Nous tenons à remercier le Dr Evan Newell et le Dr Sean Bendall des commentaires. Nous tenons également à remercier Sciences DEP et le Dr Sean Bendall pour un échantillon de billes de polystyrène multi-lanthanide contenant. Nous sommes reconnaissants pour le financement du NIH subvention de 2 U19 AI057229.

Tous les échantillons cellulaires pour la CyTOF doivent être fixées et perméabilisées. Cela permet une plus grande entrée de la intercalant d&#39;ADN contenant de l&#39;iridium, et empêche également la lyse des cellules pendant le lavage de l&#39;eau MilliQ et des mesures de remise en suspension immédiatement avant l&#39;injection dans le cytomètre de masse. 1. Démarrage de la cytomètre de masse <ol><li> Ouvrez le logiciel CyTOF. Sélectionnez Configuration de l&#39;instrument. Dans l&#39;onglet Cage carte, allez dans le coin en bas à droite et cliquez sur Chauffe bouton «ON». Allumer le chauffage au moins 15 minutes avant l&#39;heure souhaitée pour laisser suffisamment de temps pour le manteau chambre de pulvérisation pour atteindre 200 ° C. </li><li> Remplacez le blanc Norm-Ject seringue de 3 ml dans la seringue avec une seringue remplie d&#39;eau fraîche MilliQ. </li><li> Nettoyage du nébuliseur. Rincer l&#39;nébuliseur en utilisant la seringue et le tube de retirer 5% Citranox 2-3 fois à la fois par le port plus petit d&#39;introduction de liquide et le port de gaz plus important introduction. Répétez rinçage avec de l&#39;eau MilliQ to retirer Citranox résiduelle. </li><li> Vérifiez pour confirmer que les voyants sur le panneau avant de l&#39;CyTOF sont allumés comme dans la figure 1. </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig1.jpg" /> Figure 1. CyTOF voyants du panneau avant démarrage. <ol start="5"><li> Ouvrez le robinet de réservoir de gaz argon. Cela devrait provoquer la &quot;ARGON&quot; lumière sur le devant pour l&#39;allumer. </li><li> Fixez le nébuliseur au maquillage entrée de gaz. Dévissez le make-up raccord de tuyau de gaz et retirez le noir joint torique en caoutchouc et le blanc pièce conique en plastique. Noter la plus large &quot;articulation&quot; sur la tige de mise en place d&#39;orifice de gaz du nébuliseur. Placer le connecteur sur l&#39;orifice d&#39;introduction de gaz. Placer le joint torique noir sur l&#39;extrémité de l&#39;orifice de gaz, et forcer le joint torique passé la plus grande partie de la tige de port. Placer le blanc pièce conique en plastique sur le dessus avec l&#39;extrémité étroite souligné, et le visser sur le tube gaz d&#39;appoint. </li><li&gt; Fixer le nébuliseur à la tubulure d&#39;introduction de liquide. Soigneusement insérer le tube dans la petite ouverture à l&#39;extrémité du nébuliseur. Il y aura deux arrêts, semblables à se sentir à l&#39;arrêt sur une micropipette. Tout d&#39;abord, appuyez sur jusqu&#39;à ce que vous rencontrer de la résistance de la lumière; la fin du petit tube doit être à la fin de la section droite de verre. Deuxièmement, appuyer plus fort pour forcer la fin de la section droite de verre plus loin dans le raccord et serrez la vis de fixation à sceller. Insérer l&#39;extrémité du nébuliseur dans l&#39;ouverture de blanc dans le chauffe-ballon. </li><li> Dans l&#39;onglet Contrôleur RFG de la fenêtre de configuration de l&#39;instrument, appuyez sur &quot;Start plasma&quot;. Depuis le nébuliseur est déjà inséré, appuyez sur &quot;OK&quot;. Le logiciel se mettra en marche le refroidisseur, démarrer le flux de gaz et allumer un plasma. Le détecteur de tension augmentera progressivement. Il y aura une fenêtre pop-up disant &quot;Plasma séquence de démarrage est terminée avec succès&quot; lorsque vous avez terminé, appuyez sur &quot;OK&quot;. Nouvel éclairage devrait être sur le panneau avant (Figure 2 </strong<html> &gt;). </li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig2.jpg" /> Figure 2. Voyants du panneau de CyTOF après plasma enflammé et le démarrage réussi. <ol start="9"><li> Mise en marche de la pompe seringue. Dans le coin supérieur droit, appuyez sur le vert bouton &quot;play&quot; pour démarrer la pompe seringue et commencer à verser le liquide à travers le tube et la pulvérisation hors du nébuliseur. Les réglages par défaut sont seringues de 3 ml d&#39;eau. Pour que l&#39;échantillon soit circulant dans la boucle d&#39;échantillonnage, le pousse-seringue doit être changé périodiquement quand il est à court d&#39;eau. Dans la partie supérieure de l&#39;écran, il