Les auteurs tiennent à remercier le Dr Deirdre Nelson pour leurs précieux commentaires et pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été financé par des subventions du NIH DE019244, DE019197 et DE021841 à ML, F32DE02098001 au SSJ, et C06 RR015464 à l&#39;Université d&#39;Albany, SUNY.

Le protocole comporte quatre grandes étapes, comme le montre la figure 1. Toutes les étapes sont décrites en détail. Construction d&#39;adénovirus et de purification virale doit être effectuée avant la collecte d&#39;organes destiné à être utilisé dans la transduction génétique des ébauches découpées épithéliales. Toutes les précautions de sécurité standard BSL-2 doivent être suivies lorsque l&#39;on travaille avec des adénovirus. 1. Embryonnaires de souris glande sous-maxillaire (SMG) Récolte et Microdissection <ol><li> Euthanasier timed-souris femelles enceintes (souche consanguine CD-1 ou ICR) utilisant le CO 2 narcose, suivie par dislocation cervicale et les chaînes de récolte des embryons de souris au jour embryonnaire 13 (E13, 3-5 bourgeons épithéliaux) les procédures suivantes, approuvées par le IACUC institutionnelle comité. La journée de découverte bouchon vaginal est désigné comme E0. Glandes salivaires peuvent également être récoltées et cultivées à l&#39;étape E12 quand il ya un seul bourgeon principal et la tige avec des fentes débutantà lancer. SMG avant ce stade nécessitent des conditions de culture différentes de celles indiquées ici. </li><li> Transfert chaînes embryon dans stériles boîtes de 10 cm de culture de tissus remplis avec 25 ml de DMEM / Ham &#39;s Medium F12 (F12) manque le rouge de phénol (Life Technologies) et additionné de 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine (pen-strep, Life Technologies). </li><li> L&#39;aide d&#39;un scalpel stérile (# 11 lames) et une pince (# 5, Outils Fine Science, 11252-20), retirer les embryons des sacs séparés dans une boîte de 10 cm contenant 25 ml de DMEM/F12 + stylo-streptococcique. </li><li> Couper les têtes d&#39;embryons avec une coupe en biais juste en dessous de la mâchoire inférieure. </li><li> Isoler les mandibules inférieures des têtes sous un microscope à dissection stéréo avec une base de lumière transmise (Nikon SMZ645 ou équivalent) à l&#39;aide d&#39;un coupe-dessous de la mâchoire supérieure. Placez les tissus au-dessus d&#39;une pièce supplémentaire de verre plutôt que directement sur le composant en verre de la base du microscope. </li><li> Recueillir les mandibules inférieures dans 3 ml de DMEM/F12 + stylo-strep dans un stérile boîte de 35 mm de culture tissulaire. </li><li> Déposer une tranche de la mandibule sur la platine du microscope disséquant sorte que la languette se trouve en bas de la tranche, mais est orienté vers la position 12:00 heures. </li><li> Utilisation d&#39;un côté de deux pinces croisées dans un mouvement de ciseaux, retirez et jetez le troisième 1/3 inférieur de la tranche mandibule. </li><li> Mettez la tranche de 90 ° vers la droite (si droitier) et, à l&#39;aide d&#39;un ciseau coupe avec la pince, couper la partie supérieure de la tranche mandibule (sans couper la langue) à mi-chemin dans la tranche. </li><li> Pelez l&#39;excès de tissu et retirez-le de suite pour exposer les mitraillettes dessous. Il y aura une de chaque côté à proximité de la base de la langue. </li><li> En utilisant une paire de pinces pour maintenir le tissu par la langue, utilisez la pince pour taquiner les autres SMG loin de la langue. Répétez l&#39;opération pour l&#39;autre glande. </li><li> Recueillir les glandes salivaires microdisséqués dans 3 ml de DMEM/F12 + stylo-strep dans un nouveau tissu stérile 35 mmboîte de culture. Remarque: les glandes sous-maxillaires plus grands (3-5 bourgeons épithéliaux) le long de la glande sublinguale connecté