les lysosomes par Alexa Fluor 555 anti-LAMP(Protéine de la membrane des lysosomes associée) et les noyaux des cellules en utilisant DAPI (échantillons fixes). </li><li> Choisissez conditions expérimentales dont la longueur d&#39;onde d&#39;excitation, zone d&#39;image (par exemple 512x512), l&#39;épaisseur de la pile, le temps d&#39;exposition, et le pourcentage de transmission laser. Pour des images super-résolues, vérifiez que l&#39;option d&#39;éclairage structuré est activée. Pour la microscopie de déconvolution sur l&#39;OMX, sélectionnez l&#39;option d&#39;éclairage conventionnel. </li><li> Pour obtenir les meilleurs résultats de reconstruction, sélectionner des conditions expérimentales telles que le nombre maximum d&#39;intensité se situe entre 10.000 et 15.000 lors de l&#39;acquisition. Si photoblanchiment est un sujet de préoccupation, l&#39;imagerie à une exposition plus faible (compte entre 5.000 et 10.000) peut être utilisé. Idéalement, les comtes ne doivent pas diminuer de plus d&#39;un facteur de deux au cours de l&#39;ensemble de l&#39;acquisition, et une diminution de plus d&#39;un facteur de quatre doivent être évités. Si nécessaire, réduire l&#39;épaisseur de la pile afin d&#39;assurer un comptage d&#39;intensité prolongée. La caméra sature à 64.000 points, de sorte maximumintensité ne doit jamais dépasser cela. Pour obtenir de bons échantillons, nous avons trouvé les conditions expérimentales être de 10 ~ 50 ms temps d&#39;exposition à la transmission de laser de 1%. Échantillons et lumineuses photostable qui peuvent être imagés à plusieurs reprises sont préférés. Une tache stable est nécessaire pour time-lapse, images super-résolues. </li><li> Pour réduire le bruit, la vitesse de lecture 95MHz (option de vitesse moyenne) et le temps d&#39;acquisition de 2 millisecondes ou plus est recommandée. Augmentation des artefacts sont obtenus dans le imagée reconstruit, lorsque l&#39;échantillon se déplace lors de l&#39;acquisition. Grâce à cet effet, de courtes expositions sont recommandés pour les cellules non adhérentes ou rapide. </li><li> imagerie multicanal peut être réalisée simultanément ou successivement. Rendements mode séquentiel moins diaphonie et est donc recommandé. </li><li> Pour réduire photoblanchiment, il est généralement recommandé d&#39;image avec des longueurs d&#39;onde d&#39;excitation premières (532 nm, 488 nm, puis 410 nm). Cependant, les résultats expérimentaux présentés dans la figure 3, cet ordre a été inverséd (soit 48 nm, 532 nm et 410 nm) due à la photostabilité de cet exemple particulier. </li><li> Définir la limite supérieure / inférieure de la Z-stack en déplaçant la platine du microscope jusqu&#39;à ce que le haut / bas des cellules est légèrement floue. La distance souhaitée entre chaque image doit être maintenu constant à 0,125 um pour l&#39;imagerie super-résolution, en tant que logiciel de reconstruction prendre cette valeur par défaut. </li><li> Reconstruire des piles d&#39;images à l&#39;aide de Softworx (Applied Precision, WA) et d&#39;analyser l&#39;utilisation Volocity 6.0 (Perkin Elmer, MA). </li></ol>

<ol>
	<li>Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+deiminase+as+a+novel+therapy+for+prostate+cancer+induces+autophagy+and+caspase-independent+apoptosis.">Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis.</a> Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).</li><li>Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+growth+inhibition+of+human+tumor+cells+in+culture+by+arginine+deiminase+purified+from+a+culture+medium+of+a+Mycoplasma-infected+cell+line.">Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line.</a> Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).</li><li>Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-tumor+activity+of+arginine+deiminase+from+Mycoplasma+argini+and+its+growth-inhibitory+mechanism.">Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism.</a> Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).</li><li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+by+self-digestion:+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy.">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).</li><li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion.">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li><li>Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).</li><li>Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+macroautophagy+by+mTOR+and+Beclin+1+complexes.">Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes.</a> Biochimie. 90, 313-323 (2008).</li><li>Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BH3-only+proteins+and+BH3mimetics+induce+autophagy+by+competitively+disrupting+the+interaction+between+Beclin+1+and+Bcl-2/Bcl-X(L).">BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L).</a> Autophagy. 3, 374-376 (2007).</li><li>Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRAM,+a+p53-induced+modulator+of+autophagy,+is+critical+for+apoptosis.">DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis.</a> Cell. 126, 121-134 (2008).</li><li>Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+distribution+of+argininosuccinate+synthetase+deficiency+in+human+cancers:+a+method+for+identifying+cancers+sensitive+to+arginine+deprivation.">Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation.</a> Cancer. 100, 826-833 (2004).</li><li>Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host &amp; Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations.">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li><li>York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Bien que l&#39;observation directe des cellules marquées avec des sondes fluorescentes contre LC3 est largement acceptée comme une méthode standard pour confirmer la réponse autophagic 6, l&#39;imagerie 3D quantitative du même système (comme nous l&#39;avons fait) fournit des informations sans précédent et les détails sur le processus complexe de l&#39;autophagie cellulaire . En particulier, nous observons que des centaines (voire des milliers) de autophagosomes dans les cellules vivantes sont formé...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine Deiminase (ADI)</td>
			<td>DesigneRx</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5890</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>4042</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-mouse 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21422</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-rabbit 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21244</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Lamp1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>H4A3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#3195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36936</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-1.5-1.4-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.1, 22 mm coverslip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#2865-22</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1324G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of autophagy using advanced 3d fluorescence microscopy

