Ce travail a été financée (en partie) par la Fondation ISRAEL SCIENCES (Grant 399/11), par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dans le cadre de la coopération germano-israélienne Projet (DIP), et par l&#39;Institut de la famille Rappaport pour la recherche en des sciences médicales.

1. Génération de lignées cellulaires inductibles <ol><li> Avant l&#39;expérience on a besoin pour trouver la concentration minimale du médicament G418 qui tue toutes les cellules utilisées pour la préparation des lignées cellulaires souhaités. A cet effet, la plaque les cellules de choix dans plusieurs plaques en double à 70% de confluence dans le milieu qui sera utilisé lors de l&#39;expérience et d&#39;ajouter des concentrations croissantes de G418 (0-1,000 ug par ml). Surveiller les cellules quotidiens afin de déterminer la concentration minimale G418 qui tue les cellules de façon efficace. La mort cellulaire est observée dans les 3-7 jours. </li><li> Avant de génération de lignées cellulaires, il est recommandé de vérifier par des essais de transfection transitoire que le plasmide exprimant le shRNA peut réduire dans une certaine mesure l&#39;expression du gène à l&#39;étude. Cela peut être fait dans n&#39;importe quelle lignée de cellules qui peuvent être efficacement transfectées. </li><li> Plate T-Rex-293 cellules à une densité d&#39;environ 5x10 6 cellules par plaque de 10 cm dans 8 ml de milieu DMEM (contenant 10% de Tet sytige FBS approuvé, 2 mM de L-glutamine, 100 unités par ml de pénicilline et de la streptomycine 0,1 mg par ml, 5 mg par ml blasticidine). Incuber les plaques pendant une nuit à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Le lendemain, changer le milieu à 8 ml de milieu frais avant la transfection. </li><li> Transfecter les cellules en utilisant 10 mg de plasmide GFP + pSuperior.neo Acf1 (figure 1) de codage ou SNF2h shRNA dirigée par un promoteur inductible par la tétracycline H1, ainsi que le gène de résistance à la néomycine fusionnée à la GFP et entraîné par un promoteur constitutif PGK. Ajouter l&#39;ADN à 500 ul de 150 mM de NaCl. Ajouter le réactif jetPIE à une autre partie aliquote de 500 pl de 150 mM de NaCl à 2 l par ug d&#39;ADN. Ajouter la solution jetPIE à l&#39;ADN et bien mélanger au vortex. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Pipeter doucement complexes ADN sur les plaques de 10 cm contenant 70-80% des cellules confluentes. Remettre les plaques dans l&#39;incubateur. </li><li> Le lendemain, remplacer le milieu avec un milieu sélectif (milieu DMEM quedécrit ci-dessus contenant un supplément de 500 ug par ml de G418). </li><li> Pour les deux prochaines semaines surveiller les cellules et remplacer le milieu sélectif d&#39;une matière similaire frais tous les 3-4 jours jusqu&#39;à ce que les colonies apparaissent et peuvent être visualisées sans microscope. </li><li> Avant d&#39;isolement de colonies, de préparer des plaques 24 puits avec un milieu sélectif. </li><li> Identifier les colonies de l&#39;oeil, et marquer leur emplacement dans le bas de la plaque à l&#39;aide d&#39;un marqueur de couleur. Vérifiez sous le microscope que les colonies sont bien séparés. </li><li> Dans la hotte stérile, aspirer le support de la plaque, les rincer doucement avec du PBS chaud et aspirer ainsi tout le liquide restant. Ajouter 3 pi de 0,25% de trypsine / EDTA à une colonie sur la plaque. Pipeter la trypsine à plusieurs reprises jusqu&#39;à ce que les cellules se détacher et de les ajouter à l&#39;un des puits de la plaque 24-puits. Répétez cette opération pour plusieurs autres colonies sur la plaque. </li><li> Cultiver les cellules à 37 ° C, 5% CO 2 jusqu&#39;à remplir le puits. Puis diviser les cellules dérivées dechacune des colonies d&#39;origine dans trois puits, chacun dans un document distinct plaque de 12 puits et incuber pendant la nuit. </li><li> Le jour suivant, remplacez le support dans une plaque avec un milieu contenant 1 ug par ml de doxycycline à partir d&#39;une solution mère préparée dans de l&#39;eau bidistillée (1-5 mg par ml). Remplacer le milieu dans une plaque de commande avec un milieu sans doxycycline. Incuber les cellules pendant 72 heures à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Récolte des cellules de