Nous tenons à remercier tous les membres de notre laboratoire pour des discussions utiles. Nous remercions Joanna et Christina Lisztwan Gewinner pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le BBSRC BB/I021248/1 subvention et le Wellcome Trust est une subvention 090090/Z/09/ZAH Wellcome Research Trust carrière collègue de développement à l&#39;Institut du cancer UCL.

1. Clonage de pcDNA6_TetR_IRES_blast <ol><li> Comme le montre la figure 3, effectuez un condensé partielle du plasmide pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen) avec les enzymes de restriction Xba I et Nco I pour éliminer le gène TetR et le promoteur de la résistance blasticidine (BlastR) gène. Isoler le fragment de 4,6 kb vecteur. </li><li> Pour supprimer la séquence de polyadénylation du gène TetR, introduit par PCR un site Xho I immédiatement après le codon stop de l&#39;ADNc TetR tout en conservant le site Xba I à l&#39;extrémité 5 &#39;de l&#39;ADNc. Sous-cloner le fragment résultant dans pMigR1 17 en utilisant les enzymes de restriction Xbal et Xhol pour générer le plasmide pMigR1_TetR. </li><li> Digérer le vecteur pMigR1_TetR avec les enzymes de restriction Xba I et le Nco I pour libérer le fragment TetR_IRES. Isoler le fragment de 1,25 kb insert. </li><li> Ligaturer le 4,6 kb pcDNA6/TR et de 1,25 ko fragments TetR_IRES. Transform le produit de ligation dans E.coli compétentes et d&#39;identifier la construction pcDNA6_TetR_IRES_blast souhaité à l&#39;aide des techniques classiques de biologie moléculaire. </li></ol> 2. Génération de lignées cellulaires exprimant de façon stable TetR <ol><li> Au jour 1, semences 1x10 6 cellules par 10 cm de plaque de culture tissulaire en utilisant votre milieu de croissance standard (par exemple DMEM supplémenté avec 10% de SVF). Semences deux plaques, une pour la transfection avec pcDNA6_TetR_IRES_blast, et l&#39;autre en tant que témoin négatif pour la sélection blasticidine. Vérifiez que vous utilisez le plus possible le passage et le milieu de croissance recommandé. </li><li> Le jour 2, transfecter une plaque avec 2 ug de pcDNA6_TetR_IRES_blast utilisant Fugene 6 (E2691, Promega) selon les instructions du fabricant. Ne transfecter la seconde plaque. </li><li> Au jour 3, ajouter du milieu de croissance standard contenant 5 pg / ml blasticidine aux deux plaques. S&#39;il vous plaît noter que la concentration sélection optimale peut varier d&#39;une lignée cellulaire donnée et la puissance nEED à être déterminé à l&#39;avance. </li><li> Au jour 4, diviser les cellules à 1/5, 1/25, 1/50 et 1/100 en utilisant des plaques de 10 cm et milieu de croissance standard contenant 5 mg / ml blasticidine. Assurez-vous d&#39;étiqueter correctement les plaques contenant des cellules non transfectées ou transfectées. Préparer deux plaques à l&#39;étape de dilution. </li><li> Vérifiez cellules quotidien, veiller à ce que toutes les cellules sur les plaques non transfectées sont morts pendant la première semaine. Changer milieu de sélection tous les 2-3 jours. </li><li> Après 1-2 semaines, blasticidine colonies résistantes devraient commencer à apparaître. Sélectionner des plaques contenant de 5 à 50 colonies afin de s&#39;assurer que seules les colonies peuvent être récupérés. </li><li> Lorsque les colonies ont atteint un diamètre d&#39;environ 5 mm (ou plus), d&#39;isoler au moins 12 clones indépendants utilisant des cylindres de clonage pour ramasser des colonies isolées. Transférer chaque clone dans un puits séparé d&#39;une plaque de 24 puits de culture de tissu. Lorsque confluentes, diviser les cellules de chaque puits en un seul puits d&#39;une plaque à 6 puits de culture de tissu. </li><li> Continuer à cl cultureceux de milieux de sélection. Lorsque confluentes, les cellules divisées de chaque puits dans deux puits individuels d&#39;une plaque à 6 puits de culture de tissu. </li><li> Pour chaque clone à tester, ainsi geler une des cellules confluentes et les cellules de capture dans le puits pour les autres essais ultérieurs par immuno-empreinte. </li><li> Détecter TetR par Western blot en utilisant l&#39;anticorps monoclonal anti-TET02 anticorps (Mobitec GmbH). Oublier d&#39;inclure un lysat de la lignée cellulaire parentale comme contrôle négatif. </li><li> Sélectionnez 3 clones avec la plus haute expression TetR et développer chaque culture clonale. Geler les stocks de chaque clone prometteur dès que possible. Enfin, examinez les paramètres moléculaires et cellulaires biologiques d&#39;intérêt en comparant les lignées cellulaires parentales avec les clones exprimant TetR. Sélectionnez le &quot;meilleur&quot; clone avec la plus haute expression TetR qui