petite (1 bouton) peuvent être cultivées intactes en accédant directement à l&#39;étape 4 et l&#39;exécution des étapes 4.1, 4.3, et 4.4, comme décrit précédemment 2,8. </li></ol> 2. SMG séparation Rudiment épithéliale <ol><li> Lieu 5 (ou plus) des glandes salivaires dans un fond de verre, 50 mm de diamètre micropuits plat (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F) contenant 200 ul de solution saline équilibrée de Hank (HBSS dépourvu de Ca + +, Mg + +, Life Technologies) contenant 0,4% (v / v) dispase (Life Technologies, cat. no. 17105-041) et incuber pendant 15 min à 37 ° C. </li><li> Après l&#39;incubation, à l&#39;aide d&#39;une pipette stérile 200 pi, aspirer délicatement la solution dispase sans perturber les glandes. Immédiatement ajouter 200 ul de milieu contenant DMEM/F12 5% (p / v) de BSA (DMEM/F12-BSA, pré-stérilisé avec un filtre 0,22 pm) pour neutraliser la dispase. </li> &lt;li&gt; Sous la loupe binoculaire, à l&#39;aide d&#39;une pince à pointes fines (# 5 Dumostar, Outils Fine Science, 11295-20), séparez doucement le mésenchyme desserré autour des bourgeons SMG épithéliales et les conduits, en prenant soin de laisser l&#39;épithélium intact . </li><li> Pré-humide et stérile pointe de la pipette 200 ul avec DMEM/F12-BSA médias et pipeter doucement sur les rudiments épithéliales dans un nouveau diamètre de 50 mm micropuits plat contenant 200 pi de DMEM/F12 + stylo-streptococcique. Utilisez une haute qualité 200 ul pointe de la pipette avec un bord lisse. </li><li> Dans le plat qui contient les pièces mésenchyme, jeter tout tissu non-mésenchymateuse, y compris les glandes sublinguales et les bourgeons détachés des glandes sous-maxillaires. </li></ol> 3. L&#39;infection adénovirale de Rudiments épithéliales <ol><li> Faire 200 ul de médias infection virale en diluant l&#39;adénovirus d&#39;intérêt en DMEM/F12 + stylo-streptococcique dans un microtube de sorte que le titre de la solution résultante est de 1x10 8 -10 9 PFU. Latitre optimal requis pour les différents virus peuvent varier. Il est important d&#39;utiliser du chlorure de césium (CsCl)-purifiée préparations virales de l&#39;efficacité d&#39;absorption optimale. </li><li> Retirez le support de la boite contenant les cinq rudiments épithéliales. Rapidement ajouter 200 ul des médias infection, en gardant les rudiments humide en tout temps. Prendre les précautions nécessaires lors de la manipulation du virus et l&#39;élimination des embouts de pipettes contaminées. Désinfectez toutes les surfaces contaminées par des virus avec une solution javellisée à 10%. </li><li> Déplacez les rudiments épithéliales loin les uns des autres avec des pinces pour les empêcher de coller ensemble et de leur permettre de se déposer au fond de la plaque. Incuber rudiments dans les médias viraux pendant 1 heure à température ambiante. Pendant l&#39;incubation, séparer les rudiments, si elles se déplacent côte à côte. Balancement excessif ou mouvement permettra aux glandes à s&#39;agglutiner. </li><li> Après incubation, retirer délicatement les médias virale contenant et le jeter de façon appropriée, en prenant soin de ne pas perturber le rudiments. Ajouter 200 ul de DMEM/F12 + stylo-streptococcique. Répéter ce lavage au moins deux fois plus et remplacez-le par 200 pi de DMEM/F12 + stylo-strep médias. Ces lavages sont essentielles pour éliminer tout virus qui n&#39;est pas très attaché à l&#39;épithélium et à prévenir l&#39;infection du mésenchyme. </li><li> Incuber rudiments épithéliales avec 200 ml de DMEM/F12 contenant 2% (v / v) Matrigel (BD Biosciences, 356 231) pendant 20 min. Nous constatons que cette incubation courte Matrigel minimise la régression des fentes existantes pendant la période de culture initiale, mais cette étape peut être supprimée si l&#39;exposition à Matrigel