Ce protocole permet l’évaluation des interactions cellule à cellule entre divers types de cellules dans un tissu, et des manipulations moléculaires et pharmacologiques ex vivo qui seraient moins faisables in vivo. Le principal avantage de cette technique est la période prolongée pendant que ces sections tissulaires pourraient être maintenues dans la culture permettant leur évaluation à des moments ultérieurs. Cette technique permettra un dépistage plus rapide des composés thérapeutiques pour corriger les dommages causés par les glandes salivaires et réduira probablement le nombre de souris utilisées pour ces études.
Nous prévoyons d’utiliser cette technique pour comprendre la réponse des glandes salivaires à la radiothérapie à des moments intermédiaires et pour activer et désactiver les gènes à intervalles spécifiques. L’aspect le plus difficile de cette procédure est la sectionnement des tissus et la prévention de la perte de sections tissulaires pendant la culture et les étapes de coloration. Avant de commencer la procédure désinfecter les composants vibratomes détachables avec 70% d’éthanol, suivie d’une stérilisation UV pendant au moins 30 minutes.
Fixez une feuille supplémentaire de film de laboratoire au-dessus du plateau tampon pour empêcher la glace de tomber et remplissez la chambre de glace de glace concassée. Retirez le film de laboratoire du plateau tampon et remplissez le plateau tampon de 100 millilitres de PBS glacé complété par de l’ampicilline de streptomycine à 1 %, ou PSA. Placez ensuite une lame de rasoir en acier inoxydable dans le porte-lames et utilisez un tournevis pour faciliter l’ajustement de l’angle de la lame.
Après avoir isolé les glandes salivaires, placez le tissu récolté dans un plat stérile de culture de 30 millimètres contenant deux millilitres de PBS glacé complété par 1% de PSA. À l’aide de forceps autoclavés, transférer les glandes au fond de la moisissure d’intégration et couvrir le tissu avec liquide 3% faible point de fusion agarose. À l’aide de forceps, réglez le tissu au milieu du bloc dans le plan approprié et placez le bloc d’agarose sur la glace pendant 10 minutes.
Lorsque l’agarose s’est durcie, faites glisser soigneusement une lame de rasoir autour du bord extérieur du moule et laissez le bloc glisser sur le film de laboratoire stérilisé aux UV. Utilisez la lame de rasoir pour découper une boîte d’agarose contenant la glande salivaire, en prenant soin que le plan de la section est droit et parallèle au côté opposé du bloc. Utilisez le superglue pour fixer le bloc à la surface de coupe et obtenir 50 ou 90 sections micrométriques d’épaisseur sur le vibratome à une vitesse de 0,075 millimètre par seconde à une fréquence de 100 hertz.
Ensuite, utilisez un pinceau autoclavé cheveux naturels pour transférer les sections dans les puits individuels d’un plat de culture de tissu de 24 puits contenant un millilitre de PBS glacé par ainsi qu’ils sont obtenus. Lorsque toutes les sections ont été acquises, utilisez et autoclaved micro spatule pour transférer les sections en inserts individuels de membrane de taille de coulée de 0,4 micromètre dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits contenant 300 microlitres de milieu de culture vibratome par puits. Placez ensuite la plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avec humidité, rafraîchissez le milieu au fond de chaque puits et ajoutez 40 microlitres d’inserts moyens à la membrane tous les deux jours au besoin pendant une température jusqu’à 30 jours.
Pour irradier les tissus, transférez les sections à l’installation de l’irradiateur dans un contenant recouvert de polystyrène afin d’éviter les fluctuations de température et de traiter les sections avec une seule dose de rayonnement de cinq grades. Retournez ensuite les cultures dans un incubateur de culture tissulaire sans rayonnement. Pour la coloration des tissus par anticorps, lavez les échantillons avec au moins deux lavages de cinq minutes dans le PBS stérile et fixez les sections en paraformaldéhyde de 4 % à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain matin laver les sections trois fois avec PBS complété avec 1% albumine sérique bovine et 0,1%Triton X-100, ou PBT, avant de perméabiliser les tissus avec 0,3%Triton X-100 en PBS pendant 30 minutes. Lavez les sections trois fois dans PBT comme démontré avant de bloquer n’importe quelle liaison non spécifique avec l’agent de blocage complété avec le sérum normal de chèvre de 1% pendant une heure. Puis incuber les sections pendant la nuit dans l’anticorps primaire approprié d’intérêt.
Les images lumineuses de microscope de champ lumineux des cultures primaires de section salivaire de glande 2D révèlent la présence des tissus viables pendant jusqu’à 30 jours de culture sous toutes les concentrations de supplémentation de sérum examinées. La capacité proliférative de ces tranches de culture représentatives a été évaluée par immunostaining de Ki-67 et ce marqueur a été observé à tous les points de temps évalués. Un faible niveau de cellules positives Cleaved Caspase-3 a également été observé à tous les points de temps avec une petite augmentation détectée au jour 30.
La coloration d’E-cadherin a été observée dans les tranches submandibulaires et parotides de glande tout au long de la période de culture de 30 jours. Les cellules actin-positives lisses de muscle et l’organisation cytosquelettique ont été détectées aux niveaux semblables tout au long de la période de culture. De même, des protéines fonctionnelles telles que l’amylase et l’aquaporine-5 ont également été détectées, bien qu’au jour 14 la coloration ait semblé être plus granulaire.
En revanche, CD31 et TUBB3 n’ont pas été systématiquement exprimés tout au long de la période de culture dans les deux glandes, ce qui suggère qu’il existe une diversité de constituants tissulaires maintenus pendant différentes périodes de temps tout au long de la période de culture de 30 jours. Les tranches irradiées dans les deux glandes ont imité les changements apoptotiques et cytosquelettiques proliférants semblables observés in vivo. Soyez prudent lorsque vous déplacez les sections du bain PBS dans le vibratome à la plaque de culture et pendant les procédures de coloration car les sections sont petites et délicates.
Les cultures de section peuvent être traitées avec la plupart des méthodes de culture de lignée cellulaire avec l’avantage supplémentaire d’être dans des conditions qui sont plus étroitement liées à in vivo. Nous prévoyons qu’il s’agit d’une technique puissante que d’autres chercheurs pourraient intégrer à leurs expériences. La lame sur le vibratome est forte et peut être difficile à insérer afin d’être fatigué lors de la manipulation.
Aussi trypan colorant bleu est toxique et cancérigène alors suivez toutes les directives PP.