n&#39;affiche pas de changements dans les paramètres moléculaires et cellulaires biologiques d&#39;intérêt. </li></ol> 3. Mise à l&#39;essai de PTER et pT-Rex DEST30 Vecteurs Exprimez-ment shRNA ou des ADNc, respectivement <ol><li> Générer pter plasmide avec inserts shRNA comme décrit 12. Construire pT-Rex DEST30 vecteur (12301-016, Invitrogen) contenant l&#39;ADNc d&#39;intérêt en utilisant la technologie de passerelle (Invitrogen). Dans le cas d&#39;expression d&#39;ADNc, plus de un pour l&#39;ADNc sera ultérieurement faciliter la détection de la protéine exprimée de manière exogène. </li><li> Transfecter de manière transitoire la ligne de mire des parents cellule avec PTER ou pT-Rex DEST30 plasmides shRNA (exprimant soit ou ADNc d&#39;intérêt) en utilisant le réactif de transfection de choix. Pour le test de plasmides d&#39;expression shRNA, assurer l&#39;efficacité de transfection élevées peuvent être obtenues. </li><li> Récolte des cellules transfectées et le processus d&#39;immunoblot en utilisant les anticorps appropriés, s&#39;attendant à détecter un épuisement ou la surexpression de votre gène d&#39;intérêt. </li></ol> 4. Génération de lignées cellulaires stables avec inductible par la tétracycline (Tet-on) Expression de shRNA ou d&#39;ADNc à l&#39;aide PTER ou pT-Rex DEST30 Vecteurs </p&gt; <ol><li> Au jour 1, semences 1x10 6 cellules de la «meilleure» TetR exprimant clone par plaque de 10 cm en utilisant votre milieu de croissance standard complétée par la tétracycline certifié exempt de sérum (par exemple pour FBS chez Invitrogen, 16000-014). Une plaque de semence pour la transfection avec pter (ou pT-Rex DEST30), et une plaque en tant que témoin négatif pour la double sélection. Assurez-vous d&#39;utiliser le moins possible le passage. </li><li> Le jour 2, transfecter une plaque avec 2 ug de PTER (ou pT-Rex DEST30) en utilisant Fugene 6. Ne transfecter la seconde plaque. </li><li> Au jour 3, ajouter du milieu de croissance standard contenant 5 pg / ml blasticidine et 500 pg / ml de zéocine (ou 1 mg / ml de G418). </li><li> Au jour 4, diviser les cellules à 1/5, 1/25, 1/50 et 1/100 en utilisant des plaques de 10 cm et milieu de croissance standard contenant 5 ug / ml blasticidine et 500 pg / ml de zéocine (ou 1 mg / ml G418). Préparer deux plaques à l&#39;étape de dilution. </li><li> Vérifiez les cellules quotidien, faire en sorte que dans la première semaine toutes les cellules sur les plaques non transfectées sont morts.Changer le milieu de croissance standard contenant blasticidine et la zéocine (ou G418) tous les 3-4 jours. </li><li> Après 2-3 semaines, blasticidine / zéocine (ou blasticidin/G418) double colonies résistantes devraient commencer à apparaître. Sélectionner des plaques contenant de 5 à 50 colonies de choisir des colonies isolées. </li><li> Lorsque les colonies ont atteint un diamètre d&#39;environ 5 mm (ou plus), utiliser des cylindres de clonage pour ramasser des colonies isolées. Isoler au moins 24 clones individuels. Transférer chaque clone dans un puits séparé d&#39;une plaque de 24 puits de culture de tissu. </li><li> Clones culture dans du milieu contenant des concentrations de maintenance de blasticidine (5 ug / ml) et la zéocine (250 pg / ml) [ou G418 (0,5 mg / ml)]. Lorsque confluentes, diviser les cellules de chaque puits en un seul puits d&#39;une plaque à 6 puits de culture de tissu. </li><li> Pour chaque clone à tester, diviser un confluent puits d&#39;une plaque à 6 puits dans trois puits individuels d&#39;une plaque à 6 puits. Lorsque confluentes, de geler les cellules d&#39;un puits. Utilisez les deux puits restants pour tester la tétracyclinee-expression inductible. Ajouter tétracycline à une concentration de 1 pg / ml à un puits, tout en laissant la tétracycline deuxième puits libre. </li><li> Après 24 à 96 h d&#39;incubation avec des cellules de tétracycline, la récolte et le processus d&#39;immunoblot en utilisant des anticorps appropriés. Réduction des temps d&#39;incubation tétracyclines sont recommandés lors du dépistage de l&#39;induction de l&#39;expression d&#39;ADNc, alors que des traitements plus longs tétracycline sera nécessaire pour déterminer shRNA médiée par l&#39;épuisement des protéines endogènes. </li><li> Sélectionnez au moins deux clones avec l&#39;épuisement désiré / surexpression et développer chaque culture. Geler les stocks de chaque clone prometteur dès que possible. En grandissant Tet-on clones pour des expériences assurez-vous toujours d&#39;utiliser des milieux supplémentés avec de la tétracycline sans sérum et les antibiotiques de sélection à des concentrations respectives de maintenance. </li></ol>