n&#39;est pas souhaitée. </li></ol> 4. Culture ex vivo de mitraillettes recombinés <ol><li> Placez chaque rudiment, un à la fois, en utilisant un pré-mouillage pointe de la pipette 200 ul, au sommet d&#39;une encoche (petite coupure) 13 mm, 0,1 um Nuclepore membrane Track-Etch filtre (Whatman) flottant sur 200 pi de milieu de culture ( 5 / rudiments de filtre) dans une plaque de microtitration à fond de verre. Les milieux de cultureest la suivante: DMEM/F12 + stylo-strep contenant 50 ug / ml de transferrine et 150 l&#39;acide ascorbique pg / ml, comme décrit précédemment 2,8. La transferrine est connue pour stimuler la survie et la morphogenèse de ramification des glandes salivaires et des explants d&#39;organes autres 9. L&#39;addition d&#39;acide ascorbique a été montré pour stimuler la ramification SMG. 10 Il est connu pour agir comme cofacteur dans de nombreuses réactions d&#39;hydroxylation de voies métaboliques (telles que l&#39;hydroxylation de proline au cours de la formation de fibres de collagène 11) et stimule également la production de fibronectine et la laminine dans des explants d&#39;autres organes 12. </li><li> Retirez les médias comme beaucoup sur le dessus du filtre que possible après l&#39;ajout de chaque rudiment épithélial. Trop de médias sur le dessus du filtre peut entraîner le filtre à couler, tandis que les moins médias rend le placement des rudiments et mésenchyme beaucoup plus facile. Les supports en excès peut être éliminé soit avec une pointe de pipette ou en utilisant une pince pour saisir le matériau entre les pointes. </li><li> Placer les morceaux mésenchymateuses dérivées vientm trois à quatre glandes sur le dessus et / ou autour de chaque ébauche épithéliale. Retirez tous les supports supplémentaires qui entourent les glandes pour éviter tout mouvement du mésenchyme loin des rudiments. Mésenchyme provenant de plus de glandes n&#39;est pas bénéfique, mais moins peut être préjudiciable à la croissance rudiment épithélial. </li><li> Incuber SMGs recombinés dans un incubateur humidifié (95% d&#39;air / 5% CO 2) à 37 ° C pendant 48 -72 heures, comme vous le souhaitez. </li><li> Acquérir clair et / ou des images fluorescentes de glandes direct à 0 h (si désiré), 2 h après recombinaison et chaque h 24 par la suite sur un microscope optique inversé, debout, ou en stéréo équipé d&#39;un appareil photo numérique en utilisant un objectif de grossissement 4x ou 5x à capturer toute la glande recombiné dans une seule trame de vue. Images de la glande salivaire montrer le meilleur contraste en utilisant soit le paramètre fond clair ou l&#39;anneau de phase approprié placé à mi-chemin dans la voie de la lumière (ce qui n&#39;est pas possible sur les microscopes entièrement automatisés). Contraste de phase standard n&#39;estnécessaire t depuis la glande est épais et crée un contraste. </li><li> À la fois des points désirés, SMGs recombinés peuvent être fixées pendant 20 minutes avec la solution de fixation en paraformaldéhyde 2% (PFA) dans du PBS 1X contenant 5% (p / v) de saccharose (pour mieux préserver la structure cellulaire interne en maintenant les cellules en un état isosmotique). Contrairement à 4% PFA, 2% PFA conservera une quantité importante du signal de la GFP, si le fixateur est complètement retiré après fixation. Glandes peuvent être stockées pendant 1 semaine dans du PBS 1X dans l&#39;obscurité à 4 ° C jusqu&#39;à ce que l&#39;ensemble de montage immunocytochimie et microscopie confocale est effectuée, comme indiqué précédemment 3,6,13-15. Idéalement, immunocytochimie et d&#39;imagerie doit être réalisée rapidement après la fixation d&#39;obtenir des images de meilleure qualité. Glandes peuvent également être lysées dans un tampon RIPA pour SDS-PAGE suivie d&#39;une analyse Western blot. </li></ol>

