Ce travail a été financé par des subventions des Instituts de recherche en santé du MOP-81158.

1. Extraction des protéines cibles à partir de culture primaires neurones de l&#39;hippocampe <ol><li> Avant la récolte protéine endogène à partir des cellules primaires de l&#39;hippocampe, préparer un tampon de lyse (LB; Tableau 1) les inhibiteurs de protéase. A 10 ml de tampon de lyse, ajouter 0,1 ml solution de fluorure phénylméthanesulfonyle (PMSF) à une concentration finale de 10 mM, et 1 comprimé cocktail inhibiteur de la protéase. </li><li> Préparer le N-éthylmaléimide (NEM) solution (Tableau 1) de poudre lyophilisée. Dissoudre délicatement dans de l&#39;EtOH à 100% à la température ambiante (RT). Toujours préparer la solution NEM frais pour le jour de l&#39;expérience. </li><li> Suivant combiner le tampon de lyse et NEM. Ajouter 0,5 ml de solution 2M NEM à un nouveau tube de 50 ml conique. Ajouter 20 ml de LB sur le dessus, et LB place rapidement NEM + (concentration finale de 50 mM) sur une plate-forme à bascule à 4 ° C pour bien mélanger pendant 5 min. Toujours ajouter la deuxième solution NEM / EtOH premier et LB, afin de bien mélanger les deux. </li><li> Retirer des neurones en culture de pépinière et les placer sur la glace *. Retirez délicatement les médias cellulaires, et doucement laver deux fois avec une solution saline tamponnée de phosphate froid (PBS) 1x. Ajouter 300 ml de LB + 50 mM NEM au premier puits de neurones de l&#39;hippocampe et des cellules gratter à l&#39;aide d&#39;un élévateur portable jetable. Recueillir le lysat cellulaire, puis décharger le lysat dans le puits à côté de ce groupe. Racler les cellules dans le deuxième puits en utilisant le dispositif de levage cellule, recueillir, et répétez l&#39;aide d&#39;un troisième puits, si nécessaire de concentrer davantage le lysat. </li><li> Recueillir lysat cellulaire dans un pré-refroidi (sur la glace), tube de 1,5 ml. Répétez l&#39;étape 1.4 en utilisant 100 pl de LB + NEM 50 mM de recueillir toute lysat cellulaire restant. Passez lysat cellulaire total à travers une seringue de calibre 26 ½ 5-6 fois pour aider à la lyse mécanique, en faisant attention de ne pas faire des bulles dans la solution. On peut, au lieu sonication pendant 15 secondes sur la glace, si le matériel est disponible. Nutation lysat cellulaire pour ≥ 30 min à 4 ° C. </li><li> Clarifier la cellule lysate par centrifugation à 16.000 xg / 30 min, afin de granulés cellules non lysées et les détergents matériau insoluble. </li><li> Recueillir effacé lysat cellulaire (surnageant) dans une nouvelle pré-refroidi tube de 1,5 ml sur glace. Répétez protocole de récolte pour tous les groupes de cellules. Mesure la concentration de protéines dans tous les échantillons de lysat en utilisant BCA et normaliser le volume de tous les échantillons de lysat de groupes de cellules d&#39;avoir exactement la même protéine totale, avec un minimum recommandée de 500 mg. Compléter tous les échantillons avec LB + NEM 50 mM à 500 ul volume total. </li><li> Ajouter 1-5 ug d&#39;anticorps primaire dirigé contre la protéine cible pour chaque échantillon de lysat. Nutation les échantillons d&#39;anticorps lysat mixtes nuit à 4 ° C. </li></ol> Neurones hippocampiques primaires de rat * doivent être cultivées à une densité d&#39;environ 250.000 cellules / puits dans un plat à 6 puits, dans un milieu sans sérum contenant un supplément B27 neuronale, comme décrit précédemment 5 et cultivé pour le désirlongueur d de temps, généralement 14-16 jours-in-vitro (DIV) pour atteindre la maturité. Un minimum de 500 ug de protéine totale est recommandé de succès immunoprécipiter et biotinyler une protéine cible neuronale, ce qui nécessite généralement 2-3 puits d&#39;un plat à 6 puits. 2. La précipitation de protéine cible de l&#39;anticorps lié <ol><li> Avant la précipitation et l&#39;immobilisation d&#39;une protéine cible, préparer une suspension à 50% de protéine A, ou des billes de protéine G sépharose revêtues. Plus précisément, ajouter ≥ 60 ul de billes de sépharose par échantillon pour tubes de 1,5 ml, veiller à ce que tous les échantillons contiennent des quantités égales de perles. Les billes magnétiques sont également appropriés si le matériel est disponible. </li><li> Ajouter un volume égal de bouillie à 50% à chaque échantillon d&#39;anticorps lysat, et nutation pour ≥ 1 h à 4 ° C. </li></ol> 3. Acyl-biotine change: Hydroxylamine (HAM) Clivage <ol><li> En effectuant l&#39;étape 2.2, préparer un certain nombre de tubes avec un tampon de lyse (LB) de dipH fférents. Le pH est très important pour ces étapes et devrait toujours être réglé à l&#39;aide d&#39;un pH-mètre. Préparer 2 ml de LB 7,2 pH par échantillon, et 0,5 ml de tampon rigoureux par échantillon (tableau 1). Également préparer 0,5 ml de LB + 10 mM NEM par échantillon, comme dans les étapes 01.01 à 01.03. Ajouter PMSF et comprimés inhibiteurs de la protéase à tous les tampons de lyse, comme à l&#39;étape 1.1. </li><li><ol class="lalpha"><li> Hydroxylamine (HAM) est un agent réducteur puissant, dont le clivage de palmitate de cystéines est nécessaire pour biotinylation (Figure 1), et l&#39;omission