Les auteurs tiennent à remercier Matthew Florence pour la préparation des cultures de tranches d&#39;hippocampe. Ce travail a été soutenu par des subventions de l&#39;Institut national américain sur le vieillissement et l&#39;Association Alzheimer NZG.

1. Fixation Fixateurs sont cancérigènes, porter des gants et manipuler les fixateurs dans une hotte. Sauf indication contraire, toutes les incubations sont effectuées sur la glace et toutes les solutions doivent être filtrés avant utilisation. Utilisez la microscopie électronique réactifs de qualité. Jour 1 <ol><li class="jove_content"> Après conditions expérimentales (par exemple, injection virale, le traitement médicamenteux), placez la membrane avec organotypiques coupes d&#39;hippocampe dans un 60 x 15 mm boîte de Petri en polystyrène contenant glacée phosphate 0,1 M de tampon (tampon phosphate de Sorensen), pH 7,3. Ajouter 1 à 2 ml de tampon phosphate 0,1 M directement sur le dessus des tranches de les garder au froid. </li></ol> ÉTAPE CRITIQUE: Utilisez toujours fraîchement préparés tampons et fixateurs. Assurez-vous que le pH du tampon est dans la plage souhaitée. A défaut de le faire pourrait endommager les structures cellulaires. <ol start="2"><li> Pour isoler le sous-champ CA1 de la tranche, utilisez unscalpel jetable en douceur couper à travers la tranche suivante à la DG, parallèlement à la couche CA1 cellule (figure 1). Ensuite, couper la tranche restante à la verticale pour enlever le sous-champ CA3 et le subiculum. Couper un coin de la tranche d&#39;aider à identifier la surface supérieure du tissu. </li></ol> REMARQUE: En cas pas de livraison virale de la protéine d&#39;intérêt est nécessaire, la tranche de tissu ensemble peut être fixé après que les médias est enlevée avec un rinçage délicat de tampon glacé. Cette étape est suivie par découpage de la CA1. ÉTAPE CRITIQUE: Gardez la trace de la face supérieure du tissu afin de sectionnement adéquate des grilles plus tard. <ol start="3"><li> Enlever soigneusement le tissu de la membrane à l&#39;aide de la face arrière du scalpel. Utiliser une pipette Pasteur en douceur transférer le tissu sur une plaque à 12 puits contenant 0,1 M de tampon phosphate. </li><li> Retirer le tampon dans le puits de la plaque et ajouter 500 m etu, L - 1 ml de fixatif glacé (pH 7,3) constituées des éléments suivants: 0,1% d&#39;acide picrique, du paraformaldéhyde à 1%, et 2,5% de glutaraldéhyde dans un tampon phosphate 0,1 M. Incuber pendant 2 heures à 4 ° C. </li></ol> REMARQUE: L&#39;acide picrique peut être explosif à l&#39;état sec. Gardez-le mouillé avec de l&#39;eau dans un récipient hermétiquement fermé. Conserver dans un endroit sec et bien aéré. <ol start="5"><li> Retirer le fixateur du puits et laver les échantillons 3 fois (20 min chacun) dans 0,1 M de tampon phosphate. </li><li> Incuber pendant 40 min dans de l&#39;acide tannique à 1% (p / v) dans 0,1 M de tampon maléate pH 6,0. </li><li> Rincer deux fois (20 min chacun) dans un tampon maléate. </li><li> Incuber pendant 40 min dans de l&#39;acétate d&#39;uranyle 1% (p / v) dans du tampon maléate dans l&#39;obscurité. L&#39;acétate d&#39;uranyle est sensible à la lumière et est radioactif. Couvrir le bécher avec du Parafilm lors de la dissolution et de stocker n&#39;importe quel tampon utilisé dans l&#39;obscurité à 4 ° C. </li><li> Rincer deux fois (20 min chacun) dans un tampon maléate. </li><li> Incuber pendant 20 min dans du chlore de platine de 0,5%IDE (p / v) dans du tampon maléate. </li><li> Rincer deux fois (20 min chacun) dans un tampon maléate. Conserver les échantillons à 4 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient prêts pour un traitement ultérieur. </li></ol> 2. La déshydratation et la Embedding L&#39;oxyde de propylène est cancérigène. Éviter les vapeurs en travaillant avec lui dans une hotte. Utilisez absolue, l&#39;éthanol pur à 100% qui ne contient aucune trace d&#39;eau. Diluer cette éthanol absolu pour produire des concentrations différentes de déshydratation. Jour 2 <ol><li> Incuber pendant 5 min dans de l&#39;éthanol 50% puis pendant 5 min dans de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Incuber pendant 15 min à 1% fraîchement préparée p-phénylènediamine (PPD) dans l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Rincer trois fois dans de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Incuber pendant 5 min dans de l&#39;éthanol 80% puis pendant 5 min dans de l&#39;éthanol à 95%. </li><li> Incuber dans l&#39;éthanol à 100% deux fois 5 min à chaque fois. </li><li> Préparer des flacons en verre avec bouchon à vis et assurez-vous qu&#39;ils sont propres et sèches. Transfert tranches de flacons en verre etétiqueter chaque flacon simple et claire. </li><li> Incuber pendant 5 min dans un mélange 1:1 éthanol: l&#39;oxyde de propylène. </li><li> Incuber dans l&#39;oxyde de propylène à 100% deux fois 5 min à chaque fois. </li><li> Ajouter de la résine (Epon) dans chaque flacon pour faire un mélange 1:1 avec de l&#39;oxyde de propylène. Mélanger doucement pendant 2 heures. Ne pas secouer les flacons avec trop de rigueur pour éviter les bulles qui pourraient interférer avec encastrement. </li><li> Ajouter