ya un compteur indiquant la quantité de liquide a coulé sur la pompe à seringue. La pompe à seringue s&#39;arrête lorsque ce compteur atteint &quot;3,000&quot; ou le plongeur atteint la fin de la seringue. Lors du remplissage de la seringue, vous devez cliquez sur &quot;stop&quot; plutôt que le bleu bouton &quot;pause&quot; pour réinitialiser le compteur. </li></ol>e &quot;&gt; 2. étalonnage quotidien du cytomètre de masse <ol><li> Le cytomètre de masse aura besoin d&#39;environ 20 minutes pour obtenir un chaud, un plasma stable avant l&#39;étalonnage. Le but de l&#39;incrément de fréquence est de maximiser le signal désiré de Tm169 ou Tb159 tout en gardant &quot;Gd155&quot; (oxyde; La139 + O16) signaux de moins de 3% de la valeur supérieure. Cliquez sur le bouton Acquisition Paramètres pour ouvrir la fenêtre des paramètres d&#39;acquisition de données. Dans l&#39;onglet analytes, cliquez sur le tableau périodique pour ouvrir le panneau de sélection des isotopes. Sélectionnez les isotopes présents dans la solution DVS Sciences réglage indiqué dans le manuel, puis cliquez sur &quot;Enregistrer&quot;. </li><li> Cliquez sur les isotopes Par Reading bouton pour ouvrir la Masse (s) Par la fenêtre de lecture. Sélectionnez &quot;impulsions de comptage&quot;, et redimensionnez l&#39;axe des y en entrant un nouveau numéro et en appuyant sur &quot;Entrée&quot;. </li><li> Remplissez un vert 1 ml Norm-Ject seringue avec une solution de réglage. Tournez le sélecteur de port à échantillon &quot;LOAD&quot;, injecter 450 ul de la solution mise au point, puis tourner le sélecteur sur &quot;INJECT&quot;. Dans l&#39;onglet Étalonnage selon la masse de l&#39;Acquisit données<html> ion fenêtre Paramètres, appuyez sur &quot;Exécuter&quot; pour contrôler les masses qui affluent par. Le côté gauche de la fenêtre est plus faible masse, tandis que le côté droit est plus élevée masse. Remarque: il y aura déjà des signaux dans la région TOF 9400-9800, en raison des isotopes de xénon dans le gaz d&#39;argon (figure 3). Attendez jusqu&#39;à ce que la solution de réglage isotopes commencent à apparaître sous forme de traînées de cet écran (figure 4). </li></ol><img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig3.jpg" /> Figure 3. Fenêtre de l&#39;onglet masse d&#39;étalonnage, indiquant les niveaux de fond pour les différents isotopes après la solution de lavage et de rinçage à l&#39;eau. La région autour de TOF 9400-9800 correspond aux isotopes de xénon dans le gaz argon, et doit toujours être présent. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . 4 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg &quot;/&gt; Figure 4. Fenêtre de l&#39;onglet masse d&#39;étalonnage, montrant des stries verticales pour divers isotopes en solution réglage DVS. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <ol start="4"><li> Retour à la page Masse (s) Par la fenêtre de lecture et appuyez sur le vert bouton &quot;Play&quot; dans le coin supérieur gauche. Chaque isotope sélectionné à l&#39;étape 2,1 est représentée par une ligne de couleur différente. La valeur par défaut est l&#39;axe des x &quot;Time&quot;, en sec. Surveiller les niveaux des différents isotopes jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient stables. </li><li> Réglage du courant. Dans l&#39;onglet Paramètres de la fenêtre des paramètres d&#39;acquisition de données, sélectionnez &quot;courant&quot; dans le menu déroulant. Commençons = 0, finition = 10 valeur de l&#39;étape = 0,5, temps de stabilisation = 200, et appuyez sur &quot;Enregistrer&quot;. Cliquez de nouveau sur l&#39;Masse (s) Par la fenêtre de lecture et appuyez sur Lecture. L&#39;axe des abscisses est maintenant &quot;en cours&quot;. Noter le cas des signaux du pic isotopes (figure 5), et r<html> ECORD. Sous l&#39;onglet Configuration du CAD canaux de la fenêtre de configuration de l&#39;instrument, faites défiler vers le bas pour &quot;Current&quot; et entrez la nouvelle valeur. Appuyer sur &quot;Set la valeur actuelle réelle&quot;, puis &quot;enregistrer&quot;. </li></ol><img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig5.jpg" /> Figure 5. Profil de réglage actuel. <ol start="6"><li> Réglage du gaz d&#39;appoint. Changer le menu déroulant de «gaz d&#39;appoint.