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R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li><li>McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. 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U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).</li><li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+gene+expression+using+a+stably+integrated,+inducible+small-interfering-RNA+vector.">Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector.</a> EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).</li><li>Hergovich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MST1+and+hMOB1+tumor+suppressors+control+human+centrosome+duplication+by+regulating+NDR+kinase+phosphorylation.">The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation.</a> Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).</li><li>Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome-associated+NDR+kinase+regulates+centrosome+duplication.">Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication.</a> Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).</li><li>Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+NDR/LATS+interactions+with+the+human+MOB+family+reveal+a+negative+role+for+human+MOB2+in+the+regulation+of+human+NDR+kinases.">Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases.</a> Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).</li><li>Vichalkovski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NDR+kinase+is+activated+by+RASSF1A/MST1+in+response+to+Fas+receptor+stimulation+and+promotes+apoptosis.">NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis.</a> Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).</li><li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr/abl-transduced+bone+marrow.">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous croyons que Tet-sur les systèmes facilitera grandement l&#39;analyse de la fonction des gènes, en particulier dans des systèmes cellulaires qui sont difficiles à manipuler et / ou lorsque le gène manipulé est essentielle à la survie cellulaire. En outre, la capacité de contrôler l&#39;expression des gènes très spécifiques par Tet-sur les systèmes offre la possibilité d&#39;étudier la fonction des gènes à des stades différents (par exemple lors de la progression du cycle cellulaire ou des processus...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Sérum foetal bovin (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> Testé sans Tet </td></tr><tr><td> Blasticidine </td><td> Invivogen </td><td> ant-bl-1 </td><td></td></tr><tr><td> Zéocine </td><td> Invivogen </td><td> ant-zn-5 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Laboratoires AAP </td><td> P31-011 </td><td> 100 mg / ml dans les milieux </td></tr><tr><td> anti-TET02 </td><td> Mobitec GmbH </td><td> TET02 </td><td> Utilisez à 1/1000-1/2000 de la BM </td></tr><tr><td> pcDNA6/TR </td><td> Invitrogen </td><td> V1025-20 </td><td></td></tr><tr><td> pT-Rex DEST30 </td><td> Invitrogen </td><td> 12301-016 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Tétracycline </td><td> Sigma </td><td> 87128 </td><td> 2 mg / ml dans de l&#39;éthanol </td></tr><tr><td> Doxycycline </td><td> Sigma </td><td> D9891 </td><td> 2 mg / ml dans de l&#39;eau </td></tr><tr><td> Cylindres de clonage </td><td> Bellco Glass Inc </td><td> 2090-00808 </td><td> réutilisables </td></tr></tbody></table>