de la résine pour faire un mélange 3:1 avec l&#39;oxyde de propylène, et mélanger pendant 2 heures. </li><li> Transfert à la résine 100% et incuber O / N. </li></ol> Jour 3 <ol start="12"><li> Échantillons en sandwich entre des bandes de plastique ACLAR et la guérison de 24 heures à 60 ° C. </li></ol> 3. La coupe et de montage sur les grilles Jour 4 <ol><li> Couper semi-fines (0,5 um) sections et colorer avec 1% de bleu de toluidine + 1% de borax pour déterminer l&#39;orientation correcte des échantillons. </li><li> Couper coupes ultrafines (60 nm) et monter sur des grilles de nickel, une section par grille. </li></ol>4. Immunohistochimie Tous les tampons et l&#39;eau doit être filtrée avant utilisation. Jour 5 <ol><li> Déposer une goutte (~ 50 pi) de tampon Tween-20/phosphate 1% (T / PB), pH 7,5, sur un morceau de parafilm propre sur une surface plane. Délicatement ramasser la grille avec des pinces propres par le bord et le faire flotter sur le tampon, la section vers le bas, et incuber pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Égoutter l&#39;excès de liquide de la grille en plaçant côté de la partie sur un papier filtre puis flotter sur la glycine 50 mM dans T / PB pendant 15 min à température ambiante. </li></ol> ÉTAPE CRITIQUE: Pour éviter de trop «report» de solutions d&#39;une gouttelette de solution à l&#39;autre au cours des incubations, les égoutter l&#39;excès de liquide par un léger toucher le bord de la grille n ° 1 sur du papier filtre entre chaque changement de solution. Également éliminer toute solution emprisonnée entre les branches de l&#39;EM Pince de maintien de la grille par effet de mèche doucement avec un ruban de papier-filtre entre les branches de pince tout en ENSUsonner les sections ne se dessèchent pas complètement. <ol start="3"><li> Séchez la grille avec du papier filtre, puis flotter sur une solution de blocage contenant de la BSA 2,5% et 2,5% de sérum de l&#39;animal de l&#39;anticorps secondaire dans T / PB pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Incuber avec l&#39;anticorps primaire (en T / PB) à la température ambiante ou O / N à 4 ° C. Le temps optimal et la température d&#39;incubation, ainsi que la concentration d&#39;anticorps, doivent être déterminées expérimentalement. </li><li> Laver la grille à trois reprises (2 min chacun) avec T / PB. </li><li> Incuber avec l&#39;anticorps secondaire (1:20 anti-lapin ou anti-souris couplé à 10 nm d&#39;or) pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Laver trois fois (2 min chacun) avec T / PB. </li><li> Postfix avec le glutaraldéhyde à 2% en T / PB pendant 5 min. </li><li> Laver trois fois (2 min chacun) avec T / PB et ensuite trois fois (2 min chacun) avec de l&#39;eau filtrée. </li><li> Incuber avec de l&#39;acétate d&#39;uranyle 2% dans de l&#39;eau pendant 10 min. </li></ol> Alors que la grille est la coloration, préparer une émission de CO 2 par chambre Placinpar pièce de Parafilm au centre d&#39;un plat en verre de Pétri. Puis placer 4-6 pastilles de NaOH dans le plat autour du Parafilm à absorber le CO 2 dans l&#39;air. Gardez le couvercle fermé pendant quelques minutes. Utiliser une pipette Pasteur et de transférer rapidement un petit volume de solution de citrate de plomb de Reynolds à l&#39;Parafilm dans le plat en verre de Pétri. Ouvrez le haut juste assez pour insérer la pipette Pasteur afin de minimiser la réintroduction de CO 2 dans la chambre. REMARQUE: Pour faire une solution de Reynolds citrate de plomb, faire bouillir 100 ml d&#39;eau déminéralisée dans un four à micro-ondes et laisser refroidir dans un récipient hermétique. Dans un ballon volumétrique de 50 ml avec bouchon, mélange de nitrate de plomb 1,33 g, 1,76 g de citrate de sodium et 30 ml de l&#39;eau bouillie en agitant vigoureusement pendant 1 min. Puis serrer de façon intermittente pendant 30 min. A cette solution trouble, ajouter 8 ml d&#39;hydroxyde de sodium 1 M et lentement inverser le flacon plusieurs fois. Solution deviendra clair. Porter la solution à 50 ml avec le wa bouillieter. Conserver la solution hermétiquement fermés. Si un précipité apparaît, le jeter et en faire une nouvelle. <ol start="11"><li> Dans trois béchers petits préparer de l&#39;eau chaude bouillante désionisée. Laver l&#39;acétate d&#39;uranyle par trempage de la grille dans le premier bécher et doucement tourbillonner autour pendant 30 sec. Répétez cette étape pour les deux autres béchers. </li><li> Ouvrez la partie supérieure de la boîte de Petri en verre juste assez pour placer la grille sur la goutte de solution de Reynolds citrate de plomb. Si possible, portez un masque tout en faisant ceci pour éviter de respirer le citrate de plomb et d&#39;empêcher la formation d&#39;un précipité. Incuber pendant 10 min. </li><li> Ouvrez le haut juste assez pour retirer la grille. Éviter de respirer sur le citrate de plomb. Laver la grille à trois reprises en le plongeant successivement dans trois béchers avec de l&#39;eau chaude distillée fraîchement bouillie. Laissez sécher la grille sur un morceau de papier filtre, section vers le haut. L&#39;échantillon est maintenant prêt pour le microscope électronique. </li></ol>

