Les auteurs sont très reconnaissants à RJ Sommer et X Wang pour l&#39;aide aux micro-injection, ainsi que des commentaires perspicaces de la évaluateurs anonymes. Ce travail est soutenu par le NIH octroi SC2GM089602.

1. La transgénèse: préparation de l&#39;ADN <ol><li> Dominantes de co-injection de marqueur: pRL3 [PPA-PRL-1 (tu92)] Le plasmide pRL3 est une dominante de co-injection de marqueur pour identifier visuellement des événements de transformation réussie. Ce plasmide codant pour un allèle dominant mutant (tu92) du gène de la PPA-PRL-1 étroitement lié à la SQT-1 du gène du collagène en C. elegans et transforme le mode de locomotion de type sauvage dans le sens horaire sinusoïdale mouvements de torsion le long du corps du ver axe 1,5. L&#39;animal transformé est très similaire au marqueur de sélection dominant populaires rol-6 (su1006) utilisés en C. elegans pour les 20 dernières années. </li><li> Reporter cible transgène: PPA-EGL-4p:: gfp Un gène d&#39;intérêt peut être lié transcriptionnellement ou translation d&#39;une séquence codante GFP 9. Dans cette étude, le PPA-EGL-4promoter:: GFP (EGL-4, cGMP protéine kinase dépendante) was utilisés pour déterminer si un fragment de 2 kb en amont du début de la traduction peut conférer expression de la GFP dans P. pacificus PS312. Ce vecteur GFP contient une région de codage avec la GFP modifiées introns et la polyvalente PPA-RPL-23 3 &#39;UTR Terminator 5 aimablement fournies par Xiaoyue Wang et Ralf J. Sommer (Institut Max-Planck, Tübingen, Allemagne, Union européenne). </li><li> L&#39;ADN génomique: PS312 L&#39;ajout de type sauvage P. l&#39;ADN génomique pacificus PS312 est nécessaire pour obtenir l&#39;héritage transgène stable, en particulier à partir transgéniques animaux F 1 F 2 à leur progéniture 5. Il n&#39;est pas encore certain si l&#39;ADN génomique des formes complexes supplémentaires tableaux chromosomiques avec les deux transgènes (le marqueur de co-injection PRL-3 et le PPA-EGL-4p:: rapporteur GFP) similaires à ceux observés dans les stables F 2 lignes transgéniques dans C. elegans 3. Toutefois, l&#39;obligation d&#39;avoir l&#39;ADN génomique et de partager des transgènes Identicasurplombe l cohérent suggère fortement la formation de complexes extra-chromosomiques tableaux les cellules hôtes peuvent reconnaître pour la transmission de l&#39;ADN appropriée (ADNg préparés en utilisant Sigma G1N10 kit). </li><li> Digestion de l&#39;ADN Les enzymes de restriction sont utilisées pour linéariser le PPA-EGL-4p:: gfp vecteur d&#39;ADN et de produire des surplombs collante compatible avec le marqueur de la co-injection et le PS312 pRL3 ADNg. Mélanger en tapotant et non vortex. Incuber pendant une heure à 37 ° C. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> pRL3 </td><td> 4 ug </td></tr><tr><td> 10xbuffer </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> PstI (10 U / pl) </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 100 uL </td></tr><tr><td> PPA-EGL-4p:: gfp </td><td> 4 ug </td></tr><tr><td> Tampon 10x </td&gt; <td> 10 ul </td></tr><tr><td> Sali (10 U / pl) </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> ADNg PS312 </td><td> 10 ug </td></tr><tr><td> Tampon 10x </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> Pst I et Sal I (10 U / pl) </td><td> 8 pl </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 100 ul </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Mélange pour enzyme de restriction Digest. <ol start="5"><li> Précipitation d&#39;ADN et la préparation <ol><li> Ajouter l&#39;acétate de sodium 01:10 (3 M NaCOOCH 3 pH 5,2) et 2.5X le volume d&#39;éthanol à 100% pour le produit à digérer; ajouter 20 ng / l de glycogène pour voir granulés faciles. </li><li> Centrifuger à14000 rpm pendant 15 minutes à 4 ° C. </li><li> Décanter le surnageant par basculement lentement le tube de centrifugeuse à l&#39;envers et puis en tapant sur un mouchoir en papier, en s&#39;assurant que la pastille est sécurisé dans le coin inférieur du tube et libre de l&#39;éthanol. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;éthanol à 75%. </li><li> Immédiatement tournent à 14000 rpm pendant 5 minutes à 4 ° C. </li><li> Décanter le surnageant par inclinant lentement le tube à centrifuger à l&#39;envers et puis en tapant sur un mouchoir en papier en vous assurant que le culot fixez au coin au fond du tube et libre de l&#39;éthanol. </li><li> Culot sec dans la centrifugeuse sous vide à 14 000 rpm pendant 5 minutes à 25-30 ° C, jusqu&#39;à ce que sec et totalement exempt de l&#39;éthanol. </li><li> Ajouter 30 ul de TE ou stériles dH 2 O et laisser une nuit à 4 ° C avant de brièvement mélangeant avec un vortex. </li><li> Le tableau 2 décrit comment créer le mélange d&#39;injection de chaque ADN purifié pour l&#39;injection. </li><li> Conserver à -20 ° C. Après décongélation le mélange dansprojection, ralentit le tube à 14 000 rpm pendant 5 minutes pour débarrasser les particules de débris qui peuvent obstruer l&#39;aiguille d&#39;injection. </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Le matériel génétique </td><td> Concentration </td></tr><tr><td> PPA-EGL-4p:: GFP (Sali) </td><td> &gt; 5 ng / pl (0.1-10ng/μl) </td></tr><tr><td> pRL3 (Pst) </td><td> &gt; 1 ng / pl </td></tr><tr><td> ADNg PS312 (Pst + Sali) </td><td> &gt; 60 ng / ul </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 30 pl </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Mélange de PPA-PRL-1 par injection 2. Interférence ARN: In vitro, la synthèse à double brin d&#39;ARN <ol><li> Utilisez PCR pour amplifier le gène d&#39;intérêt. RHL091 5&#39;-agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC-3 &#39;(Site BamHI) et 5&#39;-RHL092 tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG-3 &#39;(site PstI) ont été utilisées pour amplifier un fragment pb 464 génomique (position 3-466) à partir du vecteur pRL3 contenant du PPA-PRL-1 (tu92) allèle. </li><li> Recueil du produit de PCR avec BamHI et PstI. </li><li> Ligaturer le fragment à BamHI / PstI digérés pL4440 nourrir ARNi vecteur 2. </li><li> Transformer le vecteur inséré dans des cellules compétentes et de les cultiver sur des plaques d&#39;ampicilline milieu LB (50 pg / ml). </li><li> Sélectionnez le vecteur succès inséré par PCR utilisant les amorces T7. </li><li> Utilisez le T7 flanqué produit PCR contenant le gène PRL-1 pour faire l&#39;ARN double brin ARNdb) utilisant le bloc-IT ARNi synthèse kit (Invitrogen). </li><li> La concentration ARNdb est le meilleur si&gt; 200 ng / ul, jusqu&#39;à 1 pg / pl pour l&#39;injection. </li><li> Conserver à -20 ° C. Après décongélation le mélange pour injection, ralentit le tube à 14 000 rpm pendant 5 minutes pour éliminer les particules de débris qui pourraient obstruer les injectiol&#39;aiguille n. </li></ol> 3. Microinjection: protocole pour l&#39;injection des transgènes et / ou ARNdb <ol><li> Aiguilles d&#39;injection <ol><li> Réglez l&#39;aiguille Narishige extracteur (modèle #: PC-10) de température: <ol><li> Tournez le bouton en bas à «Heater No.2». </li><li> Tournez le &quot;Adj chauffage n ° 2.&quot; bouton jusqu&#39;à ce panneau de lit de 55,0 à 60,0 ° C pendant pointe de l&#39;aiguille effilée de longueurs variables. </li></ol></li><li> Tournez le bouton du bas du dos à la &quot;Etape 1&quot; (tire l&#39;aiguille en une seule étape). </li><li> Chargez l&#39;aiguille dans la chambre et assurez-vous qu&#39;il soit sécurisé. </li><li> Appuyez sur le bouton &quot;Démarrer&quot; (bouton rouge) et permettre à l&#39;aiguille d&#39;être tiré avec tous les poids (ce qui devrait faire deux aiguilles identiques dans des directions opposées). </li><li> Retirez l&#39;aiguille de la chambre et le ranger dans une plaque de culture en plastique maintenu en place par Play-Doh pour empêcher la poussière de s&#39;accumuler sur les aiguilles. </li></ol></li><li> Tapis de montage <ol><li> Dans un tube à centrifuger de 1,5 ml, faire une solutio Agar 2% Noblen en ajoutant 0,02 g d&#39;agar Noble à 1 ml d&#39;H 2 O. L&#39;agar peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu&#39;à un an. </li><li> Bien mélanger et faire fondre la gélose dans un bloc thermique mis à&gt; 88 ° C </li><li> Utiliser une micropipette 1 ml, placer une goutte de liquide Agar Noble 2% au milieu de la lame de verre (Fisher, 12-544-F). </li><li> Aplatir en plaçant une autre lame de verre sur le dessus de la goutte. </li><li> Répéter «Étape Drop&quot; jusqu&#39;à ce qu&#39;il y est une couche de cinq lames de verre. </li><li> Retirez chaque lame de verre en faisant glisser les lames de verre mutuellement. </li><li> Dry aplatir pad gélose sur des lames de verre dans un four sous vide à 70 ° C pendant 4 heures à une nuit (ou à température ambiante pendant la nuit). </li><li> Faire coussinets d&#39;injection multiple et de stocker pour une utilisation future. </li></ol></li><li> Microinjection dans les gonades hermaphrodites </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig1.jpg" /> Figure 1. Un dessin schématique de la P. pacificus anatnomie. Les cellules nucléées sont claires cellules germinales femelles (ovocytes) et la partie grisée est l&#39;intestin. Une seule gonade antérieure distale est montré, mais un préavis de deux gonades distale se croisent dorsalement vers la mi-corps. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig2.jpg" /> Figure 2. Images de microinjection. (A) La pointe de l&#39;aiguille d&#39;injection est en discussion avec la ligne droite de la pièce tiré capillaire. En touchant légèrement la pointe de l&#39;aiguille pour que le bord, la pointe de l&#39;aiguille se brise, tout en conservant une pointe acérée. (B) Les inserts aiguille dans le haut des gonades juste au-dessus de la courbure intestinale pour la première injection. (C) Les inserts aiguille dans le bas juste en dessous de la gonade la courbure intestinale pour la deuxième injection. <ol start="3"><li><ol><li> Assurez-vous que le contraste et la mise en cisaillement DIC est idéal pour visualiser les gonades hermaphrodites. </li><li> Charge de 1,0 à 2,0 ul de mélange par injection dans le tirécapillaires aiguille. </li><li> Placez l&#39;aiguille dans le manipulateur microinjection; jauges de pression du réservoir d&#39;azote devrait être fixé à des conditions idéales (10-20 psi pour 0,5 à 1 sec.) </li><li> Cassez le bout de l&#39;aiguille en le touchant légèrement à bord d&#39;un tube mince tiré capillaire placé sur une lame (figure 2A). <ol><li> Aiguille glisser disjoncteur: la partie la plus fine d&#39;un capillaire tiré placé sur une lame de verre dans une goutte d&#39;huile </li></ol></li><li> Une fois l&#39;aiguille est cassée il peut être lieu à une position de ralenti lorsque vous choisissez votre ver au pad (P. pacificus ont une fenêtre de 5 minutes pour injection avant qu&#39;elles sèchent et meurent-out). </li><li> Utiliser une assiette pleine de vers adultes J4-jeunes, versez l&#39;huile de paraffine suffisante (lourd) pour juste couvrir tous les vers dans OP50 tapis bactérien. </li><li> Choisissez un ver et le placer sur le pavé d&#39;injection. </li><li> Placez la lame de verre avec le ver sur le microscope, la position du ver gonades en direction de l&#39;aiguille et la vulve loin de la nécessitéLe (figure 2B, 2C). </li><li> Abaissez l&#39;aiguille à la position de la vue microscope. </li><li> Position de la gonade en haut et l&#39;aiguille dans le même plan focal (figure 2B). </li><li> Poke délicatement le ver et la pompe d&#39;injection dans le mélange; ooctyes séparant vers l&#39;extrémité distale indiquent une injection réussie (Pour optimiser transgène ou la livraison ARNdb, vous devriez voir lors de l&#39;injection d&#39;une vague d&#39;expansion dans la gonade qui se poursuit jusqu&#39;à ce qu&#39;elle soit proche de l&#39;extrémité distale pourboire). </li><li> Repositionner l&#39;aiguille pour injecter de la baisse des gonades et injection de rappel, mais puisque cette gonade est sous l&#39;intestin la propagation des ovocytes ne sera pas visible et est donc plus difficile à réaliser (figure 2C). </li><li> Normale vers la recherche indique une injection réussie après l&#39;injection, il n&#39;y devrait pas y avoir endommagé les gonades (saillie hors de la vulve ou sauté à l&#39;intérieur de la cavité du corps). </li><li> Placez le dos aiguille dans la position de ralenti. </li><li> Préparer pour sauver le ver. </li><li> Ajouter unbaisse de (0,5 pi) de tampon M9 sur le coussin où le ver injecté est placé. </li><li> En utilisant certains OP50 bactéries sur votre choix, appuyez sur la vis sans fin avec l&#39;OP50, et il devrait s&#39;en tenir. Nous n&#39;utilisons pas pipeter à la bouche. </li><li> Placez le ver sur la plaque ensemencée avec 50 points pl d&#39;OP50, 2-4 vers peuvent être sauvés sur ces plaques. </li></ol></li><li> Post-injection de stockage et de dépistage pour la transgénèse <ol><li> Boutique injecté vers (P 0) à 20 ° C pendant environ 4 jours pour pondre des oeufs et de grandir F 1. </li><li> Les vers l&#39;écran le quatrième jour d&#39;phénotype sélectionné (Pour l&#39;écran