l&#39;une traitée et l&#39;autre non traité et de chaque clone de cellules pour la préparation des extraits protéiques et l&#39;analyse Western blot pour déterminer l&#39;efficacité de Acf1 ou knockdown SNF2h. Utiliser des anticorps à Acf1 ou SNF2h ainsi que des anticorps contre l&#39;alpha-tubuline, servant de témoin de charge. Utiliser les cellules dans le troisième puits, elle n&#39;est pas traitée, pour l&#39;expansion de clones de cellules sélectionnées dans laquelle la doxycycline outre conduit à au moins 50% de réduction dans le niveau de la protéine étudiée. Congeler des aliquotes de ces cellules dans 90% de FBS, 10% de DMSO pour une utilisation ultérieure. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Induction de knockdown et transfection <ol><li> Cellules de la plaque dans le milieu sélectif dans des plaques de 10 cm. Ajouter la doxycycline à 1 ug par ml de la moitié des plaques et incuber à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 48-72 heures (voir Figure 4). </li><li> Après 48-72 heures, trypsiniser les cellules de chaque groupe de cellules, les compter, et plaque 1.5x10 6 cellules par plaque de 6 cm dans le même milieu, avec ou sans doxycycline. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% CO 2 pendant la nuit. Plan de telle sorte que chaque groupe de plaques de la section 2.1 fournit les cellules pendant douze plaques 6 cm, dont deux doubles pour le dosage DAPI pour chaque point ainsi que d&#39;une plaque pour analyse par Western blot de chaque échantillon (voir figure 4). </li><li> Le jour suivant la transfection des cellules dans des plaques 6 cm avec les combinaisons suivantes de plasmides: 1 pg d&#39;un plasmide vide ou une quantité identique de l&#39;plasmide codant pour E4orf4, avec 4 pg d&#39;un vecteurexprimant la GFP ou Acf1-SNF2h-GFP rendues résistantes à la shRNA dans les clones cellulaires par introduction de mutations silencieuses, ou 3 pg du vecteur correspondant vide et 1 ug plasmide exprimant la GFP (figure 4). Utilisez le réactif jetPIE comme décrit plus haut (10 pi par 5 pg d&#39;ADN) pour préparer le mélange de transfection. Pour chaque échantillon, préparer un mélange de transfection pour trois plaques. </li><li> Après une incubation de 15 min de l&#39;ADN avec le réactif jetPIE à la température ambiante, doucement pipeter des quantités égales de complexes d&#39;ADN de chaque mélange de transfection sur trois plaques 6 cm et incuber à 37 ° C, 5% CO 2 pendant la nuit. </li></ol> 3. Essai DAPI dans les cellules transfectées <ol><li> Le lendemain, extraire des protéines d&#39;une plaque par échantillon pour analyse par Western blot pour déterminer que Acf1 ou SNF2h ont été efficacement renversé et que E4orf4 a été exprimée également dans les différents échantillons. </li><li> Aspirer le fluide à partir des plaques destinées à la DAPItest, lavez délicatement les plaques avec du PBS et ajouter 1 ml de paraformaldéhyde 4% préparée dans du PBS pour couvrir les cellules. Préparation de la solution de paraformaldéhyde et le traitement des cellules avec ce produit chimique doit être effectuée sous une hotte chimique. Incuber pendant 15 min à température ambiante sans agitation. </li><li> Aspirer le paraformaldéhyde et laver trois fois avec du PBS, se balançant à la température ambiante pendant 5 min à chaque fois. Ajouter l&#39;éthanol à 80% conservé à -20 ° C et incuber à 20 ° C pendant au moins 1 heure. Les plaques peuvent être maintenus sous l&#39;éthanol à -20 ° C pendant plusieurs jours dans la mesure où ils sont bien scellé pour empêcher l&#39;évaporation d&#39;éthanol et séchage. </li><li> Aspirer l&#39;éthanol et laver les cellules deux fois avec du PBS et une fois avec du PBS-BT (PBS contenant 0,5% de BSA et 0,05% de Tween-20), se balançant à la température ambiante pendant 5 minutes à chaque fois. </li><li> Pour empêcher la liaison d&#39;anticorps non spécifique, les cellules bloquer dans 1 ml de PBS-BT tampon contenant du sérum de chèvre à 10% pendant 20 min tout en basculant à température ambiante. Puis, lavez til cellules deux fois dans du PBS-BT, à 5 min à chaque lavage. </li><li> Incuber les cellules avec l&#39;anticorps primaire (un anticorps spécifique E4orf4 dans notre cas) dans 1 ml de PBS-BT pendant 1 heure tout en balançant