Cette méthode peut être utilisée pour aider les chercheurs à analyser et à compter les co-cultures de cellules à l’aide d’une analyse simple et efficace basée sur la zone. Cette technique est relativement facile à mettre en œuvre à l’aide de logiciels largement disponibles et offre un moyen fiable et précis d’identifier divers types de cellules dans un contexte de co-culture. Cette méthode peut fournir un aperçu de la façon dont des co-cultures spécifiques de cellules se synergisent pour aider à la régénération des tissus.
Cette méthode peut également être utilisée pour valider les études de biomarqueurs de monoculture. Pour commencer, cultivez 264,7 macrophages bruts à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour l’imagerie en monoculture dans un millilitre de DMEM complété par FBS, pénicilline-streptomycine, bicarbonate de sodium et bêta-mercaptoéthanol dans une fiole de culture cellulaire de cinq millilitres à une densité de 25 000 cellules par centimètre carré. Culture de cellules NIH/3T3 dans du DMEM complété par 10% FBS et 1% de pénicilline-streptomycine.
Pour l’imagerie par co-culture, culturez 264,7 macrophages bruts et fibroblastes NIH/3T3 en utilisant un milieu de co-culture contenant une partie de milieu brut 264,7 et une partie de milieu NIH/3T3 ensemble à des rapports variés et une densité totale de 25 000 cellules par centimètre carré. Après l’ensemencement, incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour atteindre une densité cellulaire viable de 80% de confluence cellulaire. Pour acquérir des images cellulaires à l’aide d’un microscope inversé équipé de l’objectif 40X, déterminez la capacité de l’algorithme à évaluer avec précision des images avec une gamme de qualités d’image.
Acquérez des images en niveaux de gris avec différents foyers produisant à la fois des images non bulbus et bulbus et exportez-les dans le fichier czi brut. Pour obtenir des images de cellules à l’aide de la méthode basée sur la zone, copiez et collez le fichier image pour analyse dans la corbeille et entrez le nom du fichier en exécutant la commande. Appuyez sur Exécuter pour démarrer le programme.
Analysez les images en ouvrant par reconstruction, puis en fermant par reconstruction à l’aide des fonctions source pour agrandir le premier plan à partir de l’arrière-plan en exécutant la commande correspondante. Pour binariser les images reconstruites à l’aide d’un système d’identification basé sur le centile, distinguez les cellules de l’arrière-plan en utilisant une différence de centile par rapport au pixel maximum pertinent avec la plus grande valeur de pixel comprenant au moins 0,5% d’une image donnée. Analysez et évaluez les valeurs de pixels pour les macrophages bruts 264,7, en vous assurant que les valeurs sont à moins de 4,5% du pixel maximum pertinent.
Marquez ensuite le pixel comme cellulaire. Pour les images contenant des profils de cellules bulbus, mettez en œuvre une procédure itérative pour corriger la binarisation erronée au centre des cellules. Déterminez une estimation initiale de la couverture cellulaire totale.
Exécutez l’algorithme et analysez les images en utilisant les estimations initiales d’alpha et de kappa pour remplir une partie des îles. Utilisez ensuite le nombre de cellules et la couverture post-analyse pour recalculer le kappa. Pour déterminer la surface moyenne des cellules après binarisation de l’image, obtenez un vecteur de tous les emplacements centraux et des rayons des cercles trouvés dans l’image en exécutant la commande.
Utilisez les rayons de sortie pour calculer la surface cellulaire moyenne en faisant la moyenne et analysez au moins 10 cellules pour assurer une identification précise de la zone. Effectuez l’analyse d’image à l’aide des commandes décrites précédemment. Ensuite, effectuez une analyse de co-cultures contenant des cellules brutes 264.7 et NIH/3T3 en déterminant expérimentalement un paramètre phi à l’aide d’images de cellules brutes 264.7 et NIH/3T3.
Devinez une valeur phi initiale et itérez jusqu’à ce que le nombre de cellules et la couverture correspondent étroitement aux comptes manuels spécifiques à la co-culture brute 264.7 et NIH / 3T3. Déterminer le nombre brut de 264,7 cellules dans la couverture cellulaire totale comme décrit précédemment pour les images de monoculture. Analysez à nouveau l’image transformée du bassin versant sans le paramètre phi, en détectant à la fois les macrophages et les fibroblastes.
Acquérir des données sur les fibroblastes NIH/3T3 en soustrayant sélectivement les pixels bruts de 264,7 cellules obtenus à l’aide des méthodes de seuilage standard et de quantification par zone décrites précédemment. L’analyse des macrophages bruts non bulbus 264,7 a été effectuée et les sorties de l’algorithme ont été enregistrées. Les calculs de surface moyenne de l’image à l’aide de l’algorithme ont compté 226 cellules, tandis qu’un comptage manuel a identifié 241 cellules avec une valeur d’erreur approximative de 6%L’analyse des macrophages bulbus raw 264,7 a également été effectuée.
Les calculs de surface moyenne de l’image à l’aide de l’algorithme ont compté 221 cellules, vérifiées par un comptage manuel de 252 cellules avec une valeur d’erreur approximative de 12%Analyse de co-cultures contenant à la fois 264,7 macrophages bruts et fibroblastes NIH / 3T3 a été effectuée. Les sorties de l’algorithme pour le nombre brut de macrophages 264,7 étaient de 137, tandis qu’un comptage manuel identifiait 155 cellules avec une valeur d’erreur approximative de 11% Pour déterminer la robustesse de l’algorithme de comptage des cellules, cinq images brutes de 264,7 macrophages ont été comptées par identification automatique des cellules et comptage manuel des utilisateurs. Le coefficient de dés a été obtenu avec un paramètre moyen de 0,85 sur cinq images.
L’étape critique de ce protocole est l’utilisation de paramètres basés sur le centile qui permettent une détection cellulaire robuste dans les images de monoculture et de co-culture. Ce protocole peut être utilisé pour identifier des cellules d’intérêt pour une analyse plus approfondie en utilisant des techniques de biologie moléculaire pour évaluer les biomarqueurs qui définissent des populations cellulaires spécifiques et le développement de biomarqueurs dans les systèmes de co-culture.
