Bu çalışma NIH hibe CA141009 ve GM39067 tarafından desteklenmiştir. Biz yazılı kısmı yapılan yorumlar için E. Parnell ve R. Yarrington teşekkür ederim.

1. Fare Splenik Naïve CD4 İzolasyonu Hücreleri T <ol><li> Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (IACUC) protokolleri ile tutarlı insani bir bir şekilde fareyi Kurban. Dalak parçalara ayır ve 10% FBS ile DMEM 10 ml içeren Petri kabındaki yerleştirin. </li><li> Splenositlerin serbest bırakmak için iki cam slaytlar buzlu uçları kullanarak dalak Crush. , Bir 15 ml konik tüp otelinin hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> 4 az 5 dakika Ülke: boyunca 200 xg&#39;de (, bir tipik bir rotor çapına sahip, bir klinik santrifüj cihazında için ~ 1.200 rpm ile) okuyun santrifüj edenler tarafından hücreleri toplayın ° ° C. </li><li> 2 mi ACK tamponu otelinin Pastör pipetiyle hücrelerin kırmızı kan hücreleri, oda sıcaklığında (RT) deki akışkanın 1 dakika Ülke: lyse bulundunuz. FBS ile DMEM bölgesinin 8 ml eklenerek edenler tarafından reaksiyon, durdurun. </li><li> 4 az 5 dakika Ülke: boyunca 200 x g&#39;de okuyun santrifüj edenler tarafından hücreleri toplayın ° ° C. </li><li> DMEM içeren FBS 5 ml içinde hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin ve bir 70 mikron gözenekli filtre (BD Falcon, Cat # 352.350) geçmesine. Hücreleri sayın ve devam edinnaif CD4 bölgesinin izolasyonu bulundunuz kayıtlı üreticiler ait Kullanıcı yönergeleri kullanarak,, bir CD4 izolasyon kiti (Miltenyi, Kedi # 130-095-248) kullanılarak hücreler, T. 4 az 5 dakika Ülke: boyunca 200 x g&#39;de okuyun santrifüj edenler tarafından naif bir CD4-T-hücrelerinde toplayın ° ° C. FBS ile DMEM bölgesinin 10 ml &#39;otelinin hücrelerin yeniden süspanse edin. </li></ol> 2. Kromatin bölgesinin Preparasyon <ol><li> DMEM içinde hücre süspansiyonu, ile 1 ve% bölgesinin bir nihai konsantrasyonda bulundunuz% 37 formaldehit ekleyin ve hafifçe bulundunuz çapraz-linki DNA&#39;nın 15 dakika Ülke: için oda sıcaklığında (ör:, bir Nutator kullanarak) okuyun kaya: Protein kompleksleri üzerinde bulunurlar. </li><li> 125 mM bölgesinin, bir nihai konsantrasyon ile 1 ve M glisin ekleyerek edenler tarafından çapraz bağlama durdurun. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca kaya için devam edin. </li><li> 4 az 5 dakika Ülke: boyunca 200 x g&#39;de okuyun santrifüj edenler tarafından hücreleri toplayın ° ° C. </li><li> Buz-gibi soğuk PBS ihtiva eden proteaz inhibitörlerinin, 5 ml si içinde yeniden asılı edenler tarafından hücreleri yıkayın. 3 kez, toplam buz-gibi soğuk PBS ihtiva eden proteaz inhibitörlerini otelinin yıkayın ve 4 ° de santrifüjleme edenler tarafından hücreleri toplamak ° ° C. </li><li> , 1 ml otelinin hücrelerin yeniden süspanse edinproteaz inhibitörleri ile içeren buz gibi-soğuk bir hücre lizis tamponu. 15 dakika Ülke: boyunca buz ilgili sayısız inkübe edin. Hücre parçalama bölgesinin verimliliği,% 0.4 &#39;ü tripan mavi bir çözelti otelinin hücrelerin bölgesinin, küçük bir alikotu yeniden süspansiyon haline getirilmesini (Sigma, Kedi # T8154) ve bir mikroskop ile birlikte gözlemleyerek edenler tarafından tespit edilebilir. </li><li> 4 az 5 dakika Ülke: boyunca 200 xg&#39;de (tipik olarak ~ 1.200 rpm ile) okuyun santrifüj edenler tarafından çekirdeklerin toplayın ° ° C. Dikkatlice supernatant atın. </li><li> Proteaz inhibitörleri ile ihtiva eden, nükleer lizis tamponu ile