de transgénèse, recherche d&#39;animaux de roulement exprimant le PPA-PRL-1 marqueur dominant). </li><li> Choisissez célibataire indépendant F 1 &#39;animaux s avec le phénotype observé à de nouvelles semé la plaque et les conserver à 25 ° C; cette température favorise la formation de lignées stables de F 1&#39; s. </li><li> Simple F 2 F 1 à partir indépendante lignes. Individuelles F 2 </subLignes&gt; ont les mêmes taux de transmission du transgène. Nous avons souvent d&#39;obtenir&gt; 15 F 2 lignes par transformée F 1 animal. </li><li> Boutique générations suivantes à 25 ° C. </li><li> Le taux de transmission de rouleaux demeure habituellement constant après la F 4 générations, il est donc nécessaire à ce moment de déterminer le niveau d&#39;expression du transgène cible (PPA-EGL-4p:: GFP) pour chaque ligne. Expression de la GFP peut ne pas corréler avec le degré de pénétrance du phénotype rouleaux dominante. </li></ol></li><li> Post-injection de stockage et de dépistage des phénotypes ARNi <ol><li> Boutique injecté vers (P 0) à 20 ° C pendant environ 4 jours pour déposer et de grandir F 1. </li><li> Ecran F 1 vers le quatrième jour de phénotype sélectionné (Pour l&#39;écran pour phénotype knockdown ARNi, la recherche de phénotypes pénétrant qui peuvent être associés à la perte de l&#39;activité du gène cible, dans notre cas, la perte du PPA-PRL-1 phénotype). </li><li> Dans notre expérience, le phénotype knockdown non rouleau est perdu dans&gt; 97% de la F 2. </li></ol></li></ol> 4. Les résultats représentatifs: 1. Résultat de la transgénèse <table border="1"><tbody><tr><td> Session </td><td> Injecté P 0 </td><td> F 1 Rouleaux </td><td> % Transgénique F 2 </td><td> % De transmission moyen après 2 F </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 60 </td><td> 2 </td><td> (Ligne 1) 0% (Ligne 2) 13% </td><td> NA 13% ± 10 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 40 </td><td> 1 * </td><td> (Ligne 3) 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> (Ligne 4) 0% </td><td> NA </td&gt; </tr><tr><td> 5 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> (Ligne 5) 26% </td><td> 22% ± 10 </td></tr></tbody></table> * Un rouleau mâle qui n&#39;a pas franchi; NA: Non applicable Résultats Tableau 3 du PS312 injecté avec PPA-EGL-4p.:: GFP (Sal I digéré), pRL3 (rouleau) (Pst I digéré), et ADNg PS312 (PstI et Sali digéré). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig3.jpg" /> La figure 3 (A) de type sauvage (B, C) ​​Une écurie F 4 pRL3; PPA-EGL-4p.:: GFP lignée transgénique montrant la tête neurone GFP expression. 2. Résultat de l&#39;interférence ARN <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig4.jpg" /> Figure 4. ARN injecté PRL-1 mutantsmontrent knockdown complète de &quot;rouler&quot; la locomotion (A). PRL-1 rouleau de gain-de-fonction mutant tu92. (B) «knock down» PRL-1 de type sauvage présentent une posture mutant normale et la locomotion. (C) injecté PRL-1 (bas) a également plus de corps que PRL-1 mutante (en haut). (D) Le corps d&#39;injection plus PRL-1 (bas) est également plus long que le PS312 type sauvage (en haut). Le phénotype plus le corps a également été observée dans le rol-5 (SQT-1) knockdown ARNi de C. elegans N2 (données non présentées). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> rouleau </td><td> non-roll </td></tr><tr><td> Un PRL-1 ARNdb (200 ng / pl) </td><td> 13 </td><td> 21 </td></tr><tr><td> B PRL-1 ARNdb (1000 ng / pl) </td><td> 9 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> de contrôle </td><td> 20 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tableau 4. </strong&gt; Résumé des PPA-PRL-1 injections ARNdb. (A) [ARNdb] = 200 ng / l; (B) [ARNdb] = 1000 ng / ul. P = 0,0019 et 0,041 par le test exact de Fisher, deux queues, pour 200 et 1000 injections ng / ul, respectivement.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Populations de P. pacificus sont trouvés en association étroite avec diverses espèces de scarabées dans le monde et est un nématode modèle intermédiaire entre vivre libre et les nématodes parasitaires. La force du P. pacificus comme un organisme modèle émergent réside dans l&#39;intégration de ses cartes génétiques et physiques qui favorisent la cartographie de positionnement des mutants isolés de impartiale écrans avant génétique (c&#39;est à dire pas seulement pour les gè...