du clivage HAM sert de témoin négatif. Diviser chaque échantillon de billes dans deux échantillons, l&#39;un en omettant l&#39;étape de clivage HAM (-HAM), et une étape comprenant la HAM (+ HAM). Pour normaliser la dégradation des protéines provoquée par le traitement HAM, il faut diviser chaque échantillon en trois, avec 1/3 de billes utilisées pour le contrôle de la-HAM, et les 2/3 pour le traitement HAM +. </li><li> Préparez 1 supplémentaire.Tubes de 5 ml sur la glace, étiquetés comme contrôle de la HAM-pour chaque échantillon. Suite à l&#39;étape 2.2, doucement centrifuger perles tous les échantillons &#39;à 0,5 ug / 1 min à 4 ° C (centrifugeuse à cette vitesse, la durée et la température pour toutes les étapes restantes, sauf indication contraire), placer les tubes sur la glace, enlever le surnageant et remettre en suspension les billes dans 600 ul de LB + NEM 10 mM. </li></ol></li><li> Après remise en suspension des échantillons perles »dans un tampon de lyse + NEM 10 mM, immédiatement recueillir 200 pl de lysat de perles de l&#39;échantillon en suspension, et du rejet dans l&#39;échantillon de-HAM tube sur la glace. Ajouter un supplément de 300 pi de LB + NEM 10 mM à l&#39;échantillon de l&#39;HAM-, et un supplément de 100 ul de l&#39;échantillon HAM + pour un total de 500 ul de chaque échantillon. Incuber les tubes pendant 10 min sur la glace. </li><li> Remettre en suspension (laver) la-HAM HAM et des échantillons + délicatement avec un tampon strictes 0,5 ml par échantillon. Effectuez cette étape rapidement, comme une incubation plus longue SDS se traduira par la suppression de l&#39;anticorps lié duperles. </li><li> Lavez délicatement tous les échantillons à trois reprises dans 0,5 ml / échantillon de 7,2 pH LB, et centrifuger entre les lavages comme dans 3.2b étape. </li><li> En effectuant l&#39;étape 3.5, préparer un tampon HAM (tableau 1). Ajouter le volume approprié de solution d&#39;hydroxylamine dans un nouveau tube, pour atteindre une concentration finale de 1M dans un volume de 0,5 ml pH 7,2 LB, par exemple de + HAM. Toujours préparer le tampon HAM frais pour le jour de l&#39;expérience. Ajouter 0,5 ml / échantillon de 7,2 pH LB à tous-HAM échantillons, et 0,5 ml / échantillon de tampon de HAM à tous les échantillons HAM +. </li><li> Nutation tous les échantillons pendant 1 heure à température ambiante (RT). Ne pas dépasser 1 heure. </li></ol> 4. Acyl-biotine Bourse: Biotin-CCMB étiquetage <ol><li> Alors que d&#39;effectuer l&#39;étape 3.6, préparer 2 ml de LB pH 6,2 pour l&#39;échantillon (tableau 1), à l&#39;étape 3.1. Placez le pH de 6,2 LB sur la glace jusqu&#39;à ce que nécessaire. Également préparer une solution mère de biotine-BMCC (tableau 1) immédiatement avant son utilisation. Peser exactly 2,1 mg de biotine-BMCC, recueillir dans un tube de 1,5 ml, et doucement se dissoudre dans 0,5 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) en le plaçant sur une plate-forme à bascule à la température ambiante, pour obtenir une concentration de 8 mm (ne pas utiliser de pipette pour briser la poudre ). </li><li> Une fois l&#39;étape 3.6 est terminée, lavez doucement les perles une fois dans un tampon de lyse pH 6,2, pour éliminer le tampon HAM résiduelle. Enlever le surnageant et placer les échantillons sur la glace. </li><li> Biotine-BMCC est une molécule de biotine conjugué maliemide qui a une grande affinité pour les groupes thiol libres de cystéines (figure 1). En effectuant l&#39;étape 4.2, préparer 0,5 ml de biotine-BMCC tampon (tableau 1) par échantillon, à une concentration de travail entre 0,5 pm à 5 pm. Des concentrations supérieures à 5 uM probablement saturer la protéine cible 6 et, généralement, ne doit pas être dépassée, mais cela peut varier en fonction de la protéine cible souhaitée. Ajouter 0,5 ml de biotine-BMCC tampon pour chaque échantillon, et nutation pendant exactement 1 heure à 4 &amp;deg; C. Ne pas dépasser 1 heure. </li></ol> 5. Élution de la protéine cible conjugué à la biotine et SDS-PAGE <ol><li> Une fois l&#39;étape 4.3 est terminé, lavez doucement tous les échantillons une fois en pH 6,2 LB. Gardez tous les échantillons sur la glace entre les lavages. Retirer tampon d&#39;échantillon SDS 2x sans agents réducteurs (tableau 1) de -20 ° C pour le stockage et lentement fondre la glace. </li><li> Lavez délicatement les échantillons à trois reprises dans 7,5 pH LB + PMSF / inhibiteurs, et conserver des échantillons sur la glace entre les lavages. </li><li> Retirer le surnageant du troisième lavage, en laissant les perles enrobées dans une pâte avec du tampon restant dans le fond du tube. Trempez une pipette avec une pointe de petit diamètre (une pointe de chargement de gel ou P2 pointe de pipette suffisent) dans le fond même du tube à travers la boue, et recueillir rapidement toute tampon restant, en faisant attention de ne pas prendre toutes les billes. </li><li> Compléter le tampon d&#39;échantillon SDS 2x avec DL-dithiothréitol (DTT) pour obtenir une concentration finale de 5 mM. Ajouter40-50 ul de tampon d&#39;échantillon 2x + 5 mM DTT à chaque échantillon. Le cas échéant, les billes de vortex pour mélanger complètement