<ol>
	<li>Faulk, W. P., Taylor, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunocolloid+method+for+the+electron+microscope.">An immunocolloid method for the electron microscope.</a> Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).</li><li>Stirling, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-+and+affinity+probes+for+electron+microscopy:+a+review+of+labeling+and+preparation+techniques.">Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques.</a> J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).</li><li>Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+to+optimize+post-embedding+single+and+double+staining+for+amino+acid+neurotransmitters.">Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).</li><li>Berryman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+tannic+acid+on+antigenicity+and+membrane+contrast+in+ultrastructural+immunocytochemistry.">Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry.</a> J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).</li><li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methods+for+ultracryotomy+of+CNS+tissue+for+ultrastructural+and+immunogold+analyses.">Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses.</a> J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).</li><li>Stirling, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructual+localization+of+lysozyme+in+human+colon+eosinophils+using+the+protein+A-gold+technique:+effects+of+processing+on+probe+distribution.">Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution.</a> J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).</li><li>Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+osmium-free+method+of+epon+embedment+that+preserves+both+ultrastructure+and+antigenicity+for+post-embedding+immunocytochemistry.">An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).</li><li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin.">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> Embo J. 28, 3027-3039 (2009).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li><li>Zhong, L., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+targets+calmodulin+and+lowers+the+threshold+for+the+induction+of+long-term+potentiation.">Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation.</a> PloS one. 7, e41275 (2012).</li><li>Horisberger, M., Vauthey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelling+of+colloidal+gold+with+protein.+A+quantitative+study+using+beta-lactoglobulin.">Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin.</a> Histochemistry. 80, 13-18 (1984).</li><li>Bendayan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+potential+and+versatility+of+colloidal+gold+cytochemical+labeling+for+molecular+morphology.">A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology.</a> Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).</li><li>Racz, B., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+coflin+in+dendritic+spines.">Spatial organization of coflin in dendritic spines.</a> J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).</li><li>Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+the+immunogold+technique+in+quantitation+of+a+soluble+protein+in+ultra-thin+sections.">Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections.</a> J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).</li><li>Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+antigen,+one+gold?+A+quantitative+analysis+of+immunogold+labeling+of+plasma+membrane+5'-nucleotidase+in+frozen+thin+sections.">One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5'-nucleotidase in frozen thin sections.</a> Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 .</li><li>Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Immunologic+analysis+of+families+with+complement+receptor+deficiency].">[Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency].</a> Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).</li><li>Kehle, T., Herzog, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+protein-gold+complexes+and+cell+surfaces:+a+method+for+precise+quantitation.">Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation.</a> Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).</li><li>Bozzola, J. R., Lonnie, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Electron Microscopy. 30, (1992).</li><li>Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rat+brain+postsynaptic+density+fraction+contains+a+homolog+of+the+Drosophila+discs-large+tumor+suppressor+protein.">The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein.</a> Neuron. 9, 929-942 (1992).</li><li>Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSD-95+is+associated+with+the+postsynaptic+density+and+not+with+the+presynaptic+membrane+at+forebrain+synapses.">PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses.</a> J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).</li><li>Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+localization+of+B-50+phosphoprotein:+the+(ACTH)-sensitive+protein+kinase+substrate+involved+in+rat+brain+polyphosphoinositide+metabolism.">Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism.</a> Brain Research. 328, 381-385 (1985).</li><li>Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+phosphoprotein+B-50/GAP-43+in+neuronal+and+synaptic+plasticity.">Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity.</a> Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).</li><li>Maunsbach, A. A., Bjorn, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+16.">Ch. 16.</a> Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. , 383-426 (1999).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à déclarer.