bölgesinin 500 ul otelinin çekirdekleri yeniden süspanse edin. 15 dakika Ülke: boyunca buz ilgili sayısız inkübe edin. </li><li> Çıkış seviyesi 4, 15 sn patlama, buz üzerinde 4 kez: bir Misonix sonikatör 3.000, prob boyutu 1.6 mm kullanarak hücrelerin sonikasyon. Her bir numune, numuneler bölgesinin aşırı ısınmasını önlemek için tekrar bunu sonicating başlamadan önce 1-2 dakika Ülke: boyunca buz ilgili sayısız soğutuldu, olması gerekir. Aşırı ısınma çapraz bağlantıların ters neden olabilir. </li><li> 4 az 5 dakika Ülke: için 16.000 x g&#39;de (bir mikrosantrifüj içinde ~ 13,200 Devri) okuyun sonike edilmiş kromatin santrifüjleyin ° C Her </li><li> Net bir supern bir 20 ul alikotu alınatant, DNA yükleme boya ekleyebilir ve bir 2% agaroz jel (çoğu uygulama için sonike DNA ideal boyuttadır 200-500 bp) yoluyla elektroforezi ile sonike DNA kontrol edin. </li><li> Bir UV spektrofotometre kullanılarak DNA konsantrasyonu belirleyin. Makaslanmış kromatin kromatin immunoprecipitation reaksiyon kurmak için derhal kullanılabilir veya -80 saklanabilir ° C Genelde biz fare başına düşen 2-3 X-10 6 arıtılmış, CD4-T-hücrelerinde 7,5-10 mg DNA edinin. </li></ol> 3. Kromatin Immunoprecipitation (Tüm Adımlar 0-4 de Yaptırmış Olduğu olmalı ° C) <ol><li> Protease inhibitörleri ile ChIP seyreltme tamponu otelinin ug / ml &#39;5-10 bölgesinin bir DNA, konsantrasyonu (İndir Toplam hacim = 1 mi) çözündürüldü için sonicated kromatin sulandırınız. </li><li> Girdi olarak 100 ul (10%) kaydedin. Buz üzerinde saklayın. </li><li> Kısım 450 ul izotip kontrol (fare veya tavşan IgG) ve faiz antikor olarak etiketli iki 1.7 ml mikrofuge&#39;de tüpler içine her biri. , Aynı izotip bölgesinin birden çok antikorları ikinci el vardır ise, bir kez izotip Control Bu analiz gerçekleştirmek için yeterli olacaktır. Bir farklı bir hayvan kaynağı ya da izotip bir antikorlar kullanılması durumunda Sen birden fazla izotip kontrolleri gerekir. </li><li> 2-5 ikinci el, antikorun seçiciliği ya da özgüllüğü ilgili sayısız bağlı olarak belirli bir antikor bölgesinin ug,,, veya ilgili elektrik tüpleri bulundunuz izotip denetimi ekleyin. </li><li> ° C kromatin-antikor komplekslerinin bölgesinin oluşumuna izin vermek için 4 okuyun bir gecede bir Nutator kullanarak tüpleri rock. </li><li> , Yukarıda bulunan karışım, bulundunuz, protein G manyetik boncuk (askıya alındı ​​boncuk bölgesinin 01:01 harç madde) bölgesinin 25 ul ekleyin ve 4 okuyun en az 2 saat boyunca rock müzikle sarsılmaya her izin ° C Ise bizim satıcı adlı işletmeye Boncuklar direkt olarak ikinci el edilebilir. </li><li> , Bir manyetik bir stand ile ilgili en mikrofüj tüpleri yerleştirin ve taneler; daha manyetize edilmiş tarafında ilgili sayısız toplamak için izin verir. </li><li> Dikkatli bir şekilde boncuklar bozmadan Aspirasyon ile çözüm kaldırmak. </li><li> , Düşük tuz yıkama çözeltisi bölgesinin 1 ml ekleyin ve hafifçe bir Nutator ilgili sayısız 5 dakika Ülke: için kaya gibi için izin verir. Bir manyetik standı kullanarak boncuk toplayın ve yıkama çözeltisi tortularını çıkarmak. Bir kez tekrarlayın.