&quot; Commençons = 0,55, fin = 0,95 valeur de l&#39;étape = 0,05, temps de stabilisation = 200. Appuyez sauver. Retour à la messe (s) par la fenêtre de lecture et appuyez sur Lecture. L&#39;axe des abscisses est maintenant «gaz d&#39;appoint&quot; débit. Enregistrer lorsque les signaux de la crête isotopes. Observez l&#39;augmentation rapide de la &quot;Gd155&quot; signal vers la fin (figure 6). Revenez à l&#39;onglet Configuration du CAD canaux, faites défiler jusqu&#39;à «gaz d&#39;appoint&quot;, et entrez la nouvelle valeur. Appuyer sur &quot;Set la valeur actuelle réelle&quot;, puis &quot;enregistrer&quot;. </li></ol>igure 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg &quot;/&gt; Figure 6. Make-up profil de réglage du gaz. <ol start="7"><li> Taux d&#39;enregistrement désiré isotope vs oxyde. Faire une deuxième injection de 450 pi de solution de tuning. Dans l&#39;onglet Paramètres, sélectionnez &quot;Time&quot; dans le menu déroulant, commençons = 0, fin = 10, valeur du pas = 1, le temps de stabilisation = 200. Appuyez sur &quot;Enregistrer&quot;. Cliquez sur &quot;play&quot; en Masse (s) Par la fenêtre de lecture. Après les lignes se sont stabilisés (Figure 7), utilisez le curseur pour lire la valeur dans les cases en haut à gauche pour Tm169 ou Tb159 (valeur supérieure) et aussi le &quot;Gd155&quot; valeur (&lt;3% de la valeur supérieure). Ces valeurs peuvent également être enregistrés dans un fichier de réglage pour référence future. </li></ol><img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig7.jpg" /> Figure 7. Mesure des intensités de réglage de solutions de signal après l&#39;optimisation de gaz actuelle et maquillage. <ol start="8"><li> Nettoyage de samboucle exemple. Injecter 3 ml d&#39;eau MilliQ à travers la boucle d&#39;échantillon, puis 500 ul de solution de lavage DVS. Surveiller la progression du nettoyage en appuyant sur &quot;Exécuter&quot; dans l&#39;onglet Etalonnage de masse. Lavez jusqu&#39;à ce que l&#39;intensité des raies (figure 4) commence à diminuer, puis suivez par 3 ml d&#39;eau MilliQ et le moniteur jusqu&#39;à ce que le bas des niveaux de fond (figure 3). </li></ol> 3. Des échantillons en cours d&#39;exécution <ol><li> Ouvrez la fenêtre d&#39;acquisition. Les paramètres par défaut: Do Analysis = On-The-Fly, Signal Analyser = double, d&#39;étalonnage comptage double = données. Réduction du bruit est activée. N&#39;importe lequel de ces peuvent être modifiées si nécessaire. Entrez le nom du fichier. Tous les fichiers doivent être enregistrés à l&#39;E :/ / lecteur. </li><li> Réglage des retards d&#39;acquisition. Il y aura un léger retard dans l&#39;enregistrement des événements cellulaires d&#39;environ 30 secondes en raison de la longueur du tuyau entre la boucle d&#39;échantillonnage et le nébuliseur. Par conséquent, la somme de «retard d&#39;acquisition&quot; et &quot;st détecteurretard capacité »doit être d&#39;au moins 30 secondes. retard stabilité détecteur doit être d&#39;au moins 20 sec. </li><li> Réglage de l&#39;heure de collecte de données. &quot;Le temps d&#39;acquisition&quot; représente le nombre de secondes que vous voulez exécuter votre échantillon. Remplissage de la boucle d&#39;échantillon entier 450 ul exigerait 600 sec pour terminer. Il est suggéré que 50-100 sec est ajouté à la fin de la durée de fonctionnement afin de minimiser l&#39;échantillon report. </li><li> La remise en suspension de l&#39;échantillon. Pour réduire au minimum l&#39;accumulation de sels dans la machine, il est suggéré qu&#39;au moins deux lavages dans de l&#39;eau MilliQ être fait à la fin de la coloration des cellules, suivie d&#39;une remise en suspension dans de l&#39;eau MilliQ finale. Le volume d&#39;eau MilliQ utilisé pour remettre en suspension le culot cellulaire varie en fonction du nombre de cellules que vous avez commencé avec la cellule et la récupération après la procédure de coloration entier. Un bon point de départ est 10 6 (départ) les cellules / ml. Après remise en suspension, filtrer à travers un tamis cellulaire pour éliminer les agrégats. </li><li> Échantillon de départ courir. Entrez un nouveau nom de fichier pour l&#39;échantillon courant.