Dans ce protocole, nous avons adopté la méthode Phend et Weinberg pour le cerveau et les tissus de la moelle épinière pour étudier épines dendritiques dans les cultures rat tranche d&#39;hippocampe. Épines dendritiques dans l&#39;hippocampe CA3-CA1 région sont délicates structures contenant une grande variété de protéines qui jouent un rôle important dans la régulation des fonctions neuronales. La méthode présentée permet une approche équilibrée pour atteindre antigénicité accrue tout en conservant ...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>NAME OF REAGENT</td>
 <td>COMPANY</td>
 <td>CATALOG NUMBER</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60 x 15 mm polystyrene Petri dish</td>
 <td>Falcon</td>
 <td>351007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable scalpel</td>
 <td>EXELINT</td>
 <td>29552</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell culture inserts</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>PICM03050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 nm Goat-anti-rabbit gold</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>25108</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Neurogranin antibody</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>AB5620</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% Picric acid</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>19550</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96% Paraformaldehyde</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>AC41678-0030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25% Glutaraldehyde (EM grade)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G5882</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Uranyl acetate</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>22400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>p-Phenylenediamine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P6001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Platinum (IV) chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>379840</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tannic acid</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>21710</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

post-embedding immunogold labeling of synaptic proteins in hippocampal slice cultures