à la température ambiante. Puis laver deux fois dans du PBS-BT et une fois dans du PBS contenant 0,1% de BSA, 5 min pour chaque lavage. </li><li> Incuber les cellules dans 1 ml de PBS-BSA 0,1% contenant le cas échéant d&#39;anticorps secondaire marqué par fluorescence et 0,5 ug par ml concentration finale de DAPI à 40 min tout en basculant à température ambiante dans l&#39;obscurité. Ensuite laver avec du PBS pendant 5 min, bien sécher par aspiration et maintenir les plaques à l&#39;envers pendant une heure supplémentaire ou toute la nuit pour obtenir un séchage complet. Ensuite, montez diapositives couverture sur les cellules, en utilisant Fluoromount-G solution. Conserver les plaques à 4 ° C dans l&#39;obscurité jusqu&#39;au moment de compter les noyaux apoptotiques. </li><li> Demandez à un collègue afin d&#39;identifier les différentes plaques par de nouveaux numéros, comptant noyaux apoptotiques dans les différents échantillons peut être fait d&#39;une manière impartiale. </li><li> Visualisez les cellules sous un upright microscope à fluorescence à un grossissement de 400X (dans l&#39;air) ou 630X (dans de l&#39;huile d&#39;immersion). Identifier les cellules transfectées qui sont colorées pour les différentes protéines exprimées dans chaque échantillon, et de compter le nombre de noyaux condensés ou fragmentés visualisés par coloration DAPI à l&#39;intérieur de la population de cellules transfectées. Surveiller plusieurs domaines et compter un total d&#39;au moins 200 cellules transfectées. </li><li> Calculer le pourcentage de noyaux avec une morphologie apoptotique au sein de la population de cellules transfectées. Répétez l&#39;expérience, avec des doublons, 2-3 fois pour calculer la signification statistique des changements entre les différents échantillons. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs L&#39;efficacité des colonies dans lesquelles l&#39;obtention knockdown conditionnelle de l&#39;expression du gène a été couronnée de succès est variable, en fonction du gène impliqué. Dans nos mains, nous avons obtenu 7 colonies succès sur 12 testées pour Acf1 et 6 sur 18 pour SNF2h. Figure 2 shux une plaque représentant des clones de cellules sélectionnées (Figure 2A), ainsi que d&#39;une colonie unique (figure 2B). Figure 3 montre un transfert représentant préparés avec des protéines extraites de cellules de différents clones cultivés en présence ou en l&#39;absence de la doxycycline pendant 72 heures. Le transfert a été colorées avec des anticorps à SNF2h et à l&#39;alpha-tubuline, servant de témoin de charge. Deux des clones (n ° 4 et 5) ont montré une forte diminution des niveaux d&#39;induction SNF2h sur la doxycycline. Il est à noter que bien que le plasmide GFP + pSuperior.neo (figure 1) utilisé pour la production de lignées cellulaires code pour une protéine de fusion GFP-néo, la fluorescence verte dans les lignées cellulaires stables était très faible et l&#39;expression d&#39;autres protéines de fusion GFP introduit de façon transitoire dans ces cellules pourrait être facilement détectée au-dessus de la fluorescence verte de fond. Une représentation schématique des expériences menées dans les clones cellulaires pour mesurerque l&#39;effet de Acf1 ou knockdown SNF2h sur la mort cellulaire induite par E4orf4 est montré dans la Fig. 4. Le temps nécessaire pour abattre l&#39;expression des gènes par la doxycycline peut varier en fonction de la stabilité de la protéine dont les niveaux devraient être réduits. Pour Acf1 et SNF2h, un traitement 72 heures a été nécessaire pour abattre efficace au niveau protéique. La figure 5 montre un exemple de cellules exprimant la GFP et E4orf4 et subissant une mort cellulaire se manifeste par l&#39;apparition de DAPI-noyaux colorés avec une morphologie condensé ou fragmenté. La figure 6 montre les résultats d&#39;une expérience représentative démontrant que la doxycycline induite Acf1 knockdown conduit à une augmentation de E4orf4 stimulée par la mort cellulaire (figure 6A). Cette augmentation ne résulte pas d&#39;une augmentation des niveaux de E4orf4 (figure 6B). Par ailleurs, la restauration de Acf1 aux cellules induites par la doxycycline réduit l&#39;augmentation de la toxicité E4orf4 aux niveaux<html> observée dans les cellules non induites (Figure 6). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1.jpg" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1highres.jpg"/> Figure 1. Carte du plasmide GFP + pSuperior.neo. La carte montre le promoteur H1 inductible par la tétracycline entraîner l&#39;expression shRNA et l&#39;expression promoteur PGK de conduite d&#39;une protéine de fusion GFP-néo. La carte a été adapté à partir du manuel OligoEngine pSuperior. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig2.jpg" /> Figure 2. Images d&#39;identification de colonies résistantes à la néomycine. D&#39;une plaque contenant des colonies (A) et d&#39;une colonie unique (B) sont affichées. Les colonies ont été obtenues par culture des cellules pendant 14 jours dans un milieu sélectif contenant de la néomycine. ys &quot;&gt; <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig3.jpg" /> Figure 3. Les cellules d&#39;examen de l&#39;efficacité knockdown dans les colonies sélectionnées. Plusieurs colonies de sélection en présence de néomycine ont été étalées dans des puits en double. Un puits de chaque échantillon a été induite par la doxycycline (+) et un puits a été laissée non traitée (-). Les protéines ont été extraites 72 h après l&#39;induction et chromatographie sur gel SDS-PAGE. Le Western blot a été coloré avec des anticorps successivement à SNF2h et à l&#39;alpha-tubuline (servant de témoin de charge) et montre les niveaux SNF2h dans les cellules induites et de contrôle. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig4.jpg" /> Figure 4. Planification d&#39;un essai typique expérience knockdown-DAPI. Étapes successives de l&#39;expérience sont présentés, y compris le traitement doxycycline pour atteindre Acf1 ou knockdown SNF2h, une transfection à restaurer Acf1 ou SNF2h expression ou d&#39;introduire un empté vecteur et d&#39;introduire E4orf4 ou son vecteur vide correspondant dans les cellules, et l&#39;analyse des résultats. Doxycycline traités plaques sont indiqués en rouge (Dox) et les plaques de contrôle sont marqués en bleu. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4442/4442fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig5.jpg" /> Figure 5. Les cellules de détection de la mort cellulaire induite par E4orf4 par le test DAPI. Qui ont subi divers traitements décrits dans la figure 4 ont été fixées et colorées avec des anticorps spécifiques de E4orf4 et DAPI pour visualiser les noyaux des cellules transfectées. Sur cette photo a été prise à partir d&#39;un échantillon contenant E4orf4 et la protéine GFP contrôle. (A) la GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) des images fusionnées. Les flèches blanches marque de GFP et E4orf4 cellules transfectées contenant des noyaux avec des morphologies apoptotiques. Les flèches rougesmarquer les noyaux avec des formes irrégulières qui ne sont pas comptés comme des noyaux apoptotiques. Les astérisques noyaux mitotiques marque ou noyaux qui viennent divisée. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig6.jpg" /> Figure 6. Acf1 knockdown améliore la mort cellulaire induite par E4orf4. (A) Les cellules de la lignée cellulaire T-rex-293-dérivée exprimant Acf1-shRNA partir d&#39;un promoteur inductible par la tétracycline ont été induites par la doxycycline (+ Dox) ou non traitée (-Dox). Trois jours plus tard, les cellules ont été transfectées avec des plasmides exprimant E4orf4 (+ E4orf4) ou un vecteur vide (-E4orf4) avec un vecteur vide ou un plasmide exprimant la GFP Acf1-étiqueté, qui a été rendu résistant à la shRNA par l&#39;introduction de silence mutations. Les cellules ont été fixées 24 heures après la transfection et colorées avec des anticorps pour E4orf4 et au DAPI. L&#39;induction de la mort cellulaire a été mesurée par le test DAPI décrit ci-dessus et le pourcentage of cellules transfectées avec des noyaux condensés ou fragmentés a été déterminée. Une expérience représentative de trois répétitions est affiché, et les barres d&#39;erreur représentent la déviation standard. (B) Les cellules de plaques parallèles ont été récoltés pour analyse par Western blot. Le transfert a été colorées avec des anticorps à E4orf4, la GFP, et Acf1. Le Acf1 endogène et Acf1-GFP sont présentés dans deux panneaux distincts.