avec le tampon d&#39;échantillons, et immédiatement centrifuger à haute vitesse pour collecter toutes les billes dans une pastille, immergés dans un tampon d&#39;échantillon. </li><li> Faire bouillir tous les échantillons pendant 10 min à 75-80 ° C. Laissez refroidir les échantillons à température ambiante pendant ≥ 10 min sur paillasse, et centrifuger à 16000 xg / 3 min à granulés complètement les perles. </li><li> Ajouter le volume complet de la protéine éluée (surnageant) de chaque échantillon à une seule voie dans un gel de polyacrylamide approprié pour western blot, SDS-PAGE 7. Organiser les échantillons de telle sorte que le contrôle de l&#39;éluant et-HAM HAM éluant + pour un seul échantillon sont exécutées immédiatement adjacente à une autre au cours de SDS-PAGE (figure 2). Après SDS-PAGE, transfert à un PVDF ou membrane de nitrocellulose. </li></ol> 6. Western Blot et détection de la palmitoylation de la protéine cible <ol><li> Une fois 5,6 étape est terminée, laver la membranedeux fois dans du tampon Tris salin (TBS 1x) pendant 10 min sur un agitateur oscillant, à température ambiante. </li><li> Préparer un tampon de blocage pour bloquer non spécifique d&#39;étiquetage en pesant albumine bovine sérique (BSA), pour atteindre 3% en poids dans un volume de TBS 1x + Tween-20 0,05% (TBS-T) qui est suffisant pour submerger totalement la membrane . Pour streptavidine buvard, toujours bloquer avec de la BSA et non du lait en poudre. Bloquer la membrane pendant 1 heure à température ambiante sur un agitateur oscillant. </li><li> Préparer une solution d&#39;anticorps de TBS-T BSA + 0,3%. Ajouter streptavidine-HRP reconstitué à 1 mg / ml dans l&#39;eau distillée, dilué à 1:5,000-1:10,000. Une fois l&#39;étape 6.2 est terminée, laver la membrane une fois dans du TBS-T pendant 10 min, puis incuber la membrane dans une solution d&#39;anticorps streptavidine sur une plate-forme à bascule pour soit pendant 1 heure à température ambiante ou une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver la membrane trois fois dans du TBS-T pendant 10 min sur un agitateur oscillant. Afin de détecter le signal palmitoylation, exposer la luminescence HRP en utilisant un chemKit substrat iluminescent. </li><li> Afin de normaliser les taux de palmitoylation de la quantité de la protéine d&#39;intérêt qui a été immunoprécipitée, enlever la membrane en utilisant un tampon d&#39;extraction western blot pour 5-10 minutes sur un agitateur oscillant à TA. Répétez les étapes 6,1 à 6,4 à l&#39;aide de l&#39;anticorps primaire dirigé contre la protéine d&#39;intérêt qui a été initialement utilisé pour l&#39;immunoprécipitation. </li><li> Quantifier palmitoylation de la protéine d&#39;intérêt en utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image, et normaliser les taux de palmitoylation de la quantité de protéine immunoprécipitée. </li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le test IP-ABE présenté ici est une méthode simple et très sensible pour la détection de protéines dans des cultures primaires palmitoylées neurones de l&#39;hippocampe, en utilisant principalement des techniques biochimiques standards. Cela rend le test facilement adaptable pour les laboratoires déjà équipés de matériaux occidentaux buvard. Le test IP-ABE associe un protocole d&#39;immunoprécipitation norme pour isoler et immobiliser une protéine cible, suivie par la chimie décrite précédemment ABE 2-4 pour détecter rapidement les niveaux de palmitate sur une protéine substrat. La technique ABE dispose d&#39;un large éventail d&#39;applications pour l&#39;examen des protéines palmitoylées dans divers tissus et des lignées cellulaires, y compris à grande échelle palmitoyl-protéomique dépistage des profils palmitoylation mondiaux, et la détection rapide des niveaux de palmitoylation d&#39;une protéine cible unique. Descriptions précédentes de l&#39;ABE chimie ont utilisé différentes méthodes de lyse cellulaire et extraction par détergent de prot neuronaleeins 2, 9, thiol libre-blocage 10, 11, biotinylation, et la purification de la protéine cible 4 en fonction de la demande de l&#39;expérience. L&#39;addition de palmitate de neuronales résultats protéines dans leur ciblage vers la membrane cellulaire, et la détection de la fraction palmitoylé d&#39;une protéine cible, il faudra son extraction à partir de ces membranes. Méthodologies décrites précédemment FBA ont utilisé une variété de 9 ioniques et des détergents non ioniques 8 à extraire des protéines cibles souhaitées, ainsi que l&#39;utilisation d&#39;un détergent particulier dépend de la protéine cible et son trafic membranaire connue. Ici, nous utilisons la non dénaturant et un détergent non ionique IGEPAL CA-630 pour extraire les protéines palmitoylées, que nous avons validées pour l&#39;extraction et la détection de la protéine neuronale palmitoylée δ-caténine (figure 2). La structure de IGEPAL CA-630 comprend un groupe de tête volumineux et rigides non polaire qui n&#39;est pasperturber la conformation des protéines d&#39;origine ou interactions, mais qui permet à son association avec les régions hydrophobes des protéines associées à la membrane, ce