<ol>
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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La technique ex vivo recombinaison épithélio-mésenchymateuse a d&#39;abord été publié pour glandes salivaires sous-maxillaires en 1981 16. Dans ce protocole, on élargir la méthode d&#39;origine, en utilisant une infection adénovirale de manipuler l&#39;expression des gènes de cellules épithéliales dans le cadre d&#39;une glande recombiné. Nous montrons que le pourcentage des cellules épithéliales infectées par l&#39;adénovirus, alors que le pourcentage de cellules qui sont infectées...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> DMEM / Ham &#39;s F12 moyen sans rouge de phénol </td><td> Life Technologies </td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td> La pénicilline et la streptomycine </td><td> Life Technologies </td><td> 15070-163 </td><td> Actions 10X </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Life Technologies </td><td> 17105-041 </td><td> Congelez aliquotes à usage unique à -20 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A2934-100G </td><td> Fraction V, l&#39;endotoxine bas </td></tr><tr><td> Adeno-X-GFP </td><td> BD Biosciences </td><td> 8138-1 </td><td> Devrait être un titre élevé (1x10 10 pfu / ml). CsCl virus purifiés sont plus efficaces que la colonne virus purifié dans ce test. </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde 16% </td><td&gt; Sciences microscopie électronique </td><td> 15710 </td><td> Dilué à 2% dans du PBS avec du sucrose 5% (p / v) </td></tr><tr><td> 1X tampon phosphate salin (PBS) </td><td> Life Technologies </td><td> 70011-044 </td><td> Préparé en stock 10X </td></tr><tr><td> Hank Balanced Salt Solution </td><td> Life Technologies </td><td> 14175095 </td><td> pas de calcium, de magnésium non, non rouge de phénol </td></tr><tr><td> Transferrine </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td> 25 mg / ml de solution mère dans du DMEM/F12 médias. Congeler à usage unique aliquotes à -20 ° C </td></tr><tr><td> Acide L-ascorbique (vitamine C) </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td> 75 mg / ml de solution mère dans du DMEM/F12 media.Freeze à usage unique aliquotes à -20 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 1. Liste des réactifs nécessaires pour SMG protocole de recombinaison. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td> 10 cm plats en plastique stériles </td><td> Corning </td><td> 430167 </td><td> Des plaques de culture de tissus non-traitées peuvent aussi être utilisés. </td></tr><tr><td> Stéréo microscope à dissection avec socle de diascopie </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td> Toute stéréo microscope à dissection peut être utilisé qui a une base de lumière transmise. </td></tr><tr><td> 35 mm boîtes de culture tissulaire </td><td> Faucon </td><td> 353001 </td><td> Des plaques de culture de tissus non-traitées peuvent aussi être utilisés. </td></tr><tr><td> 50 mm de diamètre plats micropuits </td><td> MatTek Corporation </td><td> P50-G-1.5-14F </td><td></td></tr><tr><td> Filtres à membrane Nuclepore Track-Etch </td><td> Whatman </td><td> 110405 </td><td> 13 mm de diamètre, 0,1 mm diamètre des pores </td></tr><tr><td> Widefield microscope à fluorescence </td><td> Carl Zeiss, USA </td><td> Axio Observer Z1 </td><td> Toute microscope à fluorescence (debout, inverted ou loupe binoculaire stéréo) peut être utilisé pour contrôler l&#39;expression de GFP à faible grossissement avec un appareil photo numérique jointe. </td></tr><tr><td> Microscope confocal </td><td> Leica Microsystems </td><td> TCS SP5 </td><td> La microscopie confocale est nécessaire de voir les structures cellulaires détaillées. Un microscope confocal peut être utilisé. </td></tr><tr><td> Timed-souris femelles enceintes, souche CD-1 ou ICR </td><td> Charles River Labs </td><td></td><td> Les embryons sont récoltés au jour 13 (avec journée de découverte prise désigné comme jour 0). </td></tr><tr><td> Lame de bistouri n ° 11 </td><td> Outils Fine Science </td><td> 10011-00 </td><td></td></tr><tr><td> Manche de bistouri n ° 3 </td><td> Outils Fine Science </td><td> 10003-12 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 pinces inox alliage, X 0.05mm 0.02mm </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11252-20 </td><td> Idéal pour la récolte de glandes à partir d&#39;embryons </td></tr><tr><td&gt; Dumont # 5 pinces dumostar alliage, X 0.05mm 0.01mm </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11295-20 </td><td> Pointes fines sont nécessaires pour retirer de l&#39;épithélium mésenchyme. Aiguilles de tungstène peuvent également être utilisés. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 2. Matériel utilisé pour SMG protocole de recombinaison. </td></tr></tbody></table>

genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures

Morphogenèse de ramification se produit pendant le développement de nombreux organes, et la glande sous-maxillaire embryonnaire de souris (SMG) est un modèle classique pour l&#39;étude de la morphogenèse de ramification. Dans la GSM développement, ce processus itératif implique des mesures de bourgeon épithélial et conduit la formation, en fin de compte à donner naissance à un réseau ramifié de complexe acini et des canaux, qui servent à produire et à modifier / transport de la salive, respectivement, dans la cavité buccale 1 - 3. La membrane basale épithéliale associée et les aspects du compartiment mésenchymateux, y compris les cellules mésenchymateuses, facteurs de croissance et la matrice extracellulaire, produites par ces cellules, sont essentiels pour le mécanisme de branchement, bien que la façon dont les événements cellulaires et moléculaires sont coordonnés reste mal comprise 4 . L&#39;étude des mécanismes moléculaires de conduite avancées morphogenèse épithéliale notre compréhension des mécanismes du développement et donne un aperçu possible régénérerapproches de médecine Ative. Ces études ont été entravées par le manque de méthodes efficaces pour la manipulation génétique de l&#39;épithélium salivaire. À l&#39;heure actuelle, la transduction adénovirale représente la méthode la plus efficace pour cibler les cellules épithéliales des glandes adultes in vivo 5. Toutefois, dans des explants embryonnaires, mésenchyme dense et la membrane basale entourant les cellules épithéliales entrave l&#39;accès virale dans les cellules épithéliales. Si le mésenchyme est supprimée, l&#39;épithélium peuvent être transfectées en utilisant des adénovirus, et rudiments épithéliales peut reprendre la morphogenèse de ramification en présence de Matrigel ou la laminine-111 6,7. Mésenchyme croissance sans rudiment épithélial nécessite également un supplément additionnel de facteurs de croissance solubles et n&#39;est pas totalement récapituler morphogenèse de ramification comme cela se produit dans les glandes intactes 8. Nous décrivons ici une technique qui facilite la transduction adénovirale des cellules épithéliales et de la culture de l&#39;e transfectéespithelium avec mésenchyme associé. Après microdissection des PM embryonnaires, l&#39;enlèvement du mésenchyme, et l&#39;infection virale de l&#39;épithélium avec un adénovirus GFP contenant, nous montrons que l&#39;épithélium se recombine spontanément avec mésenchyme non infecté, récapitulant intacte la structure SMG glandulaire et morphogenèse de ramification. La population de cellules génétiquement modifiées épithéliale peut être facilement contrôlé en utilisant les méthodes classiques de microscopie par fluorescence, si étiquetées par fluorescence constructions adénovirales sont utilisés. Le procédé de recombinaison tissu décrit ici est actuellement la méthode la plus efficace et accessible pour la transfection de cellules épithéliales avec un vecteur de type sauvage ou mutant dans une construction complexe tissu 3D qui ne nécessite pas la production d&#39;animaux transgéniques.

Le flux des principales étapes expérimentales est présentée dans la figure 1. Un exemple d&#39;une SMG intacte, un rudiment isolé épithéliale, et son mésenchyme correspondant sont présentés dans la figure 2. Images en fond clair de mitraillettes recombinés, qui continuent à subir morphogenèse de ramification lorsque cultivées ex vivo pendant les temps indiqués, sont présentés dans la figure 3. Glandes recombinés cultivées pendant 48 heures é...