Cancer de la prostate est le plus grand sous forme de tumeurs malignes chez les hommes aux Etats-Unis Alors que la chirurgie comporte un risque important de l&#39;impuissance et l&#39;incontinence, les approches chimiothérapeutiques classiques ont largement échoué. L&#39;hormonothérapie est efficace à un stade précoce, mais échoue souvent avec le développement éventuel de tumeurs hormono-réfractaires. Nous sommes intéressés à développer des produits thérapeutiques ciblant déficience métabolique spécifique des cellules tumorales. Nous avons récemment montré que les cellules tumorales de la prostate n&#39;ont pas spécifiquement une enzyme (synthase argininosuccinate ou ASS) impliquée dans la synthèse de l&#39;arginine 1 acide aminé. Cette condition provoque les cellules tumorales de devenir dépendant de l&#39;arginine exogène, et ils subissent un stress métabolique lorsque arginine libre est épuisée par l&#39;arginine déiminase (DJA) de 1,10. En effet, nous avons montré que les cellules cancéreuses de la prostate de l&#39;homme CWR22 Rv1 sont effectivement tués par ADI à l&#39;apoptose caspase-indépendante et autopha agressifgy (ou macroautophagie) 1,2,3. L&#39;autophagie est un processus évolutif conservée qui permet aux cellules à métaboliser les protéines indésirables par répartition lysosomale durant la famine nutritionnel 4,5. Bien que les composantes essentielles de cette voie sont bien caractérisés 6,7,8,9, de nombreux aspects du mécanisme moléculaire sont encore mal connues - en particulier, quel est le rôle de l&#39;autophagie dans la mort-réponse des cellules cancéreuses de la prostate après traitement ADI ? Afin de répondre à cette question, nous avons demandé une méthode expérimentale pour mesurer le niveau et l&#39;ampleur de la réponse autophagie dans les cellules - et puisqu&#39;il n&#39;y a pas de marqueurs moléculaires connues qui peuvent suivre avec précision ce processus, nous avons choisi de développer une approche basée sur l&#39;imagerie, à l&#39;aide la microscopie à fluorescence 3D quantitative 11,12. Utiliser CWR22Rv1 spécifiquement les cellules marquées avec des sondes fluorescentes pour autophagosomes et des lysosomes, nous montrons que les piles d&#39;images 3D acquises soit avec wimicroscopie à déconvolution defield (et plus tard, avec des super-résolution, microscopie structuré-illumination) peut capturer clairement les premiers stades de l&#39;induction autophagie. Avec des applications d&#39;analyse d&#39;images numériques disponibles dans le commerce, nous pouvons facilement obtenir des informations statistiques sur nombre autophagosome et lysosome, la taille, la distribution, et le degré de colocalisation de n&#39;importe quelle cellule imagé. Cette information nous permet de suivre précisément l&#39;évolution de l&#39;autophagie dans les cellules vivantes et permet à notre enquête continue sur le rôle de l&#39;autophagie dans la chimiothérapie du cancer.

La séquence d&#39;image le montre la figure 1 montre les changements physiques qui se produisent dans les cellules CWR22 pendant les 80 premières minutes de l&#39;induction autophagie. Dans cette étude et d&#39;autres (non représenté), nous avons observé constamment: (1) le déplacement du noyau du centre de la cellule, (2) la réduction des points d&#39;adhésion focale, et (3) la translocation général de autophagosomes et des lysosomes vers le centre de la cellule. En outre, nous avons égalem...

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Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

L&#39;autophagie est un processus omniprésents qui permet aux cellules de se dégradent et recyclent des protéines et des organites. Nous appliquons la microscopie par fluorescence de pointe pour visualiser et quantifier les petits, mais les changements essentiels, physiques associés à l&#39;induction de l&#39;autophagie, y compris la formation et la distribution de autophagosomes et des lysosomes, et leur fusion dans autolysosomes.

Analyse quantitative de l&#39;autophagie en utilisant avancée Fluorescence Microscopy 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

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17.8K vues.  University of California, Davis. L'autophagie est un processus omniprésents qui permet aux cellules de se dégradent et recyclent des protéines et des organites. Nous appliquons la microscopie par fluorescence de pointe pour visualiser et quantifier les petits, mais les changements essentiels, physiques associés à l'induction de l'autophagie, y compris la formation et la distribution de autophagosomes et des lysosomes, et leur fusion dans autolysosomes.

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Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualisation simple complexes moléculaires In Vivo Utilisation avancée de microscopie par fluorescence

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

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Biologie

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitatives de fluorescence Live Cell-microscopie Analyse de la levure à fission

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Analyse quantitative des migrations au hasard des cellules en utilisant la microscopie vidéo time-lapse

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Analyse rapide et exploration de microscopie par fluorescence Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Analyse de l&#39;autophagie dans<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; À l&#39;aide de famine Pads en association avec microscopie de fluorescence

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

Identification des Kinesin-1 Cargos utilisant microscopie à fluorescence

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Open Source Content Haute Analyse Utilisant automatisé Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

Imagerie fonctionnelle des usines de Transcription virale à l’aide de la microscopie en Fluorescence 3D

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...