Les bactéries intestinales peuvent affecter de multiples processus physiologiques des insectes hôtes. La préparation et le maintien des larves axeniques sont un outil puissant pour étudier les fonctions des bactéries intestinales. Les principaux avantages de ce protocole sont que la culture de tissus végétaux est utilisée pour obtenir des feuilles exemptes de germes pour élever des insectes mangeurs de feuilles d’axenique dérivés d’œufs stérilisés en surface, et que cette méthode n’est pas limitée par des régimes artificiels.
Cette méthode est pratique et augmente la visibilité du maintien des insectes axeniques pour les futures études sur les bactéries intestinales, en particulier pour les insectes non modèles sans régime artificiel bien développé. Maintenir la population de P.versicolora dans une chambre de croissance à 27 degrés Celsius et 70% d’humidité relative, avec une photopériode de lumière de 16 heures et une photopériode sombre de huit heures. Placez les insectes dans des boîtes en plastique perforées avec du papier absorbant humide incliné et nourrissez-les de branches de peuplier fraîches.
Vaporisez de l’eau propre sur le papier absorbant pour maintenir l’humidité et changez les branches tous les deux jours. Isolez les adultes pour la ponte après la nymphose et nourrissez-les de feuilles tendres pour obtenir plus d’œufs. Dans les 24 heures, ramassez les œufs nouvellement pondus et placez-les sur du papier absorbant humide pendant 60 heures pour préparer les larves d’axenique.
Préparer le milieu MS dans un milligramme par millilitre d’acide alpha-naphtalène acétique ou de solutions mères NAA. Dans une hotte de biosécurité, ajouter 50 microlitres de la solution mère NAA à 500 millilitres de milieu MS et agiter pour bien mélanger. Versez ensuite environ 50 millilitres par récipient de culture tissulaire et attendez la solidification.
Stériliser les scalpels et les pinces dans une flamme de lampe à alcool dans la hotte de biosécurité. Couper des segments de tige de trois à quatre centimètres avec des bourgeons apicaux ou des bourgeons latéraux de plants de peuplier à environ un mois de croissance et les insérer dans le milieu de culture, un ou deux segments de tige par récipient. Incuber ces segments de tige dans une chambre de croissance pendant environ 30 jours.
Et utilisez ces feuilles exemptes de germes pour nourrir les larves axeniques. Boîtes de Petri autoclave, pinceaux, papier filtre, eau distillée dans une boîte de Petri contenant du milieu de gélose LB. Placer les feuilles avec des œufs adhérents dans une boîte de Pétri.
Ensuite, retirez soigneusement les œufs des feuilles à l’aide d’une pince et transférez-les dans une autre boîte de Pétri. Lavez ces œufs avec de l’éthanol à 75% pendant huit minutes. Répétez ensuite le lavage quatre fois avec de l’eau stérile.
Transférer les œufs sur un milieu de gélose LB pour préserver l’humidité pour l’éclosion. Placez la boîte de Petri dans une chambre de croissance et attendez que les œufs éclosent dans les 24 heures. Dans une hotte de biosécurité, carroyez trois morceaux de papier filtre humide dans une boîte de Pétri et placez des feuilles de peuplier sans germes sur le papier.
Recueillez les larves et placez-les sur les feuilles. Scellez la boîte de Petri avec Du Parafilm et incuvrez-la dans une chambre de croissance. Changez les feuilles tous les deux jours.
Pour les groupes élevés de manière conventionnelle, transférez les œufs des feuilles dans une boîte de Pétri contenant du papier filtre humide et nourrissez ces larves avec des feuilles de peuplier exemptes de germes. Sélectionnez au hasard trois larves du premier, du deuxième et du troisième stade parmi les groupes exempts de germes et élevés de manière conventionnelle. Disséquez les larves du troisième stade avec des ciseaux et des pinces stériles au stéréomicroscope et recueillez leurs intestins dans des tubes de microcentrifugation.
Recueillir intactes les larves du premier et du deuxième stade dans des tubes. Ajouter 100 microlitres de PBS et trois billes d’acier aux tubes de 1,5 millilitre et broyer les tissus en homogénats à l’aide d’un homogénéisateur battant les billes. Ajouter 100 microlitres de l’homogénat au milieu de la gélose LB et plaquer à l’aide d’une tige d’étalement en verre stérile.
Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Observez ensuite les colonies bactériennes. Extrayez l’ADN total des tissus précédemment obtenus à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN et mesurez la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre.
Amplifier le gène de l’ARNr 16S bactérien à l’aide d’amorces universelles d’ARNr 16S avec PCR, en mettant en place la réaction décrite dans le manuscrit du texte. Conservez les produits PCR à quatre degrés Celsius jusqu’à une analyse plus approfondie. Mélangez les produits PCR avec un colorant d’acide nucléique et analysez-les par électrophorèse sur un gel d’agarose à 1% dans un tampon TAE 1X.
Utilisez 10 microlitres d’un marqueur ADN comme référence. Observez le gel avec un transilluminateur UV et recherchez le fragment cible autour de 1 500 paires de bases. Bien qu’aucune colonie bactérienne n’ait été observée dans aucun groupe exempt de germes, elles ont été observées dans tous les groupes élevés de manière conventionnelle, ce qui indique que les larves d’œufs stérilisés nourris avec des feuilles de peuplier cultivées en tissu ne contenaient aucune bactérie.
Les bandes PCR de 1 500 paires de bases sont apparues dans tous les groupes élevés de manière conventionnelle. En revanche, aucune bande n’a été observée dans les groupes exempts de germes ou le contrôle négatif, ce qui implique qu’aucune bactérie intestinale n’existait chez les larves d’axenique. Pour les espèces d’insectes avec de minuscules œufs, les types de désinfectants et la durée de stérilisation devaient être optimisés.
En outre, les endophytes dans les plantes cultivées en tissu devraient être notables. Ce protocole fournit une nouvelle méthode pour maintenir les insectes exempts de germes, qui est un outil pratique pour faciliter les études d’interaction insecte-bactéries intestinales, en particulier pour les insectes non modèles sans régime artificiel bien développé.