qui confère à leur miscibilité et de permettre leur extraction. Beaucoup de protéines neuronales localisées à la membrane synaptique ou post-synaptique densité des synapses doit être extraite à l&#39;aide IGEPAL CA-630, mais certains peuvent ne pas solubiliser complètement, et peut nécessiter l&#39;utilisation d&#39;un autre détergent non dénaturant comme le Triton X-100, qui a déjà été utilisé pour ABE chimie 2, 8. Plusieurs descriptions de l&#39;ABE chimie ont également utilisé un réactif de biotinylation différente thiol-réactive de la molécule que nous décrivons ici, appelée biotine-PSPM (Thermo Scientific), ce qui nécessite également un autre moyen de 4 purification des protéines. Biotine-HPDP est un autre thiol-réactive, molécule de biotine conjugué à maliemide qui contient une liaison disulfure dans le bras de liaison maliemide, structurellement dil ifferentiating de biotine-BMCC, qui ne contient pas cette liaison disulfure. À la suite de thiol biotinylation de la cystéine libre ou palmitoylé d&#39;une protéine par la biotine-HPDP, la liaison disulfure qui en résulte entre la protéine cible et le groupe de la biotine peut être clivé par des réactifs réducteurs pour libérer le groupe de la biotine et la régénération de la protéine dans sa forme non modifiée, ce qui biotinylation par la biotine-PSPM transitoire et réversible. Par conséquent, l&#39;utilisation de ce réactif de biotinylation exige la purification d&#39;une protéine cible par des réactifs avidine immobilisés, tels que des billes revêtues de streptavidine. Toutefois, thiol-biotinylation d&#39;une protéine cible par la biotine-BMCC, comme nous décrivons ici, est relativement stable et permanente, et nécessite une purification de la protéine cible par un anticorps dirigé contre la cible, et immobilisé sur des billes de sépharose. Les deux techniques de FBA ont déjà été utilisés à grande échelle, écrans et la détection de la palmitoylation des protéines individuelles 2, 8-10, 12, et leIP-ABE test que nous décrivons ici est optimale pour la détection rapide de la palmitoylation de simples protéines cibles neuronales. Une majorité écrasante de palmitoylation cellulaire implique l&#39;addition réversible d&#39;palmitate au groupe thiol des cystéines (appelé S-palmitoylation, qui nous généralisons comme «palmitoylation» dans ce protocole), mais un groupe très limité de protéines sont soumises à palmitoylation irréversible à la glycine et les résidus de cystéine par la formation de liaisons amide stables, appelée N-palmitoylation 13. Une limitation de l&#39;ABE chimie est son incapacité à détecter les N-palmitoylation en raison de la stabilité de la liaison amide, et c&#39;est pourquoi le dépistage d&#39;une protéine nouvelle cible pour palmitoylation doivent être confirmés par 3H-palmitate marquage métabolique 1. Comme mentionné précédemment, le test IP-ABE peut être facilement adapté pour examiner palmitoylation dans des extraits protéiques provenant de sources multiples, y compris les transfected lignées cellulaires hétérologues, les tissus primaires et des cultures neuronales primaires de plusieurs régions du cerveau. Le dosage IP-ABE a été utilisée pour examiner la suffisance de palmitoylation mutées cystéine-à-sérine protéines pour identifier l&#39;emplacement d&#39;une cystéine palmitoylé le long d&#39;une protéine cible 8, pour l&#39;examen de roulement dynamique palmitate de protéines synaptiques des neurones en culture dans des conditions basales 10, et les changements dans les niveaux de palmitoylation de protéines neuronales suite à l&#39;induction de l&#39;activité neuronale 9. La sensibilité et la capacité d&#39;adaptation de l&#39;essai IP-ABE rendent parfaitement adapté pour l&#39;examen des profils de palmitoylation de protéines neuronales, et optimale pour la détection des changements dynamiques dans palmitoylation.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> IGEPAL CA-630 </td><td> Sigma </td><td> I8896 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Fluka </td><td> 93482 </td><td></td></tr><tr><td> Cocktail inhibiteur de la protéase </td><td> Roche Mini Complete </td><td> 11 836 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> NEM </td><td> Sigma </td><td> E3876 </td><td></td></tr><tr><td> Solution HAM </td><td> Sigma </td><td> 46780-4 </td><td></td></tr><tr><td> Kit BCA Protein Assay </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td><td> Assurer la compatibilité avec un détergent choisi </td></tr><tr><td> Perles de protéine G sépharose / A-couché </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6002-35 </td><td></td></tr><tr><td> Biotine-BMCC </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21900 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidine-HRP </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21126 </td><td> Reconstituer à 1 mg / ml dans de l&#39;eau </td></tr><tr><td> Western Blot tampon de dénudage </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21059 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of protein palmitoylation in cultured hippocampal neurons by immunoprecipitation and acyl-biotin exchange (abe)