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R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+suppression+of+tumorigenicity+by+virus-mediated+RNA+interference.">Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference.</a> Cancer. 2, 243-247 (2002).</li><li>Czauderna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+shRNA+expression+for+application+in+a+prostate+cancer+mouse+model.">Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model.</a> Nucleic acids research. 31, e127 (2003).</li><li>Matsukura, S., Jones, P. 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Virol. 75, 789-798 (2001).</li><li>Shtrichman, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+type+5+E4+open+reading+frame+4+protein+induces+apoptosis+in+transformed+cells.">Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells.</a> J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).</li><li>Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E4orf4+protein+interacts+with+both+Ba+and+B'+subunits+of+protein+phosphatase+2A,+but+E4orf4-induced+apoptosis+is+mediated+only+by+the+interaction+with+Ba.">Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B' subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba.</a> Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).</li><li>Galluzzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).</li><li>Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E4orf4,+a+novel+adenovirus+death+factor+that+induces+p53-independent+apoptosis+by+a+pathway+that+is+not+inhibited+by+zVAD-fmk.">E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk.</a> J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).</li><li>Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenovirus+E4orf4+protein+induces+growth+arrest+and+mitotic+catastrophe+in+H1299+human+lung+carcinoma+cells.">The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells.</a> Oncogene. 28, 390-400 (2009).</li><li>Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -. C., Robert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E4+open+reading+frame+4-induced+apoptosis+involves+dysregulation+of+Src+family+kinases.">Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases.</a> J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Knockdown de l&#39;expression génique spécifique est une approche importante pour l&#39;enquête de la contribution d&#39;une protéine de voies de régulation. Depuis knockdown de l&#39;expression constitutive de gènes essentiels affecte négativement la prolifération cellulaire, leur étude peut exiger soit l&#39;introduction transitoire de siRNA ou l&#39;application de systèmes stables knockdown conditionnelles. Génération de lignées cellulaires stables avec la capacité d&#39;origine médicamenteuse expressi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Glucose à haute DMEM </td><td> Gibco </td><td> 41965 </td><td></td></tr><tr><td> Tet système FBS approuvé </td><td> Clontech </td><td> 631106 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Pen Strep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% de trypsine-EDTA </td><td> Gibco </td><td> 25200 </td><td></td></tr><tr><td> T-rex-293 cellules </td><td> Invitrogen </td><td> R710-07 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma </td><td> A1720 </td><td></td></tr><tr><td> blasticidine </td><td> InvitRogen </td><td> R210-01 </td><td></td></tr><tr><td> pSuperior.neo + plasmide GFP </td><td> OligoEngine </td><td> VEC-PBS-0007/0008 </td><td></td></tr><tr><td> jetPIE </td><td> Transfection Polyplus </td><td> 101-40 </td><td></td></tr><tr><td> doxycycline </td><td> Sigma </td><td> D9891 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldéhyde </td><td> Sciences microscopie électronique </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) </td><td> Sigma </td><td> D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoromount-G </td><td> SouthernBiotech </td><td> 0100-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of cell-lines for conditional knockdown of gene expression and measurement of the knockdown effects on e4orf4-induced cell death