<table border="1"><tbody><tr><th> Produit: </th><th> Catalogue #: </th><th> Fournisseur: </th></tr><tr><td> DMI3000 microscope à injection </td><td> DMI3000 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Manipulateur microinjecteur (entraînement direct) </td><td> Conjointe Narashige BC-Ball 3 </td><td> Tritech recherche </td></tr><tr><td> Extracteur d&#39;aiguilles </td><td> Narashige PC-10 </td><td> Tritech recherche </td></tr><tr><td> Microinjecteur ™ All-numérique multi-pression du système </td><td> Narashige MINj-D </td><td> Tritech recherche </td></tr><tr><td> GeneElute ™ ADN génomique des mammifères Miniprep Kit </td><td> G1N70 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> pJet Clonage Jet Kit </td><td> K1231 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> GeneJET plasmide Miniprep kit </td><td> K0502 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> DNA Clean &amp; concentrateur ™ </td><td> D4005 </td><td> Zymo recherche </td></tr><tr><td> BLOC-IT ™ ARNi TOPO ® kit de transcription </td><td> K3500-01-0 &amp; K36501 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Difco ™ Agar Noble </td><td> DF0142-15-2 </td><td> Fisher Scientifi </td></tr><tr><td> Couvercle en verre de microscope (1,5 - 0,19 mm d&#39;épaisseur 0,16 à; Taille: 50 x 45mm) </td><td> 12 à 554-F </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Capillaires en verre (filament) </td><td> 615000 </td><td> Systèmes AM </td></tr><tr><td> Huile de paraffine (Lourd) </td><td> O122-1 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> P386-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> AC20651-5000 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BP3581 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> M80-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr></tbody></table>

