Acyl-résine assistée capture ou Acyl-RAC est une méthode sensible et fiable qui peut être utilisé pour détecter la protéine S-acylation dans une variété d’échantillons biologiques. Ce protocole contourne certaines des limitations de l’étiquetage métabolique et de l’étiquetage radio, et permet la détection simultanée de l’acylation S de protéines multiples. Non seulement les cellules vivantes, mais aussi les tissus primaires et les échantillons congelés.
La s-acylation peut réguler une variété de processus cellulaires tels que le trafic de protéines, le ciblage de la membrane plasmatique, la transduction de signaux, le transport du fer et les interactions protéine-protéine. Il est important d’utiliser une solution d’hydroxylamine fraîchement préparée avec un pH soigneusement ajusté pour chaque expérience afin d’assurer un clivage efficace et spécifique de la liaison thioester. Avec une démonstration de cette méthode, il est essentiel pour des étapes comme le chloroforme, les précipitations de méthanol.
La pastille en forme de crêpe obtenue au cours de cette étape doit être manipuler très soigneusement. Il peut s’agir d’une perte fragile et partielle de l’échantillon au cours de l’étape qui peut mener à une récupération inégale de l’échantillon. Savannah West, une étudiante diplômée de notre laboratoire, démontrera la procédure.
Pour obtenir des lysates cellulaires, recueillir les cellules d’intérêt dans un tube de centrifugeuse conique. Et enlever tous les débris cellulaires par centrifugation. Laver la pastille en 5 millilitres de PBS.
Et résuspendez immédiatement les cellules dans 600 microlitres de tampon de lyse fraîchement préparé. Agiter l’échantillon à 1500 révolutions par minute dans un thermo-shaker pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Avant de déblayer les lysates, le détergent à granulés et les matières solubles par centrifugation.
À la fin de la centrifugation, recueillir le lysate autorisé dans un tube de microcentrifugeuse pré-refroidi de 1,5 millilitre sur la glace. Et effectuer un essai d’acide bradford ou bicinchoninique pour estimer la concentration en protéines selon les protocoles standard. Ajouter le méthanol et le chloroforme pour lyser à un rapport de 2:1.
Agiter rigoureusement pour créer une suspension homogène et centrifugeuse de l’échantillon pour recueillir une pastille protéique à l’interface entre les phases aqueuse et organique. Incliner le tube, utiliser une aiguille ou une pointe de chargement de gel pour aspirer autant de solvant que possible. Séchez à l’air la pastille protéinique pendant quelques minutes.
Avant de mélanger doucement le contenu du tube avec 600 microlitres de méthanol, en prenant soin de ne pas casser la pastille. Après avoir soigneusement enlevé le lavage au méthanol, séchez la pastille protéique sur un dessus de banc pendant environ cinq minutes. Ensuite, réutilisez la pastille protéique dans 200 microlitres de tampon 2SHB.
Et vortex à 42 degrés Celsius et 1500 révolutions par minute dans un thermo-shaker. Lorsque la pastille est dissoute, ajouter 200 microlitres de 0,2 %MMTS en 2SHB à l’échantillon. Et incuber la protéine pendant 15 minutes à 42 degrés Celsius et 1500 révolutions par minute dans un thermo-shaker.
À la fin de l’incubation, effectuer 3:4 précipitations de chloroforme-méthanol comme démontré. Pour enlever le MMTS, dissoudre la pastille en 100 microlitres de tampon 2SHB frais avec vortex. Et diluer l’échantillon avec 300 microlitres de tampon A après chaque précipitation.
Après les précipitations finales, dissoudre les échantillons dans 200 microlitres de tampon 2SHB et diluer avec 240 microlitres de tampon A.Mesurer la concentration de protéines à nouveau et mettre de côté un 40 microlitres de chaque échantillon que les contrôles d’entrée. Divisez les échantillons en deux volumes égaux de 200 microlitres. Et marquer les tubes comme plus l’hydroxylamine et moins l’hydroxylamine.
Ajouter 50 microlitres d’hydroxylamine neutre fraîchement préparée à deux molaires à une concentration finale de 400 millimolaires au tube d’hydroxylamine plus. Et 50 microlitres de chlorure neutre de sodium deux molaires au contrôle négatif, un tube d’hydroxylamine moins. Ajouter ensuite 30 microlitres de boue de perles TS à chaque tube.
Et faites pivoter les tubes pendant une à deux heures à température ambiante. À la fin de l’incubation laver les perles quatre fois avec 1%SDS dans le tampon A pour enlever toute hydroxylamine résiduelle. Après le dernier lavage, laver tous les échantillons de perles avec trois microcentrifugations douces d’une minute.
Aspirer soigneusement les supernatants et resuspendre les perles dans 500 microlitres de 1%SDS dans le tampon A à chaque lavage. Après le dernier lavage, faites tourner doucement les perles comme démontré. Et aspirer autant de surnatant que possible sans déranger les perles.
Pour récupérer les protéines des perles, ajouter 50 microlitres de tampon échantillon SDS de 4% à chaque tube et incuber les échantillons à 80 degrés Celsius et 1500 révolutions par minute pendant 15 minutes dans un thermo-shaker. À la fin de l’incubation, laisser refroidir les échantillons avant de les centrifuger pour pelleter complètement les perles. Ensuite, utilisez une pointe de chargement de gel pour transférer les protéines élutées dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre.
Et exécutez les échantillons sur un gel SDS-PAGE pour analyser l’acylation S des protéines d’intérêt par le ballonnement occidental. Tyrosine kinase Lck peut être détecté dans les lysates traités avec deux hydroxylamines molaire neutres. pour fendre le lien thioester entre les résidus de cystéine et la moiety d’acide gras.
Le décapage et le reprobage avec des anticorps contre les protéines Fyn et LAT démontrent que l’essai assisté de capture d’acyl-résine peut être employé pour analyser s-acylation des protéines multiples en même temps. En outre, la s-acylation de Lck, Fyn, et LAT peut être facilement détectée dans les splenocytes primaires de souris. Indiquant que cette modification est conservée entre deux espèces.
En plus de l’identification de nouvelles protéines acylated S, cette méthode peut également être utilisée pour évaluer les changements dans la protéine S-acylation dans différentes conditions biologiques. Le nombre de protéines s-acylated nouvellement identifiées a augmenté énormément après que le double-up ait signifié une technique rapide et fiable telle qu’Acyl-RAC. En plus de l’identification de nouvelles protéines acylated S, cette méthode peut également être utilisée pour évaluer les changements dans la protéine S-acylation dans différentes conditions biologiques.