Immunoélectromicroscopie est un outil puissant pour étudier les molécules biologiques au niveau subcellulaire. Anticorps couplés à des marqueurs denses aux électrons tels que l&#39;or colloïdal peut révéler la localisation et la distribution des antigènes spécifiques dans différents tissus 1. Les deux techniques les plus utilisées sont des techniques de pré-enrobage et de post-intégration. En pré-enrobage immuno-microscopie électronique (EM) techniques, le tissu doit être perméabilisées pour permettre la pénétration d&#39;anticorps avant d&#39;être embarqué. Ces techniques sont idéales pour la préservation des structures, mais la faible pénétration de l&#39;anticorps (souvent, seuls les quelques premiers micromètres) est un inconvénient considérable 2. Les méthodes de marquage post-enrobage peut éviter ce problème, parce que l&#39;étiquetage se fait sur des coupes de tissus fixes où les antigènes sont plus facilement accessibles. Au fil des ans, un certain nombre de modifications ont permis d&#39;améliorer les méthodes de post-enrobage à améliorer l&#39;immunoréactivité et de préserver l&#39;ultrastructure <sup&gt; 3-5. La fixation des tissus est un élément essentiel des études EM. Fixateurs chimiquement réticuler les macromolécules pour verrouiller les structures tissulaires en place. Le choix du fixateur affecte non seulement la préservation mais aussi structurelle antigénicité et le contraste. Tétroxyde d&#39;osmium (OsO 4), le formaldéhyde et le glutaraldéhyde ont été les fixateurs standards depuis des décennies, y compris pour le système nerveux central (SNC) des tissus qui sont particulièrement exposés à des dommages structurels au cours de traitement chimique et physique. Malheureusement, OsO 4 est très réactif et a été montré pour masquer les antigènes 6, résultant en mauvais étiquetage et insuffisante. Des approches alternatives pour éviter la fixation chimique comprennent le gel des tissus. Mais ces techniques sont difficiles à réaliser et nécessitent des instruments coûteux. Pour résoudre certains de ces problèmes et d&#39;améliorer l&#39;étiquetage des tissus du système nerveux central, Phend et al. remplacé OsO 4 avec de l&#39;acétate d&#39;uranyle (UA) et tannique acid (TA), et introduit avec succès des modifications supplémentaires pour améliorer la sensibilité de détection de l&#39;antigène et de préservation de structure dans le cerveau et les tissus de la moelle épinière 7. Nous avons adopté cette osmium sans post-intégration méthode aux tissus du cerveau de rat et d&#39;optimiser la technique de marquage immunologique pour détecter et étudier les protéines synaptiques. Nous présentons ici une méthode pour déterminer la localisation ultrastructurale des protéines synaptiques dans l&#39;hippocampe de rat neurones pyramidaux CA1. Nous utilisons organotypiques d&#39;hippocampe en culture tranches. Ces tranches de maintenir le circuit trisynaptic de l&#39;hippocampe, et sont donc particulièrement utiles pour l&#39;étude de la plasticité synaptique, un mécanisme largement considéré comme sous-tendent l&#39;apprentissage et la mémoire. Organotypiques de coupes d&#39;hippocampe postnatales jour 5 et 6 souris / rat chiots peuvent être préparés comme décrit précédemment 8, et sont particulièrement utiles pour effet de choc aiguë ou surexpriment les protéines exogènes. Nous avons déjà utilisé ce protocole pour characterize neurogranine (Ng), une protéine spécifique des neurones avec un rôle critique dans la régulation de la fonction synaptique 8,9. Nous avons aussi utilisé pour caractériser la localisation ultrastructurale de la calmoduline (CaM) et Ca 2 + / CaM-dépendante protéine kinase II (CaMKII) 10. Comme le montrent les résultats, ce protocole permet une bonne préservation ultrastructurale des épines dendritiques et d&#39;étiquetage efficace de Ng pour aider à caractériser sa distribution dans la colonne 8. En outre, la procédure décrite ici peut avoir une large applicabilité dans l&#39;étude de nombreuses autres protéines impliquées dans les fonctions neuronales.