Inactivation fonctionnelle de l&#39;expression des gènes dans les cellules de mammifères est essentielle pour l&#39;étude de la contribution d&#39;une protéine d&#39;intérêt à 1,2 voies différentes. Toutefois, démontable conditionnelle de l&#39;expression du gène est nécessaire dans les cas où knockdown constitutif n&#39;est pas tolérée par les cellules pour une longue période de temps 3-5. Nous décrivons ici un protocole de préparation de lignées cellulaires permettant knockdown conditionnelle de sous-unités du facteur de remodelage de la chromatine ACF. Ces lignées de cellules de faciliter la détermination de la contribution de ACF à induction de la mort cellulaire par la protéine E4orf4 d&#39;adénovirus 6. Des séquences codant pour les ARN en épingle à cheveux courts pour les sous-unités et Acf1 SNF2h du facteur ACF remodelage de la chromatine ont été clonés à côté d&#39;un promoteur inductible par la doxycycline dans un plasmide contenant un gène également pour le gène de résistance à la néomycine. Clones de cellules résistantes à la néomycine ont été sélectionnées en présence de G418 et isolées. Les lignées de cellules résultants ont été induite partraitement par la doxycycline, et une fois Acf1 ou les niveaux d&#39;expression SNF2h ont été réduits, les cellules ont été transfectées avec un plasmide codant pour E4orf4 ou un vecteur vide. Pour confirmer l&#39;effet spécifique des constructions shRNA, la teneur en protéines Acf1 ou SNF2h ont été restaurés à des niveaux WT par co-transfection avec un plasmide exprimant Acf1 ou SNF2h qui ont été rendues résistantes à l&#39;shRNA par l&#39;introduction de mutations silencieuses. La capacité de E4orf4 pour induire la mort des cellules dans les différents échantillons a été déterminée par un dosage DAPI, dans lequel la fréquence d&#39;apparition des noyaux avec des morphologies apoptotiques dans la population de cellules transfectées a été mesurée 7-9. Le protocole décrit ici peut être utilisé pour la détermination de la contribution fonctionnelle des différentes protéines à l&#39;induction de la mort cellulaire par leurs partenaires protéiques dans les cas où knockdown constitutif peut être mortelle cellule.