generation of stable human cell lines with tetracycline-inducible (tet-on) shrna or cdna expression

Une approche majeure dans le domaine de la biologie cellulaire des mammifères est la manipulation de l&#39;expression de gènes d&#39;intérêt dans des lignées cellulaires sélectionnées, dans le but de révéler un ou plusieurs de la fonction du gène (s) en utilisant la surexpression transitoire / stable ou knockdown du gène d&#39;intérêt. Malheureusement, pour diverses enquêtes de cellules biologiques de cette approche ne convient pas lorsque les manipulations de résultat de l&#39;expression de gènes dans des cellules de croissance / prolifération de défauts ou de différenciation cellulaire indésirable. Par conséquent, les chercheurs ont adapté la protéine répresseur tétracycline (TetR), tiré de l&#39;E. résistance à la tétracycline coli opéron 1, de générer très efficaces et serré systèmes réglementaires pour exprimer des ADNc dans des cellules de mammifères 2,3. En bref, TetR a été modifié pour l&#39;initiation ou l&#39;autre bloc (1) de la transcription en se liant à l&#39;opérateur Tet-(A) dans la région du promoteur lors de l&#39;addition de tétracycline (Tet-off appelé système) ou (2) se lient à la TO en til absence de tétracycline (Tet appelée sur-système) (figure 1). Compte tenu de l&#39;inconvénient que le système Tet-off nécessite la présence continue de la tétracycline (qui a une demi-vie d&#39;environ 24 heures dans un milieu de culture des tissus cellulaires) Tet-le système a été plus largement optimisée, ce qui entraîne le développement des très serré et des systèmes de vecteurs efficaces pour l&#39;expression d&#39;ADNc utilisée ici. Peu de temps après l&#39;établissement de l&#39;interférence ARN (ARNi) pour abattre des gènes dans les cellules de mammifères 4, des vecteurs exprimant des ARN en épingle à cheveux court (shRNA) ont été décrits qui fonctionnent très similaire à siRNA 5-11. Cependant, ces approches knockdown shRNA médiées par la même restriction que les stratégies conventionnelles huitièmes de finale, puisque l&#39;épuisement stable n&#39;est pas possible lorsque les gènes cibles sont essentiels à la survie cellulaire. Pour contourner cette limitation, van de Wetering et al. 12 a modifié le shRNA vecteur d&#39;expression pSUPER 5 </su&gt; p en insérant un A dans la région promotrice, ce qui leur a permis de générer des lignées cellulaires stables avec inductible par la tétracycline épuisement de leurs gènes cibles d&#39;intérêt. Ici, nous décrivons une méthode pour générer efficacement humaine stable Tet-sur lignées cellulaires qui conduisent surexpression inductible de manière fiable l&#39;un ou l&#39;épuisement du gène d&#39;intérêt. En utilisant cette méthode, nous avons réussi à générer Tet-sur des lignées cellulaires a considérablement facilité l&#39;analyse de la cascade de MST / hMOB / NDR de 13,14 centrosome et l&#39;apoptose de signalisation 15,16. Dans ce rapport, nous décrivons nos vecteurs de choix, en plus de décrire les deux étapes consécutives de manipulation qui sont nécessaires pour générer efficacement des humains Tet-sur des lignées cellulaires (figure 2). Par ailleurs, outre décrivant un protocole pour la génération de l&#39;homme Tet-sur des lignées cellulaires, nous allons discuter des aspects critiques concernant les procédures techniques et la caractérisation des cellules Tet-on.