<html> Placez la vanne de boucle d&#39;échantillon sur «LOAD», injecter l&#39;échantillon, revenir à &quot;injecter&quot;, puis cliquez sur &quot;Exécuter&quot; dans la fenêtre d&#39;acquisition. </li><li> Enregistrement des événements cellulaires. Les cellules seront représentés dans la fenêtre aperçu que des collections de marques horizontales dans chaque isotope vertical / marqueur de voie (Figure 8). Alors que le cytomètre de masse peut enregistrer 1000 cellules / sec, une meilleure résolution entre les événements cellulaires est généralement obtenue à 300-500 cellules / sec. Cela correspond à une moyenne de ~ 1 cellule / rafraîchissement de l&#39;écran. Il peut prendre jusqu&#39;à 30 secondes avant que le compteur d&#39;événements cellule commence à monter. Cela est dû à «on-the-fly&quot; traitement des données; aucune informations sur les événements cellule est perdue. </li></ol><img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig8.jpg" /> La figure 8. Fenêtre d&#39;acquisition au cours de l&#39;échantillon en cours d&#39;exécution, montrant les lignes horizontales de points correspondant aux éléments associés à trois événements séparés de cellules.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir la figure. <ol start="7"><li> Qualité d&#39;événements cellulaires. Avis n&#39;importe quel fond de stries dans chaque canal isotopes, ainsi que le taux d&#39;événements cellule. Le cytomètre de masse reconnaît un «événement cellulaire» comme une certaine augmentation de signal au-dessus de fond, donc le signal de fond en métal libre ou non liée anticorps peut modifier l &#39;«événement cellule&quot; count. En outre, la course cellules à une concentration trop élevée peut causer une augmentation du nombre d&#39;événements doublet. Le fond peut être diminuée par des lavages supplémentaires ou de dilution plus grande cellule. Doublets peuvent être minimisés par une dilution plus grande cellule, au prix de temps d&#39;exécution accrue. </li><li> Finition échantillon acquisition de données. Lorsque le temps d&#39;acquisition a été atteint, la collecte des données se terminera. Il y aura un peu de retard devant une fenêtre pop-up avec un bouton &quot;OK&quot; apparaît de nouveau, cela est dû à «à la volée» de traitement des données. L&#39;acquisition de l&#39;échantillon peut également être arrêté Prematurely en cliquant sur le bouton &quot;Stop&quot;. Dans ce cas, tous les événements cellulaires déjà inscrits seront comptés et transformés en fichiers de sortie. </li><li> Injection d&#39;au moins 500 pi d&#39;eau MilliQ entre chaque échantillon permet également de minimiser contamination de l&#39;échantillon. </li></ol> 4. Nettoyage de la machine après utilisation <ol><li> La solution de lavage. Après que l&#39;échantillon final est réalisé et la boucle d&#39;échantillon rincé à l&#39;eau, injecter 450 pi de solution de lavage dans la boucle d&#39;échantillonnage. Surveiller la libération de métal libre dans l&#39;onglet Etalonnage de masse de la fenêtre d&#39;acquisition de données des paramètres comme à l&#39;étape 2.8 (figure 9). Lorsque le signal sans métal commence à diminuer, rincer avec 3 ml d&#39;eau MilliQ et surveiller jusqu&#39;à ce que les niveaux de fond sont atteints. </li></ol><img alt="Figure 9" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig9.jpg" /> Figure 9. Fenêtre de l&#39;onglet Masse de calibrage, au cours de l&#39;après-cycle de nettoyage avec la solution de lavage DVS. Les stries verticales dans la région TOF sont 9800-11000 anticorps-isotopes étiquette en cours de nettoyage de la machine. Les stries verticales autour TOF 11500 correspondent aux deux isotopes intercalant Ir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig9large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . 5. Arrêter la machine <ol><li> Dans l&#39;onglet Contrôleur RFG de la fenêtre de configuration de l&#39;instrument, sélectionnez &quot;Stop plasma&quot;. Lorsque la procédure est terminée, il y aura une fenêtre pop-up vous demandant de retirer le nébuliseur. Appuyez sur &quot;OK&quot;. Dans l&#39;onglet Cage carte, éteignez l&#39;appareil. Fermez le robinet de l&#39;alimentation d&#39;argon. </li><li> Retrait du nébuliseur. Retirer le nébuliseur de la chambre de pulvérisation en tirant doucement vers l&#39;arrière. Dévissez le tuyau d&#39;introduction d&#39;échantillon de 1,6 Step et mettre de côté. Dévissez le make-up de connexion d&#39;introduction de gaz pour desserrer légèrement, puis tirez le nébuliseur hors tension. Laissant le raccord vissé permettra de réduire les chances de lOsing le noir joint torique en caoutchouc et blanc pièce conique en matière plastique. </li><li> Nettoyage du nébuliseur. Backflush les deux ports du nébuliseur avec Citranox 5% en utilisant la seringue et des tubes comme à l&#39;étape 1.3. Couvrir et conserver au Citranox 5% jusqu&#39;à la prochaine utilisation. </li></ol>