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Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Une technique pour manipuler génétiquement les cellules épithéliales au sein de l&#39;ensemble<em&gt; Ex vivo</em&gt; Embryonnaires de souris en culture glandes sous-maxillaires (SMG) en utilisant le transfert de gènes viraux est décrite. Cette méthode tire parti de la capacité innée de SMG épithélium et le mésenchyme spontanément recombiner après la séparation et l&#39;infection des rudiments épithéliales avec des vecteurs adénoviraux.

Modification génétique et la recombinaison des cultures d&#39;organes salivaires Gland

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

genetic-modification-recombination-salivary-gland-organ

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K vues.  University at Albany, SUNY. Une technique pour manipuler génétiquement les cellules épithéliales au sein de l'ensemble Ex vivo Embryonnaires de souris en culture glandes sous-maxillaires (SMG) en utilisant le transfert de gènes viraux est décrite. Cette méthode tire parti de la capacité innée de SMG épithélium et le mésenchyme spontanément recombiner après la séparation et l'infection des rudiments épithéliales avec des vecteurs adénoviraux.

Vidéo: Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

Dissection des glandes salivaires de l&#39;intestin moyen et Ae. aegypti

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Recherche

Biologie

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Méthode pour la culture d&#39;embryons de poulet Early ex vivo (Nouvelle Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Double Mont entier hybridation in situ d&#39;embryons de poulet début

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

Préparation de la 2-dGuo cultures traitées orgue Thymus

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

L&#39;isolement des cellules souches de la souris salivaires Gland

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

Méthylation de l&#39;ADN: bisulfite de modification et d&#39;analyse

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Cultures alternatives pour souches pluripotentes humaines production cellulaire, le maintien et l&#39;analyse génétique

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

ADN électroporation, isolement et d&#39;imagerie de myofibres

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful industrial commodities. Recent advances in synthetic biology have led to development of several cloning toolkits such as CyanoGate, a standardized modular cloning system for building plasmid vectors for subsequent transformation or conjugal transfer into cyanobacteria. Here we outline a detailed method for assembling a self-replicating vector (e.g., carrying a fluorescent marker expression cassette) and conjugal transfer of the vector into the cyanobacterial strains Synechocystis sp. PCC 6803 or Synechococcus elongatus UTEX 2973. In addition, we outline how to characterize the performance of a genetic part (e.g., a promoter) using a plate reader or flow cytometry.

Here, we present a protocol describing how to i) assemble a self-replicating vector using the CyanoGate modular cloning toolkit, ii) introduce the vector into a cyanobacterial host by conjugation, and iii) characterize transgenic cyanobacteria strains using a plate reader or flow cytometry.

Modification génétique des cyanobactéries par conjugaison à l'aide de la boîte à outils de clonage modulaire CyanoGate

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and the Plasmodium parasites that cause malaria, accumulate in the secretory cavities of SG cells. Here, they are poised for transmission to their vertebrate hosts during a subsequent blood meal. As adult glands form as an elaboration of larval SG duct bud remnants that persist beyond early pupal SG histolysis, the larval SG is an ideal target for interventions that limit disease transmission. Understanding larval SG development can help develop a better understanding of its morphology and functional adaptations and aid in the assessment of new interventions that target this organ. This video protocol demonstrates an efficient technique for isolating, fixing, and staining larval SGs from Anopheles gambiae mosquitoes. Glands dissected from larvae in a 25% ethanol solution are fixed in a methanol-glacial acetic acid mixture, followed by a cold acetone wash. After a few rinses in phosphate-buffered saline (PBS), SGs can be stained with a broad array of marker dyes and/or antisera against SG-expressed proteins. This method for larval SG isolation could also be used to collect tissue for in situ hybridization analysis, other transcriptomic applications, and proteomic studies.

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

The adult mosquito salivary gland (SG) is required for the transmission of all mosquito-borne pathogens to their human hosts, including viruses and parasites. This video demonstrates efficient isolation of the SGs from the larval (L4) stage Anopheles gambiae mosquitoes and preparation of the L4 SGs for further analysis.

Dissection et immunocoloration des glandes salivaires larvaires des moustiques anophèles gambiens

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and ...