Cette méthode biochimique permet de déterminer l’état de palmitoylation de toute protéine membranaire exprimée dans le cerveau pour laquelle un anticorps approprié est disponible. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite pas de purification par affinité et utilise plutôt des changements dans la mobilité du gel pour déterminer le nombre de modifications d’une protéine d’intérêt. Après avoir disséqué le cerveau, homogénéisez-le immédiatement en 10 millilitres de tampon d’homogénéisation dans un homogénéisateur de verre sur la glace.
À l’aide d’environ 12 coups, centrifuger les lysates pendant 15 minutes à 1400 fois G et quatre degrés Celsius. Transférer le surnatant dans un nouveau tube sur glace. Resuspendez la pastille en 10 millilitres de tampon d’homogénéisation.
Homogénéisez-le à l’aide d’environ six coups. Centrifuger la suspension à 710 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Combinez les supernatants et centrifugez-les à 40 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.
Jetez le supernatant et resuspendez la fraction de membrane granulée dans un tampon d’homogénéisation en brisant la pastille avec une pointe de pipette et pipetting de haut en bas. Effectuez un test ABCA pour quantifier les niveaux de protéines. Pour effectuer l’analyse APEGS, placez 470 microlitres de tampon A dans un tube de 1,5 millilitre et ajoutez environ 100 à 200 milligrammes de protéines.
Sonicate le tube, puis séparer la protéine insoluble en centrifugant le tube à 25 degrés Celsius et un minimum de 13.000 fois G pendant 10 minutes. Transférer la protéine solubalisée dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Tout d’abord, perturber les liaisons disulphide en incubant la protéine solubalisée dans 25 microlitres de TCEP pendant 60 minutes à 55 degrés Celsius.
Ensuite, bloquez les cystéines libres en incubant la solution avec 12,5 microlitres de la solution de stock de NEM pendant trois heures à température ambiante. Ensuite, commencer le processus de précipitations de méthanol chloroforme. Transférez la solution protéique du tube de 1,5 millilitre à un tube en polypropylène ou en verre qui peut être centrifugé dans un rotor balançant à une vitesse modeste.
Ajouter brièvement deux millilitres de méthanol et de vortex. Ajouter brièvement un millilitre de chloroforme et de vortex. Ajouter ensuite 1,5 millilitres d’eau déionisée et vortex brièvement à nouveau.
Si nécessaire, inverser le tube pour assurer un mélange complet. Centrifuger les échantillons à 3000 fois G et 25 degrés Celsius pendant 30 minutes dans un rotor balançant seau. Retirer soigneusement et jeter la phase supérieure de la solution dans un tube.
Ajouter 1,5 millilitres de méthanol. Mélanger délicatement mais soigneusement par une inversion douce du tube, en prenant soin de ne pas fragmenter la crêpe protéinée opaque. Centrifuger l’échantillon à 3000 fois G et 25 degrés Celsius pendant 10 minutes dans un rotor balançant seau.
À l’aide d’une pipette sérologique en verre, retirer le plus possible la phase supérieure de la solution sans perturber la crêpe protéique. Rincez soigneusement la pastille avec un millilitre de méthanol et laissez-la sécher à l’air libre pendant au moins 10 minutes. Une fois les précipitations de méthanol chloroforme terminées, commencez le clivage des liaisons palmitoyl thioester en résusant le précipité protéique dans 125 microlitres de tampon A.Transfer vers un nouveau tube de 1,5 millilitre.
Soniquez brièvement le tube, puis centrifugez-le à 13 000 fois G ou plus et 25 degrés Celsius pendant 10 minutes pour enlever les matières insolubles. Transférer la protéine solubalisée dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre et ajouter 375 microlitres de tampon H ou tampon T.Après avoir incubé les échantillons pendant 60 minutes à température ambiante, répéter les précipitations de méthanol chloroforme. Pour ajouter m-PEG aux cystéines non protégées, commencez par résuser la pastille dans 100 microlitres de tampon A contenant 10 mil ou plus de TCEP.
Ensuite, transférez la suspension dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter 25 microlitres de solution m-PEG 5K de stock et mélanger par pipetting. Incuber à température ambiante avec la rotation de bout en bout.
Après 60 minutes d’incubation, retirer le m-PEG 5K non incorporé en effectuant à nouveau des précipitations de méthanol chloroforme. Centrifugeuse à plus de 13 000 fois G et 25 degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez soigneusement la phase supérieure comme avant, en évitant la crêpe épaisse et flocculente.
Ajouter un millilitre de méthanol et mélanger délicatement mais bien. Centrifugeuse à plus de 13 000 fois G et 25 degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirer délicatement le surnatant et rincer la pastille avec un millilitre de méthanol.
Encore une fois, centrifugeuse à plus de 13 000 fois G et 25 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après séchage à l’air de la pastille, la resuspendre en 50 microlitres de tampon A sans TCEP ni agent réducteur. Réservez 5 microlitres de la solution pour la quantitation des protéines BCA.
Après la quantitation, ajouter une quantité appropriée de tampon échantillon 4x Laemmli. Chargez l’échantillon sur un gel de page SDS. Utilisez des protocoles standard de transfert et de détection de séparation pour les ballonnements occidentaux.
Pour étudier l’état de palmitoylation des protéines SynDIG, des fractions de membrane P2 provenant de cerveaux de souris homogénéisés ont été soumises à l’analyse APEGS. La séparation et l’enquête avec des anticorps ont démontré que SynDIG1, SynDIG4 Prrt1, et Prrt2 sont palmitoylated dans le cerveau de souris. Le but des précipitations de méthanol chloroforme est d’empêcher un produit chimique, tel que nem, interférer avec la prochaine étape du protocole.
Une bonne précipitation de méthanol chloroforme éliminera les produits chimiques indésirables tout en minimisant la perte de protéines. Cette méthode peut être appliquée aux lysates cérébraux de souris de différents âges ou de différentes régions du cerveau pour étudier les règlements spatio-temporels de la palmitoylation.