</li><li> , Yüksek tuz yıkama çözeltisi bölgesinin 1 ml ekleyin ve, bir Nutator ilgili sayısız 5 dakika Ülke: için kaya gibi için izin verir. Manyetik standı kullanarak boncuk toplayın ve yıkama çözeltisi tortularını çıkarmak. Bir kez tekrarlayın. </li><li> Lityum klorür yıkama çözeltisi bölgesinin 1 ml ekleyin ve, bir Nutator ilgili sayısız 5 dakika Ülke: için kaya gibi için izin verir. Manyetik standı kullanarak boncuk toplayın ve yıkama çözeltisi tortularını çıkarmak. Bir kez tekrarlayın. LiCl çözeltileri hazırlanarak bölgesinin kullanımı, boncuklar ile non-spesifik kromatin etkileşimleri bölgesinin etkin bir şekilde çıkarımını artıran. </li><li> TE solüsyonu bölgesinin 1 ml ekleyin ve, bir Nutator ilgili sayısız 5 dakika Ülke: için kaya gibi için izin verir. Manyetik standı kullanarak boncuk toplayın ve yıkama çözeltisi tortularını çıkarmak. </li><li> Elüsyon tampon bölgesinin 250 ul ekleyerek edenler tarafından boncuk adlı işletmeye DNA biçimde, ayrıştırmak. , Oda sıcaklığında az 15 dakika Ülke: için kaya gibi. Eluat kapalı Pipet ve bir yeni bir 1,7 ml mikrofuge&#39;de tüp içinde bu malzeme kaydedin. Bir kez daha tekrarlayın ve elutions hem de birleştirmek. Boncuk atın. </li><li> Çapraz-bağlantıları nihai bir 0.3 M konsantrasyonu ve RNaz A 1 ul (20 m için 5 M NaCl eklemek tersine çevirmek için<html> Yıkanarak ayrılan DNA ilk bulundunuz gr / ml) eklenmiştir. Hacmi 500 ul yapmak için adım 3.2, en son kaydedilen girişlere elüsyon tampon 400 ul ekleyin. Girişler etmek için 0.3 M olan,, RNaz A, 0,5 M EDTA, ardından 1 M Tris-HCl pH: 6.5 &#39;bölgesinin 20 ul ve proteinaz K (20 mg / ml) bölgesinin 1 ul bölgesinin 10 ul bölgesinin 1 ul&#39; lik NaCl ekleyin. </li><li> , Bir kuru bir ısıtma bloğu otelinin 65 &#39;de bir gece elektrik tüpleri ° C inkübe edin. Örnekleri, mühür buharlaşma önlemek ya da açılış onları tutmak için tüpler üzerinde bir ağırlık yerleştirmek için. , Bir hibridizasyon fırın, aynı zamanda ikinci el edilebilir. </li><li> , Oda sıcaklığına kadar serin bir elektrik tüpleri izin ver. 1 ml 100% etanol ekleyin ve -80 2 hr-gece inkübe edin ° C çökelti DNA için. </li><li> Pelet için 15 dakika DNA için 16.000 xg&#39;de tüpler santrifüjleyin. 70% etanol ve hava-kuru pelet ile bir kez DNA pelet yıkayın. Otoklavlanmış distile su 100 ul en DNA pelet tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Elüsyon tampon bölgesinin to 50 ul bölgesinin toplam hacmi otelinin QIAquick spin sütunları ve elüsyona uğrayarak, kullanılarak analizi, DNA Purify. Bu, DNA PCR çalışılmış; kullanıma hazır ve hazır hale gelir. </li></ol>PCR Reaksiyon (Tüm Adımlar on Ice Yaptırmış Olduğu olmalı) of &quot;&gt; 4. Hazırlık <ol><li> ChIP ve karşılık gelen giriş örneklerinden tüm DNA örnekleri toplayın. Şunlara da, PCR reaktifler ve hedeflenen bir bölgedir için, primerler olarak sıra,, bir kontrol bölgesi toplamak tüm-. , Bir &quot;HotStart&quot; Taq DNA polimeraz kullanın. Biz bu yordamda DNA amplifikasyon ölçmek için bir SYBR Green-bazlı analiz kullanacaktır, ancak qPCR master kitleri gerekirse kullanılabilir. </li><li> QPCR analizinde otelinin, bir standart bir eğri oluşturmak için giriş DNA bölgesinin, bir seri bir şekilde seyreltilmesinden Yap Örneğin,: 10,% 1,,% 0.1,% ve elüsyon için, tampon otelinin işlemi Toplam 0.01% (adım 3.18 &#39;de edilen QIAquick spin sütunları adlı işletmeye) Şunun için. Bu standart eğriden şablon resim grubu bölgesinin konsantrasyonu, sınıfı için ve artım ChIP zenginleşme kuralları bulunmadığında öne beklenen düzeyde ilgili sayısız göre farklılık gösterir yapabilirsiniz,, vb (Genemate, kedi # uzayı T &#39;-3.182-1, bir 96-iyi plaka bölgesinin, ilgili deliklerdeki otelinin giriş DNA örnekleri, bölgesinin 10 ul