Palmitoylation est une modification post-traductionnelle des lipides comportant la fixation d&#39;un 16-carbone des acides gras saturés, le palmitate, de résidus cystéine de protéines substrat par une liaison labile thioester [commentaire en 1]. Palmitoylation d&#39;une protéine substrat augmente son hydrophobicité, et facilite en général son trafic vers les membranes cellulaires. Des études récentes ont montré palmitoylation d&#39;être l&#39;une des modifications les plus courantes de lipides dans les neurones 1, 2, suggérant que le roulement du palmitate est un mécanisme important par lequel ces cellules régulent le ciblage et le trafic des protéines. L&#39;identification et la détection des substrats palmitoylées peut donc améliorer notre compréhension de la traite des protéines dans les neurones. La détection de la protéine palmitoylation dans le passé a été techniquement entravé en raison de l&#39;absence d&#39;une séquence consensus parmi les substrats protéiques, et le recours à métabolique labeling de palmitoyl-protéines avec 3 H-palmitate, un dosage biochimique de temps avec une faible sensibilité. Développement de l&#39;Acyl-biotine Exchange (ABE) test permet la détection rapide et une plus grande sensibilité élevée de protéines palmitoylées 2-4, et est optimale pour mesurer le chiffre d&#39;affaires dynamique de palmitate de protéines neuronales. Le test ABE est composé de trois étapes biochimiques (figure 1): 1) le blocus irréversible de non modifiés groupements thiols de cystéine en utilisant la N-ethylmaliemide (NEM), 2) un clivage spécifique et le démasquage du groupe thiol de la cystéine palmitoylée par hydroxylamine (HAM), et 3) le marquage sélectif de la cystéine palmitoylé l&#39;aide d&#39;un réactif de biotinylation thiol-réactive, la biotine-BMCC. La purification des protéines thiol-biotinylées en suivant les étapes de FBA a été différente, en fonction de l&#39;objectif global de l&#39;expérience. Ici, nous décrivons une méthode pour purifier une protéine d&#39;intérêt dans palmitoylée hippocampe primaireneurones al par une immunoprécipitation initial (IP) étape en utilisant un anticorps dirigé contre la protéine, suivie par le dosage de l&#39;EBA et western blot de mesurer directement les niveaux de palmitoylation de cette protéine, qui est appelé le test IP-ABE. Faible densité des cultures de neurones hippocampiques de rat embryonnaires ont été largement utilisées pour étudier la localisation, la fonction et le trafic des protéines neuronales, ce qui les rend parfaitement adapté pour l&#39;étude des protéines neuronales palmitoylation en utilisant le test IP-ABE. Le test IP-ABE exige essentiellement la norme IP et de l&#39;Ouest réactifs buvard, et n&#39;est limitée que par la disponibilité d&#39;anticorps contre le substrat cible. Ce test peut facilement être adapté pour la purification et la détection des protéines transfectées palmitoylées dans des cultures de cellules hétérologues, cultures primaires de neurones issus de différents tissus du cerveau de la souris et du rat, et les tissus du cerveau, même primaire elle-même.