Un exemple pour la caractérisation initiale de l&#39;EPR-1 lignées cellulaires exprimant de façon stable TetR est illustré à la figure 4. Notez que tous les clones EPR-1 expriment différents niveaux de TetR (comparer les pistes 2 et 5), tandis que la lignée cellulaire parentale (qui sert de témoin négatif) n&#39;exprime pas la protéine exogène TetR (figure 4, ligne 1). Cette variation de l&#39;expression TetR entre RPE-1-Tet sur des clones de cellules est prévu, puisque l&#3...

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Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

Un moyen simple et rapide pour générer des lignées de cellules humaines avec inductible et réversible surexpression d&#39;ADNc ou shRNA médiée par le knock-down du gène d&#39;intérêt. Cette méthode permet aux chercheurs de lignées cellulaires de manière fiable et reproductible de manipuler très difficiles à modifier, par des méthodes classiques de transfection transitoire ou knock-down / KO stratégies.

Génération de lignées stables de cellules humaines avec inductible par la tétracycline (Tet-on) shRNA ou expression d&#39;ADNc

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

35.0K vues.  UCL Cancer Institute. Un moyen simple et rapide pour générer des lignées de cellules humaines avec inductible et réversible surexpression d'ADNc ou shRNA médiée par le knock-down du gène d'intérêt. Cette méthode permet aux chercheurs de lignées cellulaires de manière fiable et reproductible de manipuler très difficiles à modifier, par des méthodes classiques de transfection transitoire ou knock-down / KO stratégies.

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Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts of cell culture, and tend to acquire karyotypic abnormalities with high population doublings.  Proper passaging is essential for maintaining a healthy, undifferentiated, karyotypically normal HuES human embryonic stem cell culture.  First, an expanding culture is washed in PBS to remove residual media and cell debris, then cells are overlaid with a minimal volume of warm 0.05% Trypsin-EDTA.  Trypsin is left on the cells for up to five minutes, then cells are gently dislodged with a 2mL serological pipette.  The cell suspension is collected and mixed with a large volume of HuES media, then cells are collected by gentle centrifugation.  The inactivated trypsin media mixture is removed, and cells resuspended in pre-warmed HuES media.  An appropriate split ratio is calculated (generally 1:10 to 1:20), and cells re-plated onto a 1-2 day old plate containing a monolayer of irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells.  The newly seeded HuES culture plate is left undisturbed for 48 hrs, then media is changed every day thereafter.  It is important not to trpsinize down to a single cell suspension, as this increases the risk of introducing karyotypic abnormalities.

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin. Brought to you by JoVE.

HUES repiquage souches embryonnaires humaines lignées cellulaires à la trypsine

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts ...

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Biologie

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Génération de Stable elegans transgéniques C. Utilisation de microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Génération de l&#39;homme CD40-B activés cellules

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Isolement d&#39;ARN à partir de synthèse d&#39;ADNc embryonnaires Zebrafish et pour analyser l&#39;expression génique

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilisation du système d&#39;électroporation Gene Pulser MXcell à transfecter des cellules primaires à haut rendement