dağıtın ), yinelenen yılında. </li><li> Ilgili yılında 10 ml ChIP izotip kumandadan gelen DNA yanı sıra spesifik antikor dağıtmakkuyu, üç kopya halinde. </li><li> Hedef astarlar veya kontrol astarlar (her astar 0.1 mcM son konsantrasyon) ya içeren bir &quot;ana karışımı&quot; olun ve ilgili kuyu içine 10 ul dağıtmak. Örneğin, aşağıdaki şablonda mix-içeren kuyu içine hedeflenen primerleri yeşil işaretlenmiş yüksek lisans dağıtmak ve kırmızı işaretlenmiş kuyu içine kontrolü primerleri ile ana karışımı dağıtmak. </li><li> Kuyunun dibinde her şeyi toplamak için oda sıcaklığında 1 dakika için bir klinik santrifüj (~ 1.200 rpm) içinde 500 xg&#39;de optik plastik sızdırmazlık film ve santrifüj ile PCR plaka satın al için Kapak. </li><li> PCR reaksiyon başlatın. Biz bu örnekte qPCR çalıştırmak için LightCycler 480 II (Roche) işletim LightCycler 480SW 1.5 yazılımı kullanın olacaktır. </li></ol> Ön kuluçka: 1 döngüsü: 95 ° C / 5 dk. Amplifikasyon: 40-45 devir: 94 ° C / 5 saniye, 60 ° C / 5 saniye, 72 ° C/10 sn (sıcaklık erime sıcaklık daha az 2-3 ° C olmalıdır tavlamaprimerler e). Erime eğrisi: 1 döngü. Soğutma: 1 çevrim. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> Bir </td><td> 10% Giriş </td><td> 10% Giriş </td><td> Izotipi </td><td> Belirli </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> B </td><td> 1% Giriş </td><td> 1% Giriş </td><td> Izotipi </td><td> Belirli </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> C </td><td> 0.1% Giriş </td><td> 0.1% Giriş </td><td> Izotipi </td><td> Belirli </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> D </td><td> 0.01% Giriş </td><td> 0.01% Giriş </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E </td><td> 10% Giriş </td><td> 10% Giriş </td><td> Izotipi </td><td> Belirli </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> F </td><td> 1% Giriş </td><td> 1% Giriş </td><td> Izotipi </td><td> Belirli </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> G </td><td> 0.1% Giriş </td><td> 0.1% Giriş </td><td> Izotipi </td><td> Belirli </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> H </td><td> 0.01% Giriş </td><td> 0.01% Giriş </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Yeşil: hedeflenen bölge astarlar kullanın. Kırmızı: kontrol bölgesi astarlar kullanın. 5. Analiz <ol><li> DNA mutlak miktarı ölçümü için Programı qPCR yazılımı. Önemli olarak, tanınmıyor belirli bir ve izotipine örneklerinde otelinin enterpolasyonu yapmak DNA&#39;nın tutarlar bulundunuz, bir standart bir eğri &#39;kavramının kullanılması, değerlendirilmesi ve tüm astar bölgesinin kalite ve verimliliğini bölgesinin eşleşen örneklerinde otelinin bulunan konsantrasyonları ile ilgili sınıfı için den fazla ayarlar fiyatları karşılaştırın. Ayrıca, aynı zamanda, bir mor sağlarE usingΔΔCq ve ilgili yöntemlere göre son göreli kat zenginleştirme sonuçlarına Cq (C t veya C p) değerleri dönüştürmek için güvenilir bir yöntemdir. </li><li> Örnek editörü sayfasına git ve bunların standart bir eğri değerleri, ile birlikte, çeşitli seyreltileri bölgesinin girişi örnekleri (10,% 1,,% 0.1,% ve% 0.01) ayrı ayrı içeren kuyu işaretleyin. Ayrıca PCR plate dışarı yatırılır tam olarak, bilinmeyen ChIP örnekleri ile kuyu etiket. Diğer qPCR makinelerinde kullanılan eşdeğer yazılımında, her bir primer çifti, standart eğri değeri ve buna göre deneysel ve izotip kontrol örneği için reaksiyonları