rnai mediated gene knockdown and transgenesis by microinjection in the necromenic nematode pristionchus pacificus

Bien qu&#39;il soit plus abordable pour les organismes modèles émergents d&#39;obtenir les génomes entièrement séquencés, encore en profondeur la fonction des gènes et des analyses d&#39;expression par interférence ARN et de transgénèse stables restent limitées dans de nombreuses espèces en raison de l&#39;anatomie particulière et moléculaire biologie cellulaire de l&#39;organisme. Par exemple, en dehors de la couronne de Caenorhabditis groupe qui comprend trois Caenorhabditis elegans, de façon stable transmis lignées transgéniques chez les non-Caenorhabditis espèces n&#39;ont pas été signalés dans ce phylum spécieuse (Nematoda), à l&#39;exception de Strongyloides stercoralis 4 et 5 Pristionchus pacificus. Pour faciliter l&#39;expansion du rôle de P. pacificus dans l&#39;étude du développement, l&#39;évolution et le comportement 6-7, nous décrivons ici les méthodes actuelles d&#39;utiliser la micro-injection pour rendre les animaux transgéniques et inactivation de gènes par RNAi. Comme les gonades des <em&gt; C. elegans et la plupart d&#39;autres nématodes, les gonades de P. pacificus est syncytial et capable d&#39;incorporer de l&#39;ADN et l&#39;ARN dans les ovocytes sont envoyés par micro-injection directe. Contrairement à C. elegans Cependant, l&#39;héritage transgène stable et expression somatique dans P. pacificus nécessite l&#39;ajout d&#39;ADN génomique digéré par les endonucléases auto complémentaire à l&#39;extrémité des transgènes cibles et des marqueurs co-injection 5. L&#39;ajout de l&#39;ADN génomique porteuse est similaire à l&#39;exigence de l&#39;expression du transgène dans le Strongyloides stercoralis 4 et dans les cellules germinales de C. elegans. Toutefois, il n&#39;est pas clair si l&#39;exigence spécifique de l&#39;ADN des animaux génomiques propres parce que P. pacificus soma est très efficace à réduire au silence non complexes multi-copie des gènes ou que les tableaux extrachromosomique dans P. pacificus nécessitent séquences génomiques pour l&#39;assemblage kinétochore correcte lors de la mitose. La migration ventrale de l&#39;(deux arméesdidelphic) gonades hermaphrodites complique encore plus la capacité d&#39;injecter deux gonades dans les vers individuels 8. Nous démontrons également l&#39;utilisation de micro-injection d&#39;un mutant dominant knockdown (rouleau, tu92) en injectant l&#39;ARN double brin (ARNdb) dans les gonades d&#39;obtenir non roulants F 1 progéniture. Contrairement à C. elegans, mais comme la plupart des autres nématodes, P. pacificus PS312 n&#39;est pas réceptif à l&#39;ARNi systémique via l&#39;alimentation et le trempage et donc ARNdb doivent être administrés par microinjection dans les gonades syncytial. Dans cette étude, nous espérons pour décrire le processus de microinjection nécessaires pour transformer un promoteur PPA-EGL-4:: Un journaliste de fusion GFP et démontable d&#39;un rouleau dominante PRL-1 (tu92) mutant dans un protocole visuel informatif.