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Aide d&#39;un compteur de cellules automatisé pour simplifier les études d&#39;expression génique: Knockdown siRNA de l&#39;IL-4 dans l&#39;expression des gènes dépendant cellules Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for laboratory personnel. Pantropic lentiviruses, such as the commonly used VSV-G pseudotype, are a valuable tool for studying gene function because they can transduce many cell types, including non-dividing cells. However, researchers may wish to avoid production and centrifugation of pantropic viruses encoding oncogenes due to higher biosafety level handling requirements and safety issues. Several potent oncogenes, including c-Myc and SV40 large T antigen, are known to enhance production of induced pluripotent stem cells (iPSC). All other known iPSC-inducing genetic changes (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28, and p53 loss of function) also have links to cancer, making them of relatively high safety concern as well. 
While these cancer-related viruses are useful in studying cellular reprogramming and pluripotency, they must be used safely. To address these biosafety issues, we demonstrate a method for transduction of human cells with ecotropic lentivirus, with additional emphasis on reduced cost and convenient handling. We have produced ecotropic lentivirus with sufficiently high titer to transduce greater than 90% of receptor-expressing human cells exposed to the virus, validating the efficacy of this approach. 
Lentivirus is often concentrated by ultracentrifugation; however, this process takes several hours and can produce aerosols infectious to human biomedical researchers. As an alternative, viral particles can be more safely sedimented onto cells by complexation with chondroitin sulfate and polybrene (CS/PB). This technique increases the functional viral titer up to 3-fold in cells stably expressing murine retrovirus receptor, with negligible added time and cost. Transduction of human dermal fibroblasts (HDFs) is maximally enhanced using CS/PB concentrations approximately 4-fold lower than the optimal value previously reported for cancer cell lines, suggesting that polymer concentration should be titrated for the target cell type of interest. We therefore describe the use of methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) to assay for polymer toxicity in a new cell type. We observe equivalent viability of HDFs after viral transduction using either polymer complexation or the standard dose of polybrene (PB, 6 &mu;g/ml), indicating minimal acute toxicity.
In this protocol, we describe the use of ecotropic lentivirus for overexpression of oncogenes in human cells, reducing biosafety risks and increasing the transduction rate. We also demonstrate the use of polymer complexation to enhance transduction while avoiding aerosol-forming centrifugation of viral particles.

Lentiviruses are a valuable research tool for exploring gene function; however, researchers may wish to avoid production of pantropic lentivirus encoding known or suspected oncogenes. As an alternative, we present a safer protocol for use of ecotropic lentivirus on human cells modified to express the ecotropic receptor mSlc7a1.

Transduction des cellules humaines avec des polymères complexés Lentivirus écotrope pour Enhanced biosécurité

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for ...

Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various pathways1,2. However, conditional knockdown of gene expression is required in cases when constitutive knockdown is not tolerated by cells for a long period of time3-5. Here we describe a protocol for preparation of cell lines allowing conditional knockdown of subunits of the ACF chromatin remodeling factor. These cell lines facilitate the determination of the contribution of ACF to induction of cell death by the adenovirus E4orf4 protein6. Sequences encoding short hairpin RNAs for the Acf1 and SNF2h subunits of the ACF chromatin remodeling factor were cloned next to a doxycycline-inducible promoter in a plasmid also containing a gene for the neomycin resistance gene. Neomycin-resistant cell clones were selected in the presence of G418 and isolated. The resulting cell lines were induced by doxycycline treatment, and once Acf1 or SNF2h expression levels were reduced, the cells were transfected with a plasmid encoding E4orf4 or an empty vector. To confirm the specific effect of the shRNA constructs, Acf1 or SNF2h protein levels were restored to WT levels by cotransfection with a plasmid expressing Acf1 or SNF2h which were rendered resistant to the shRNA by introduction of silent mutations. The ability of E4orf4 to induce cell death in the various samples was determined by a DAPI assay, in which the frequency of appearance of nuclei with apoptotic morphologies in the transfected cell population was measured7-9.
The protocol described here can be utilized for determination of the functional contribution of various proteins to induction of cell death by their protein partners in cases when constitutive knockdown may be cell lethal.

Contribution of the ACF chromatin remodeling factor to E4orf4-induced cell death was measured. The protocol includes selection of cell clones in which doxycycline treatment induces conditional knockdown of the ACF subunits Acf1 and SNF2h, and use of the DAPI assay to measure E4orf4-induced cell death in the inducible cell lines.

Préparation de lignées cellulaires pour Knockdown conditionnelle de l&#39;expression génétique et évaluation des effets sacrifiés sur la mort cellulaire induite par E4orf4