Le dosage IP-ABE détecte spécifiquement thiol-palmitoylation des résidus cystéine long de protéines de substrat, et peut être utilisé pour détecter la palmitoylation des protéines neuronales immunoprécipitées d&#39;une manière représentée sur la figure 1. Traitement de la protéine immunoprécipitée avec neuronale HAM (figure 1) clive la liaison thioester entre le palmitate et le groupe thiol de la cystéine, ce qui permet l&#39;incorporation spécifique de la biotine-BMCC sur le nouveau groupe thiol disponible, qui peut être ensuite détecté à l&#39;aide Western blot. L&#39;omission de la HAM (moins-HAM) clivage empêche l&#39;incorporation de biotine-BMCC et fonctionne comme un contrôle négatif pour spécifique de la palmitoyl-biotinylation de l&#39;échantillon plus-HAM, et doit donc toujours être exécuté à côté de l&#39;échantillon plus-HAM pour l&#39;Ouest buvard par SDS-PAGE (figure 2). Dans une expérience optimisée (Figure 2A), la palmitoylationsignal de la protéine neuronale δ-caténine 2 peut être facilement détecté par transfert de biotine-BMCC à une concentration de 1 nM, en utilisant la streptavidine conjuguée à la HRP, contre parallèles échantillons minus-plus-et HAM. Le signal spécifique de palmitoylation δ-caténine apparaît à sa taille prédite de 160kD, que dans l&#39;échantillon de plus-HAM. La spécificité de ce signal a été confirmée par reprobing de δ-caténine avec l&#39;anticorps spécifique qui a été initialement utilisé pour l&#39;immunoprécipitation, résultant en un signal dans les deux traitements de jambon à la même taille prédite. Optimisation de l&#39;essai IP-ABE (figure 2A) se traduira par un profil de western blot d&#39;un échantillon moins-HAM qui se distingue facilement de l&#39;échantillon plus-HAM, et présente peu ou pas de signal de palmitoylation. La concentration de biotine-BMCC utilisé pour étiqueter cystéines palmitoylées nécessite une optimisation soignée, et si une concentration saturante de super-biOtin-CCMB est utilisé lors des étapes de la chimie ABE (figure 2B), fond excessif et non spécifiques signaux seront visibles. Une courbe de réponse linéaire pour la biotinylation d&#39;une protéine neuronale palmitoylé, le récepteur nicotinique de l&#39;acétylcholine α7, en utilisant la biotine-BMCC a été préalablement déterminée 6, et présente près de la saturation complète en une concentration de 5-10 pM. Bien que la concentration optimale de biotine-BMCC dévie légèrement en fonction de la protéine cible neuronale, le traitement avec de la biotine-BMCC à une concentration supérieure à 5 uM probablement super-saturer la protéine cible, et aboutir à un profil de western blot avec arrière-plan visible et des signaux non-spécifiques. Une concentration de 0,5 pM pour la biotine-BMCC a déjà été utilisé pour détecter la palmitoylation des autres protéines neuronales comprenant SNAP-25, la huntingtine, les sous-unités des récepteurs AMPA et GluA1 GluA2, et paralemmin 8, et la détermination de la concentration optimale pour un nouvelprotéine cible peut être accompli par essais et erreurs de manière linéaire, en commençant dans la plage de 0,5-5 uM que nous décrivons ici. Les profils issus de streptavidine western blot dans les échantillons moins-et plus-HAM pour δ-caténine palmitoylation ressembler lorsqu&#39;ils sont traités avec 4 pM de biotine CCMB (figure 2B), avec un bruit de fond supplémentaires en différentes tailles, ce qui indique que la biotinylation inappropriée eu lieu. Hydroxylamine est un puissant agent réducteur qui entraîne une dégradation limitée de la protéine cible, en plus de son efficacité de clivage de la liaison thioester. Par conséquent, l&#39;optimisation de l&#39;ABE chimie nécessite un à normaliser la quantité de la protéine immunoprécipitée utilisé pour les échantillons moins-et plus-HAM (étapes 3.2 à 3.3). La normalisation nécessite l&#39;utilisation du double de la quantité de protéine cible immobilisée dans la plus-vs l&#39;échantillon moins-HAM, ce qui correspond en réalité au wester indiscernablesn buvard profils pour la protéine cible, comme indiqué par δ-caténine (figure 2A, B). Toutefois, si la quantité de protéine cible immobilisé n&#39;est pas normalisée entre les échantillons moins-et plus-HAM, le signal de tache résultante de l&#39;Ouest pour la protéine cible dans l&#39;échantillon plus-HAM peuvent être perdus, comme le montre par δ-caténine lorsque des quantités égales de protéines ont été utilisés dans les deux traitements HAM (figure 2C). La spécificité de l&#39;ABE chimie pour l&#39;étiquetage des protéines palmitoylées est très sensible et nécessite une optimisation. Les pièges les plus courants rencontrés lors de l&#39;essai IP-ABE inclure les résultats sous-optimaux présentés dans les figures 2B et 2C, et la dégradation de la protéine cible, indépendamment du traitement HAM, qui sont généralement causées par plus réactifs et tampons, et le pH incorrect. Afin d&#39;éviter ces écueils et corriger les sous-optimale chimie ABE, la fraîcheur et la concentration des réactifs nécessaires à latampons énumérées dans le tableau 1 doivent toujours être examinés, et les ajustements du pH de tous les tampons doivent toujours être vérifiées avant l&#39;exécution de l&#39;expérience. