Ce protocole peut être utilisé pour évaluer l’intégrité et la plasticité d’une jonction neuromusculaire dans des conditions normales et pathologiques. Cette technique permet d’étiqueter simultanément les cellules de Schwann et les animaux de laboratoire pré et post sur des sections musculaires uniques. Après avoir euthanasié le rat mâle adulte, placez le rat dans le capot et ouvrez la cavité thoracique pour accéder au cœur à l’aide de ciseaux et de pinces.
Insérez et le cathéter intraveineux du ventricule cardiaque gauche vers l’aorte et coupez l’oracle droit. Ensuite, commencez la perfusion avec 100 millilitres de solution saline normale à 0,9% jusqu’à ce que le sang sortant de l’oracle droit soit clair. Continuez ensuite à perfuser avec 250 à 300 millilitres de paraformaldéhyde à 4% dans un tampon de phosphate molaire de 0,1 ou PB pH 7,4 pendant 10 minutes.
Après perfusion, retirez la peau du membre postérieur bilatéral à l’aide d’une lame chirurgicale et exposez le nerf sciatique bilatéral et le muscle gastrocnémien médian. Disséquez soigneusement le muscle gastrocnémien médian bilatéral du membre postérieur à l’aide d’une lame et postfixez l’ensemble du muscle dans 10 millilitres de paraformaldéhyde à 4%. Après deux heures, retirez le muscle de la solution et cryoprotégez-le dans 10 millilitres de saccharose à 25% dans 0,1 molaire PB pendant une journée à quatre degrés Celsius.
Une fois que le tissu musculaire est immergé dans la solution de saccharose, fixez-le sur une étape de congélation d’un système de microtomes coulissants à l’aide d’un milieu de section congelé. Trancher le muscle horizontalement le long du long axe du muscle à l’épaisseur de 80 microns. À l’aide d’une brosse, placez sept sections cryogéniques par puits de manière ordonnée dans une plaque de culture de six puits de 10 millilitres de 0,1 molaire PB. Pour la coloration fluorescente, incuber quatre sections par puits avec 1,5 millilitre de 0,1 PB molaire contenant 75 microlitres de 10% de Triton X 100 et 45 microlitres de sérum d’âne normal sur un agitateur orbital à 20 tr / min.
Après 30 minutes, transférer les sections dans 1,5 millilitre d’une solution mélangée d’anticorps primaires contenant du filament anti-neuro-neuro 200 de lapin, transporteur d’acétylcholine anti-vésiculeux de chèvre dans 0,1 molaire PB, dans 1% de sérum d’âne normal, et 0,5% triton X 100 et incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, lavez les sections trois fois pendant cinq minutes chacune dans 0,1 molaire PB dans un agitateur orbital à 20 tr / min. Après le dernier lavage, incuber la section dans une solution mélangée d’anticorps secondaires contenant de l’AF 488 anti-lapin et de l’AF 546 anti-chèvre d’âne, ainsi que les biomarqueurs de la toxine alpha bungaro AF 647 et de la phalloïdine 350 contenant 0,1 M PB contenant 1% de sérum d’âne normal et 0,5 Triton x 100 pendant une heure, Les protéger de la lumière.
Après l’incubation, lavez les sections en PB et montez-les sur une lame de microscope. Appliquer le verre de couverture sur la section en utilisant 50% de glycérine dans de l’eau distillée. Observez et imagez l’échantillon à l’aide d’un système d’imagerie con focale équipé d’une lentille subjective 20 x avec une ouverture numérique de 0,75 et d’une lentille 40 x avec une ouverture numérique de 0,95.
Pour l’imagerie fluorescente multiple, définissez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission de chaque biomarqueur comme décrit dans le manuscrit du texte. Définissez la résolution de capture d’image sur 640 x 640 pixels. Ensuite, définissez le plan focal de début et de fin.
Définissez la taille des pas sur un ou deux microns. Choisissez ensuite le motif de profondeur, la capture d’image et la série Z. Pour les images à faible grossissement à 20 X, capturez des images de pile de 40 Z en taille de pas de deux microns à l’aide d’un sténopé de 105 microns.
Choisissez le mode de projection ou de topographie et la projection d’intensité sur l’axe Z pour intégrer toutes les images dans une seule mise au point. Pour les images à grossissement plus élevé à 40 X, capturez des images de pile de 80 Z en une taille de pas d’un micron avec un zoom réglé sur deux et un sténopé de 105 microns. Intégrez toutes les images dans une seule mise au point.
Reconstruisez les images dans le motif tridimensionnel avec le système de traitement d’image. La corrélation spatiale représentative du muscle gastrocnémien médian avec le neurofil filament 200 fibres nerveuses positives, le transporteur vésiculeux de l’acétylcholine terminal pré-synaptique positif, les récepteurs post-synaptiques de l’acétylcholine post-synaptique positifs de la toxine alpha bungaro, les cellules de Schwann périsynaptiques S100 positives, les fibres musculaires phalloïdine positives et les noyaux cellulaires marqués DAPI sont démontrés ici. Le neurofilament 200 fibres nerveuses positives a couru en faisceau.
Ces fibres nerveuses ont donné des branches aux terminaux présynaptiques positifs du transporteur vésiculeux de l’acétylcholine, qui ont formé une relation miroir avec les récepteurs post-synaptiques de l’acétylcholine post-synaptique de la toxine alpha bungaro. De plus, les cellules de Schwann périsynaptiques S100 positives ont été détectées autour du neurofilament 200 fibres nerveuses positives près des terminaux pré-synaptiques. La corrélation spatiale a ensuite été exposée dans un modèle tridimensionnel montrant les caractéristiques morphologiques détaillées de la jonction neuromusculaire sous différents angles.
Afin d’observer plus d’imagerie dans les sections musculaires, il est essentiel de trancher le muscle horizontalement le long de l’axe long à une épaisseur de 80 microns.