<ol>
	<li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li><li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays.">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li><li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain.">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li><li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination.">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li><li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8++T+cell+phenotypes.">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li></ol>

Les auteurs travaillent tous les deux au Centre de surveillance immunitaire humain, un centre de service à l&#39;Université de Stanford qui perçoit des redevances d&#39;utilisation uniquement pour recouvrer le coût des analyses, y compris la cytométrie de masse.

Pour les dernières décennies, la cytométrie en flux par fluorescence a été une méthode bourreau de travail pour l&#39;analyse de cellules uniques, à la fois en termes d&#39;expression de surface et dans des tests fonctionnels. Cependant, les problèmes de chevauchement spectrales des colorants fluorescents a limité le nombre de marqueurs simultanées. Bien que les expériences qui utilisent plus de 12 marqueurs simultanées ont été signalés, le montant de la compensation nécessaire en fait techniquement diff...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> CyTOF TM masse cytomètre </td><td> Sciences DVS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solution de lavage </td><td> Sciences DVS </td><td> 201071 </td><td> 0,05% d&#39;acide fluorhydrique dans de l&#39;eau </td></tr><tr><td> Tuning solution </td><td> Sciences DVS </td><td> 201072 </td><td> 0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace d&#39;acide nitrique </td></tr><tr><td> Des billes de polystyrène contenant de l&#39;UE </td><td> Sciences DVS </td><td> 201073 </td><td> Contient naturelle de l&#39;abondance des isotopes de l&#39;UE; perles fournis à environ 1 million / ml </td></tr><tr><td> Multi-lanthanide contenant (La / Pr / Tb / Tm / Lu) - billes de polystyrène </td><td> Sciences DVS </td><td> Pas encore disponible dans le commerce </td><td> Contient naturelle de l&#39;abondance des isotopes de lanthanides cotées </td></tr><tr><td> L&#39;acide nitrique (concentré) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A467-500 </td><td> Optima oligo-métal pur ICP-MS de qualité </td></tr><tr><td> Polystyrène à fond rond tube avec crépine cellule-cap-5mL </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> utilisé pour filtrer des échantillons de cellules avant l&#39;injection </td></tr><tr><td> Norm-Ject tuberkulin seringue de 1 ml </td><td> Henke Sass Loup </td><td> 4010-200V0 </td><td> sans silicone, sans latex </td></tr><tr><td> Norm-Ject seringue 3 ml </td><td> Henke Sass Loup </td><td> 4010.000V0 </td><td> sans silicone, sans latex </td></tr><tr><td> De l&#39;eau MilliQ </td><td></td><td></td><td> Eau de 18 MQ pur; ne doivent pas être stockés dans bouteilles en verre ou en plastique qui ont été lavés avec un détergent commercial (en raison de leurs niveaux élevés de présence de baryum). </td></tr><tr><td> Citranox </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273236 </td><td> détergent acide </td></tr><tr><td> Gaz argon </td><td> Praxair </td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99,999% ultra haute pureté </td></tr></tbody></table>

mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a cytof mass cytometer

Ces dernières années, l&#39;analyse rapide de cellules individuelles a souvent été réalisée en utilisant la cytométrie en flux et des anticorps à marquage fluorescent. Toutefois, la question du chevauchement spectral d&#39;émission des fluorophores a limité le nombre de sondes simultanées. En revanche, le cytomètre de masse nouvelle CyTOF par des couples Sciences DVS un système d&#39;introduction de liquide à cellule unique à un ICP-MS. 1 Plutôt que de fluorophores, les polymères chélateurs métalliques contenant des isotopes hautement enrichi sont couplés à des anticorps ou d&#39;autres sondes spécifiques 2-5. En raison de la pureté du métal et de la résolution en masse du cytomètre de masse, il n&#39;existe pas de &quot;chevauchement spectral&quot; des isotopes voisins, et donc pas de nécessité pour les matrices de compensation. De plus, en raison de l&#39;utilisation de métaux lanthanides, il n&#39;y a pas d&#39;arrière-plan biologique et donc pas d&#39;équivalent de l&#39;autofluorescence. Avec une fenêtre de masse couvrant masse atomique 103-203, théoriquement jusqu&#39;à 100 étiquettes peuvent être distingués en même temps. Actuellement, Plus de 35 chaînes sont disponibles en utilisant les réactifs chélateur disponible à partir Sciences DVS, ce qui permet une dissection sans précédent du profil immunologique des échantillons. 6-7 Inconvénients de la cytométrie de masse comprennent l&#39;exigence stricte d&#39;un isotope métallique séparé par la sonde (pas d&#39;équivalent de la diffusion vers l&#39;avant ou sur le côté), et le fait qu&#39;il s&#39;agit d&#39;une technique destructrice (pas de possibilité de tri de récupération). La configuration actuelle du cytomètre de masse a également un taux de transmission de cellules de seulement ~ 25%, ce qui nécessite un nombre élevé de cellules d&#39;entrée. Optimal performance quotidienne de l&#39;cytomètre de masse nécessite plusieurs étapes. L&#39;objectif de base de l&#39;optimisation est de maximiser l&#39;intensité du signal mesuré des isotopes métalliques désirés (M), tout en minimisant la formation d&#39;oxydes (+16 M) qui va diminuer l&#39;intensité du signal M et interférer avec un signal désiré à M +16. La première étape consiste à chauffer la machine pour un climat chaud et stable, jeCP plasma a été mis en place. Deuxièmement, les paramètres de débit de gaz actuelle et le maquillage doit être optimisée sur une base quotidienne. Lors de la collecte de l&#39;échantillon, le taux cellulaire maximale événement est limitée par l&#39;efficacité du détecteur et de la vitesse de traitement de 1000 cellules / seconde. Toutefois, en fonction de la qualité de l&#39;échantillon, un taux plus lent cellule événement (300-500 cellules / seconde) est généralement souhaitable de permettre une meilleure résolution entre les événements cellules et donc de maximiser maillots intactes au cours des doublets et des débris. Enfin, un nettoyage adéquat de la machine à la fin de la journée contribue à réduire le signal de fond en raison de métal libre.