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Tampon </td><td> Concentration de travail </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Tampon de lyse (LB) </td><td> Dans de l&#39;eau distillée 2 O: 1% d&#39;IGEPAL CA-630 50 mM Tris-HCl pH 7,5 150 mM NaCl 10% de glycérol </td><td> N / A </td><td> Préparer avant l&#39;expérience et conserver à 4 ° C </td></tr><tr><td> Solution NEM </td><td> Dans EtOH à 100%: NEM poudre lyophilisée </td><td> M 2 </td><td> Préparer une solution fraîche, juste avant l&#39;utilisation. </td></tr><tr><td> Tampon strictes </td><td> En LB: 10 mM MEM SDS à 0,1% </td><td> N / A </td><td> Préparer juste avant l&#39;utilisation, garder sur la glace. </td></tr><tr><td> 7,2 pH LB </td><td> En LB: Ajuster le pH à 7,2 exactement </td><td> N / A </td><td> Utiliser un appareil de mesure de pH pour ajuster le pH immédiatement avant l&#39;emploi. </td></tr><tr><td> Tampon HAM </td><td> Dans 7,2 pH LB: solution HAM Stock </td><td> 1 M (concentration finale HAM) </td><td> Préparer immédiatement avant l&#39;utilisation. </td></tr><tr><td> PH 6,2 LB </td><td> En LB: Ajuster le pH à 6,2 exactement </td><td> N / A </td><td> Même que pour 7,2 pH LB </td></tr><tr><td> Stock biotine-BMCC Solution </td><td> Dans le DMSO: 2,1 mg Biotine-CCMB solution </td><td> 8 mM </td><td> Préparer immédiatement avant l&#39;utilisation. </td></tr><tr><td> Biotine-BMCC tampon </td><td> Dans pH 6,2 LB: Ajouter biotine-BMCC solution </td><td> 1 à 5 uM (biotine-BMCC finale de concentration) </td><td> Préparer immédiatement avant l&#39;utilisation. </td></tr><tr><td> 2tampon d&#39;échantillon SDS x, aucun des agents réducteurs </td><td> En distillée H 2 O: 5% de SDS à 5% de glycérol 125mm Tris-HCl pH 6,8 à 0,01% bleu de bromophénol </td><td> N / A </td><td> Préparer avant l&#39;expérience, et conserver à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. Supplément de 5 mM de DTT avant utilisation. </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Tampons et réactifs nécessaires pour le dosage IP-ABE. Beaucoup des tampons de lyse peut être préparé avant de commencer l&#39;expérience, cependant, le pH doit être contrôlé et réglé immédiatement avant utilisation avec un pH-mètre, pour assurer le succès de la chimie ABE. La majorité des solutions mères doivent être préparées pour chaque expérience, immédiatement avant utilisation. Beaucoup de tampons, les réactifs communs à la plupart des laboratoires équipés pour la biochimie et réactifs spécialisés avec informations sur les fournisseurs sont énumérés dans le tableau des réactifs et du matériel. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1.jpg" alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1highres.jpg" /> Figure 1. Schéma de l&#39;immunoprécipitation et Acyl-biotine Exchange (IP-ABE) test pour purifier et détecter palmitoylation des protéines neuronales. Neurones de l&#39;hippocampe en culture sont lysées, (1) une protéine cible est ensuite purifié en utilisant un anticorps spécifique de la cible, et immobilisé sur sépharose perles revêtues d&#39;une protéine G ou A. La protéine cible purifiée est ensuite (2) avec de la N-ethylmaliemide (NEM) de manière irréversible et se lier bloc libre thiols (-SH) le long de cystéines non modifié (C). La protéine cible est alors (3) soumis à un traitement avec de l&#39;hydroxylamine (HAM), ce qui entraîne un clivage spécifique des liaisons thioester à cystéines palmitoylées et le démasquage d&#39;un groupe thiol libre palmitoylée (-SH). Ensuite, la protéine cible est (4) treated avec une molécule de biotine thiol-réactive, la biotine-BMCC, résultant en la biotinylation spécifique de la cystéine palmitoylé. Enfin, (5) la protéine est éluée cible biotinylé et retiré de l&#39;anticorps et de talon. La protéine cible avec son cystéine palmitoylée (s) marqué à la biotine est maintenant adapté pour électrophorèse SDS-gel de poly-acrylamide (SDS-PAGE) et Western blot avec de la streptavidine à détecter pour palmitoylation de la protéine purifiée neuronale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2.jpg" alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2highres.jpg"/> Figure 2. Détection de la palmitoylation de la protéine neuronale δ-caténine en utilisant le test IP-ABE. Neurones hippocampiques primaires de rat ont été cultivées comme préprécédemment décrit 5, à une densité de 130 cellules / mm 2 jusqu&#39;à l&#39;échéance de 14DIV, ont ensuite été lysées, et on le soumet à l&#39;analyse IP-ABE pour détecter palmitoylation d&#39;un substrat récemment identifié neuronale palmitoylée, δ-caténine 2. Purifiée immunoprécipités (IP) de δ-caténine (protéine cible) ont été isolés en utilisant 5 ug d&#39;anticorps δ-caténine par échantillon (Transduction Laboratories BD), et ont ensuite été soumis à un SDS-PAGE en parallèle moins-et plus-hydroxylamine (HAM) échantillons. Palmitoylation a été détectée par western blot (WB) avec de la streptavidine-HRP (palmitoylation), et la membrane a été déshabillé et soumis à un WB reprobe pour δ-caténine. (A) Un représentant optimisé IP-ABE résultat pour palmitoylée δ-caténine (tête de flèche) traité avec 1 pM de biotine-BMCC, illustrant la spécificité de l&#39;ABE chimie pour détecter thiol-palmitoylées protéines à partir d&#39;échantillons propriété intellectuelle. (B) Un représentant sous-optimalesentant IP-ABE résultat pour δ-caténine, où une concentration de plus de 4 uM biotine-CCMB a été utilisé, ce qui entraîne signaux non spécifiques et de fond dans les deux échantillons moins-et plus-HAM (flèches). (C) Un autre représentant sous-optimale IP-ABE BM pour δ-caténine, où une excessive concentration de 4 pM de biotine-BMCC a été utilisé et la quantité de protéine utilisée pour l&#39;échantillon IP plus-HAM n&#39;a pas été normalisées en fonction de HAM à médiation la dégradation des protéines, ce qui entraîne une perte de signal dans le WB reprobe pour δ-caténine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