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Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Contribution du facteur de remodelage de la chromatine ACF à la mort cellulaire induite par E4orf4 a été mesurée. Le protocole comprend la sélection de clones cellulaires dans lesquelles le traitement doxycycline induit knockdown conditionnelle de sous-unités ACF du Acf1 et SNF2h, et l&#39;utilisation du test DAPI pour mesurer la mort cellulaire induite par E4orf4 dans les lignées cellulaires inductibles.

Préparation de lignées cellulaires pour Knockdown conditionnelle de l&#39;expression génétique et évaluation des effets sacrifiés sur la mort cellulaire induite par E4orf4

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.9K vues.  Technion - Israel Institute of Technology. Contribution du facteur de remodelage de la chromatine ACF à la mort cellulaire induite par E4orf4 a été mesurée. Le protocole comprend la sélection de clones cellulaires dans lesquelles le traitement doxycycline induit knockdown conditionnelle de sous-unités ACF du Acf1 et SNF2h, et l'utilisation du test DAPI pour mesurer la mort cellulaire induite par E4orf4 dans les lignées cellulaires inductibles.

Vidéo: Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

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Biologie

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilisation du système d&#39;électroporation Gene Pulser MXcell à transfecter des cellules primaires à haut rendement

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Aide d&#39;un compteur de cellules automatisé pour simplifier les études d&#39;expression génique: Knockdown siRNA de l&#39;IL-4 dans l&#39;expression des gènes dépendant cellules Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Les articles inclus en paraffine et congelés de Drosophile</emMuscles adultes>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviraux médiée Knockdown cours Ex Vivo</emÉrythropoïèse> des cellules souches hématopoïétiques humaines

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

ARNi Mediated inactivation génique et la transgénèse par microinjection dans le nématode Necromenic Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

A major approach in the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of genes of interest in selected cell lines, with the aim to reveal one or several of the gene's function(s) using transient/stable overexpression or knockdown of the gene of interest. Unfortunately, for various cell biological investigations this approach is unsuitable when manipulations of gene expression result in cell growth/proliferation defects or unwanted cell differentiation. Therefore, researchers have adapted the Tetracycline repressor protein (TetR), taken from the E. coli tetracycline resistance operon1, to generate very efficient and tight regulatory systems to express cDNAs in mammalian cells2,3. In short, TetR has been modified to either (1) block initiation of transcription by binding to the Tet-operator (TO) in the promoter region upon addition of tetracycline (termed Tet-off system) or (2) bind to the TO in the absence of tetracycline (termed Tet-on system) (Figure 1). Given the inconvenience that the Tet-off system requires the continuous presence of tetracycline (which has a half-life of about 24 hr in tissue cell culture medium) the Tet-on system has been more extensively optimized, resulting in the development of very tight and efficient vector systems for cDNA expression as used here.
Shortly after establishment of RNA interference (RNAi) for gene knockdown in mammalian cells4, vectors expressing short-hairpin RNAs (shRNAs) were described that function very similar to siRNAs5-11. However, these shRNA-mediated knockdown approaches have the same limitation as conventional knockout strategies, since stable depletion is not feasible when gene targets are essential for cellular survival. To overcome this limitation, van de Wetering et al.12 modified the shRNA expression vector pSUPER5 by inserting a TO in the promoter region, which enabled them to generate stable cell lines with tetracycline-inducible depletion of their target genes of interest.
Here, we describe a method to efficiently generate stable human Tet-on cell lines that reliably drive either inducible overexpression or depletion of the gene of interest. Using this method, we have successfully generated Tet-on cell lines which significantly facilitated the analysis of the MST/hMOB/NDR cascade in centrosome13,14 and apoptosis signaling15,16. In this report, we describe our vectors of choice, in addition to describing the two consecutive manipulation steps that are necessary to efficiently generate human Tet-on cell lines (Figure 2). Moreover, besides outlining a protocol for the generation of human Tet-on cell lines, we will discuss critical aspects regarding the technical procedures and the characterization of Tet-on cells.

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

A rapid and simple way to generate human cell lines with inducible and reversible cDNA overexpression or shRNA-mediated knock-down of the gene of interest. This method enables researchers to reliably and highly reproducibly manipulate cell lines that are difficult to alter by transient transfection methods or conventional knockdown/knockout strategies.

Génération de lignées stables de cellules humaines avec inductible par la tétracycline (Tet-on) shRNA ou expression d&#39;ADNc

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well when a small number of genes are targeted for knockdown, large scale feeding screens show variable knockdown efficiencies, which limits their utility. We have deconstructed previously published RNAi knockdown protocols and found that the primary source of the reduced knockdown can be attributed to the loss of dsRNA-encoding plasmids from the bacteria fed to the animals. Based on these observations, we have developed a dsRNA feeding protocol that greatly reduces or eliminates plasmid loss to achieve efficient, high throughput knockdown. We demonstrate that this protocol will produce robust, reproducible knock down of C. elegans genes in multiple tissue types, including neurons, and will permit efficient knockdown in large scale screens. This protocol uses a commercially available dsRNA feeding library and describes all steps needed to duplicate the library and perform dsRNA screens. The protocol does not require the use of any sophisticated equipment, and can therefore be performed by any C. elegans lab.

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

While dsRNA feeding in C. elegans is a powerful tool to assess gene function, current protocols for large scale feeding screens result in variable knockdown efficiencies. We describe an improved protocol for performing large scale RNAi feeding screens that results in highly efficacious and reproducible knockdown of gene expression.

À grande échelle Gene Knockdown dans<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilisation ARNdb alimentation bibliothèques pour générer des phénotypes robustes perte de fonction

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

In Vivo transfection de siRNA et Gene Knockdown dans la moelle épinière via rapide non invasive lombaire intrathécale injections chez des souris

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...