En suivant le protocole ci-dessus doivent accomplir quatre choses. Tout d&#39;abord, permettant échauffement adéquat du temps pour le cytomètre de masse produira une chaude, plasma stable nécessaire pour un signal optimal et la formation de l&#39;oxyde minime. Deuxièmement, lavage adéquat du cytomètre de masse avec de l&#39;eau MilliQ et la solution de lavage DVS (figure 9) aidera à réduire les niveaux de métal d&#39;adsorption à la tubulure et d&#39;autres parties de la machine, en aidant à...

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Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Les mesures nécessaires pour la syntonisation par jour et d&#39;optimisation de la performance d&#39;un cytomètre de masse CyTOF sont décrits. Commentaires sur la préparation optimale de l&#39;échantillon et le débit sont discutés

Cytométrie de masse: Protocole pour Tuning quotidien et échantillons cellulaires course sur un cytomètre de masse CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

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Bioengineering

22.7K vues.  Stanford University. Les mesures nécessaires pour la syntonisation par jour et d'optimisation de la performance d'un cytomètre de masse CyTOF sont décrits. Commentaires sur la préparation optimale de l'échantillon et le débit sont discutés

Vidéo: Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

Un protocole simple Hanging culture cellulaire pour la production chute de sphéroïdes 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Recherche

Bio-ingénierie

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

L&#39;extraction des lipides cellulaires pour ciblées dilution isotopique stable analyse de spectrométrie de masse chromatographie liquide-

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general relatively bulky and costly, making them less effective in the resource limited settings. To potentially address these limitations, we have recently demonstrated the integration of wide-field fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on cell-phones using compact, light-weight, and cost-effective opto-fluidic attachments. In our flow cytometry design, fluorescently labeled cells are flushed through a microfluidic channel that is positioned above the existing cell-phone camera unit. Battery powered light-emitting diodes (LEDs) are butt-coupled to the side of this microfluidic chip, which effectively acts as a multi-mode slab waveguide, where the excitation light is guided to uniformly excite the fluorescent targets. The cell-phone camera records a time lapse movie of the fluorescent cells flowing through the microfluidic channel, where the digital frames of this movie are processed to count the number of the labeled cells within the target solution of interest. Using a similar opto-fluidic design, we can also image these fluorescently labeled cells in static mode by e.g. sandwiching the fluorescent particles between two glass slides and capturing their fluorescent images using the cell-phone camera, which can achieve a spatial resolution of e.g. ~ 10 &mu;m over a very large field-of-view of ~ 81 mm2. This cell-phone based fluorescent imaging flow cytometry and microscopy platform might be useful especially in resource limited settings, for e.g. counting of CD4+ T cells toward monitoring of HIV+ patients or for detection of water-borne parasites in drinking water.