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Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

L&#39;addition réversible aux protéines de palmitate est un régulateur important du trafic intracellulaire des protéines. Ceci est d&#39;un intérêt particulier dans les neurones où de nombreuses protéines synaptiques sont palmitoylées. Nous utilisons une méthode simple biochimique pour détecter les protéines dans les neurones en culture palmitoylées, qui peuvent être adaptés à plusieurs types de cellules et de tissus.

Détection de la palmitoylation des protéines dans les neurones de l&#39;hippocampe en culture par immunoprécipitation et Acyl-biotine Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

35.2K vues.  University of British Columbia. L'addition réversible aux protéines de palmitate est un régulateur important du trafic intracellulaire des protéines. Ceci est d'un intérêt particulier dans les neurones où de nombreuses protéines synaptiques sont palmitoylées. Nous utilisons une méthode simple biochimique pour détecter les protéines dans les neurones en culture palmitoylées, qui peuvent être adaptés à plusieurs types de cellules et de tissus.

Vidéo: Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucléofection et de la culture primaire de neurones embryonnaires de souris hippocampe et cortex

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Recherche

Neurosciences

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) de fluorescence protéines marquées dans les épines dendritiques des neurones de l&#39;hippocampe de culture

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulation et mitochondriale de transport: Live in Imaging neurones de l&#39;hippocampe sur des durées longues

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

L&#39;analyse de la morphologie des épines dendritiques dans les neurones du SNC de culture

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

Induire la croissance dendritique dans des cultures de neurones sympathiques

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

L&#39;isolement et la culture de neurones de l&#39;hippocampe de souris pendant la grossesse

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Le dosage de dommages de l&#39;ADN dans les neurones hippocampiques Utilisation de l&#39;essai de comète

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Phosphate de calcium transfection de primaire neurones de l&#39;hippocampe

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Fluorescence et bioluminescence imagerie des Subcellular Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged neurones de l&#39;hippocampe

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2's ability to repel cultured hippocampal neurons.