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RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Dans les organismes modèles, la transgénèse permet de manipuler les fonctions des gènes tandis ARNi peut knockdown transcrits d&#39;ARNm spécifiques 1-2. Ce protocole vise à illustrer les techniques nécessaires pour introduire de l&#39;ADN transmis de façon stable et transitoire ARN double brin dans le nématode necromenic<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt; Pour des études en biologie évolutive, de développement et de comportement.

ARNi Mediated inactivation génique et la transgénèse par microinjection dans le nématode Necromenic Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

rnai-mediated-gene-knockdown-transgenesis-microinjection-necromenic

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

16.4K vues.  California State University. Dans les organismes modèles, la transgénèse permet de manipuler les fonctions des gènes tandis ARNi peut knockdown transcrits d'ARNm spécifiques 1-2. Ce protocole vise à illustrer les techniques nécessaires pour introduire de l'ADN transmis de façon stable et transitoire ARN double brin dans le nématode necromenic Pristionchus pacificus Pour des études en biologie évolutive, de développement et de comportement.

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Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to perturb gene expression patterns in selected segments of leech embryos, leaving the untreated segments as internal controls.
The pneumatic capillary gun can be used to reach internal layers of cells at early stages of development without opening the specimen. As a method for localized introduction of substances into living tissues, the biolistic delivery with the gun has several advantages: it is fast, contact-free and non-destructive. In addition, a single capillary gun can be used for independent delivery of different substances. The delivery region can have lateral dimensions of ~50-150 &#181;m and extends over ~15 &#181;m around the mean penetration depth, which is adjustable between 0 and 50 &#181;m. This delivery has the advantage of being able to target a limited number of cells in a selected location intermediate between single cell knock down by microinjection and systemic knockdown through extracellular injections or by means of genetic approaches.
For knocking down or knocking in the expression of the axon guidance molecule Netrin, which is naturally expressed by some central neurons and in the ventral body wall, but not the dorsal domain, we deliver molecules of dsRNA or plasmid-DNA into the body wall and central ganglia. This procedure includes the following steps: (i) preparation of the experimental setup for a specific assay (adjusting the accelerating pressure), (ii) coating the particles with molecules of dsRNA or DNA, (iii) loading the coated particles into the gun, up to two reagents in one assay, (iv) preparing the animals for the particle delivery, (v) delivery of coated particles into the target tissue (body wall or ganglia), and (vi) processing the embryos (immunostaining, immunohistochemistry and neuronal labeling) to visualize the results, usually 2 to 3 days after the delivery.
When the particles were coated with netrin dsRNA, they caused clearly visible knock-down of netrin expression that only occurred in cells containing particles (usually, 1-2 particles per cell). Particles coated with a plasmid encoding EGFP induced fluorescence in neuronal cells when they stopped in their nuclei.

In this video, we show a procedure for an accurate biolistic delivery of reagents into live tissue with a novel miniature gene gun. We are knocking down the expression of the axon guidance molecule Netrin in leech embryos by delivering molecules of dsRNA into the ventral body wall and ganglia of single segments.

Localisé ARNi et l&#39;expression des gènes extra-utérine dans la sangsue médicinale

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

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Biologie

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection d&#39;embryons de poissons zèbres pour analyser la fonction génique

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Aide d&#39;un compteur de cellules automatisé pour simplifier les études d&#39;expression génique: Knockdown siRNA de l&#39;IL-4 dans l&#39;expression des gènes dépendant cellules Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

Livraison bactérienne de l&#39;ARNi Effectors: Transkingdom ARNi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

L&#39;activation de l&#39;apoptose par micro-injection cytoplasmique du cytochrome C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviraux médiée Knockdown cours Ex Vivo</emÉrythropoïèse> des cellules souches hématopoïétiques humaines

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Agrobacterium induite par le virus Assay Gene Silencing En Coton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion rate. This method can be used to obtain a better understanding of the process of diuresis in insects and is especially useful in the study of diuresis in blood-feeding arthropods that are able to take up huge amounts of liquid in a single blood meal. 
This RNAi-mediated gene knockdown combined with an in vivo diuresis assay was developed by the Hansen lab to study the effects of RNAi-mediated knockdown of aquaporin genes on Aedes aegypti mosquito diuresis1. 
The protocol is setup in two parts: the first demonstration illustrates how to construct a simple mosquito injection device and how to prepare and inject dsRNA into the thorax of mosquitoes for RNAi-mediated gene knockdown. The second demonstration illustrates how to determine excretion rates in mosquitoes using an in vivo bioassay.

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

In this protocol we combine RNAi-mediated gene silencing with an in vivo diuresis assay to study the effects knockdown of genes of interest has on mosquito fluid excretion.

Inactivation génique médiée par ARNi et<em&gt; In Vivo</emEssai diurèse&gt; Femmes adultes<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Les moustiques

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

La délétion de gènes dans le génome entier<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Par PCR à haut débit

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

En utilisant l&#39;ARN médiée par la stratégie d&#39;alimentation interférences à l&#39;écran pour des gènes impliqués dans le règlement de la taille du corps du nématode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...