We review our recent results on the integration of fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on a cell-phone using compact and cost-effective opto-fluidic attachments. These cell-phone based micro-analysis devices might be useful for cytometric analysis, such as performing various cell counting tasks as well as for high-throughput screening of e.g., water samples in resource limited settings.

Champ large Microscopie fluorescente et cytométrie de flux fluorescente imagerie sur un téléphone portable

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Imagerie des tissus biologiques par désorption ionisation électrospray spectrométrie de masse

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Cellule structuration par photolithographie sur Défini Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrats

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

Exemple Stratégies Préparation de Spectrométrie de Masse Imagerie de culture cellulaire 3D Modèles

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

Isolation des droits de cellules primaires de tumeurs du côlon à partir de tissus chirurgicaux et les cultivant directement sur élastique souple substrats pour Traction cytométrie

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

A Protocol for Bioinspired Design: A Ground Sampler Based on Sea Urchin Jaws

Bioinspired design is an emerging field that takes inspiration from nature to develop high-performance materials and devices. The sea urchin mouthpiece, known as the Aristotle's lantern, is a compelling source of bioinspiration with an intricate network of musculature and calcareous teeth that can scrape, cut, chew food and bore holes into rocky substrates. We describe the bioinspiration process as including animal observation, specimen characterization, device fabrication and mechanism bioexploration. The last step of bioexploration allows for a deeper understanding of the initial biology. The design architecture of the Aristotle's lantern is analyzed with micro-computed tomography and individual teeth are examined with scanning electron microscopy to identify the microstructure. Bioinspired designs are fabricated with a 3D printer, assembled and tested to determine the most efficient lantern opening and closing mechanism. Teeth from the bioinspired lantern design are bioexplored via finite element analysis to explain from a mechanical perspective why keeled tooth structures evolved in the modern sea urchins we observed. This circular approach allows for new conclusions to be drawn from biology and nature.

A protocol for bioinspired design is described for a sampling device based on the jaws of a sea urchin. The bioinspiration process includes observing the sea urchins, characterizing the mouthpiece, 3D printing of the teeth and their assembly, and bioexploring the tooth structure.

Un protocole pour bioinspirée Conception: Rez-de-Sampler Basé sur Sea Urchin Jaws

Bioinspired design is an emerging field that takes inspiration from nature to develop high-performance materials and devices. The sea urchin mouthpiece, ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

Corps entier Spectrométrie de masse d&#39;imagerie par infrarouge laser assistée par matrice désorption Electrospray Ionisation (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In higher eukaryotes, paralogous genes can mask a potential phenotype by compensating the loss of a gene, thus limiting the information that can be obtained from genetic studies relying on single gene knockouts. We have developed a novel, rapid cloning method for guide RNA (gRNA) concatemers in order to create multi-gene knockouts following a single round of transfection in mouse small intestinal organoids. Our strategy allows for the concatemerization of up to four individual gRNAs into a single vector by performing a single Golden Gate shuffling reaction with annealed gRNA oligos and a pre-designed retroviral vector. This allows either the simultaneous knockout of up to four different genes, or increased knockout efficiency following the targeting of one gene by multiple gRNAs. In this protocol, we show in detail how to efficiently clone multiple gRNAs into the retroviral CRISPR-concatemer vector and how to achieve highly efficient electroporation in intestinal organoids. As an example, we show that simultaneous knockout of two pairs of genes encoding negative regulators of the Wnt signaling pathway (Axin1/2 and Rnf43/Znrf3) renders intestinal organoids resistant to the withdrawal of key growth factors.

This protocol describes the steps for cloning multiple single guide RNAs into one guide RNA concatemer vector, which is of particular use in creating multi-gene knockouts using CRISPR/Cas9 technology. The generation of double knockouts in intestinal organoids is shown as a possible application of this method.

Un protocole pour l&#39;élimination des gènes multiples dans les petits organoïdes intestinaux de souris à l&#39;aide d&#39;un concatériste CRISPR

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...