La figure 2B représente un exemple de la distribution des molécules endogènes Ng à épines dendritiques des neurones pyramidaux CA1 hippocampique. Grilles de nickel avec ultrafines (60 nm) tissus contenant la région CA1 de l&#39;hippocampe (comme on le voit sur ​​la figure 2A) étaient couverts de 1% T / PB, 50 mM de glycine, puis bloquées avec de la BSA 2,5% et 2,5% de sérum avant l&#39;incubation avec des anticorps anti Ng-anticorps. Après lavage avec T / PB, les grilles o...

Watch this Scientific Journal Video about Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures at JoVE.com

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

La localisation et la distribution des protéines fournissent des informations importantes pour la compréhension de leurs fonctions cellulaires. La résolution spatiale supérieure de la microscopie électronique (EM) peut être utilisé pour déterminer la localisation subcellulaire d&#39;un antigène donné à la suite immunohistochimie. Pour les tissus du système nerveux central (SNC), la préservation de l&#39;intégrité structurelle tout en maintenant antigénicité a été particulièrement difficile en EM études. Ici, nous adoptons une procédure qui a été utilisée pour préserver les structures et les antigènes du système nerveux central d&#39;étudier et de caractériser les protéines synaptiques dans l&#39;hippocampe de rat neurones pyramidaux CA1.

Étiquetage immunologique post-enrobage des protéines synaptiques dans l&#39;hippocampe cultures Slice

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

post-embedding-immunogold-labeling-synaptic-proteins-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.0K vues.  Medical College of Wisconsin. La localisation et la distribution des protéines fournissent des informations importantes pour la compréhension de leurs fonctions cellulaires. La résolution spatiale supérieure de la microscopie électronique (EM) peut être utilisé pour déterminer la localisation subcellulaire d'un antigène donné à la suite immunohistochimie. Pour les tissus du système nerveux central (SNC), la préservation de l'intégrité structurelle tout en maintenant antigénicit...

Vidéo: Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Préparation des oligomères β-amyloïde 1-42 Et induction de la plasticité synaptique Dépréciation sur les coupes d&#39;hippocampe

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Recherche

Neurosciences

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Le modèle organotypiques d&#39;hippocampe Culture Slice d&#39;examen des lésions neuronales

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Cultures organotypiques d&#39;hippocampe Slice

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

L&#39;analyse de la morphologie de Purkinje cellules dendritiques dans les cultures organotypique

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Diffusion latérale et l&#39;exocytose des protéines membranaires dans des neurones en culture évaluée à l&#39;aide de récupération de fluorescence et de fluorescence de perte de photoblanchiment

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Cultures organotypique de tranche d&#39;étudier Oligodendrocyte Dynamics et myélinisation

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

L&#39;analyse de neurovasculaire Rénovation dans Entorhino-hippocampe cultures organotypique de tranche

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

Enquête de Synaptic étiquetage / capture et de la Croix-capture à l&#39;aide aiguë coupes d&#39;hippocampe des rongeurs

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Haute résolution quantitative immunomarquage Analyse des Récepteurs Membranaires au rétiniennes Synapses ruban

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Hippocampe organotypiques comme modèle d’étude Neuroprotection et son caractère invasif des cellules tumorales

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...