karşılık gelen alt kümeleri tayin. </li><li> LightCycler yazılımında, alt kümesi editörü gidin ve giriş örnekleri ile kuyu yanı sıra bilinmeyen ChIP örnekleri de dahil olmak üzere alt kümeleri işaretleyin. Tanınmıyor numuneleri analize için girdi örneklerin bölgesinin, konsantrasyonu bilinen serum adlı işletmeye oluşturulan, standart eğri kullanarak sayısallaştırılabilmektedir edilecek doyurmaya. Diğer qPCR makinelerinde kullanılan eşdeğer yazılım, adayı alt corresp olarakHer bir primer çiftleri için tüm reaksiyonlar onding. </li><li> PCR amplifikasyon tamamlandıktan sonra, &quot;Abs Quant/2nd Türev Max&quot; ile analizi gerçekleştirmek ve analiz ve Tamam tuşuna basın için alt kümesini seçin. Diğer qPCR makinelerinde kullanılan eşdeğer yazılımında, her alt kümedeki DNA miktarına Cq değeri dönüştürmek. </li><li> Giriş numunelerin bilinen konsantrasyonları kullanarak standart eğri üretecektir ve bilinmeyen örneklerinde DNA mevcut mutlak miktarını görüntülemek hangi &quot;hesaplayın&quot; tuşuna basın. </li><li> Makaslanmış DNA kalitesi iyi ise primerler hedeflenen bölgeye özel olarak bağlamak eğer, ve, PCR verimlilik yakın 2 için olmalıdır. </li><li> Varsa, aynı alt kümesi için &quot;Tm arama&quot; ile bir erime eğrisi analizi gerçekleştirin. Bir tek tepe noktasının, sadece bir tanesidir belirli bir ürün amplifiye edildi olduğunu gösterir. Spesifik DNA bölgesinin Amplifikasyon, aynı zamanda bir agaroz jeli içinden DNA ladder &#39;le ile birlikte, PCR ürünü electrophoresing edenler tarafından olarak test edilebilir. </li><li> Bir olarak veri ihracat sekmedaha fazla analiz için Microsoft Excel&#39;de açılabilir ayrılmış metin dosyası,. </li><li> Microsoft, Excel programını kullanarak, hedefli bir astar boyalar için izotip kontrol ile ilgili belirli kullanıma uyarlanmış antikor için DNA miktarı bölün. Kontrol bölgesi primerleri için bu adımı yineleyin. , Aynı izotip bölgesinin birden çok antikorlarının farklı asyonlar için ikinci el yapıyorsanız,, aynı izotip kontrol adlı işletmeye bulunan değerlerle, bu bölgesinin her biri normalleştirmek. Birden çok hedefli primer çiftleri, ikinci el arıyorsunuz Ayrıca, eğer, bir tek bir kontrol bir primer çifti resim grubu adlı işletmeye, DNA miktarlar, her hedef için (Şekiller 1 ve 2) bölgesinin normale dönmesi için ikinci el edilmelidir. Çıkış değerleri, non-spesifik bir antikor arka plan immüno-çökeltme bulundunuz göreli her bir Yer okuyun spesifik bir antikor immüno-çökeltme kat zenginleştirme temsil eder. </li><li> Bir göre zenginleştirme elde etmek için kontrol bölgesi astar için kat zenginleştirme (kontrol izotipe) ile hedeflenen astar için kat zenginleştirme (kontrol izotipe) bölünİlişkisiz kontrol bölgesi (Şekil 1). Önemli olarak,, çünkü her bir örnek için İndir Toplam giriş DNA, ile birlikte standart eğrileri bölgesinin nesil bölgesinin, yukarıda bulunan immüno-çökeltme değerleri, bölgesinin her bir, standart eğrileri adlı işletmeye zaten bulundunuz normalize edilir enterpolasyonlu bir, ve benzeri gibi ifade edilen olduğunu lütfen unutmayın, makine yazılımı, edenler tarafından İndir Toplam giriş bölgesinin fraksiyonu ölçülür. </li><li> Immüno-çökeltme ya da yıkama için ikinci el arabellekleri bölgesinin sıkılığının ayarlanması çok yüksek olduğunu ise, bu izotip kontrol adlı işletmeye amplifikasyon numuneleri gözlenen uygulanmaz değil, doyurmaya immünopresipitasyon işleminden, sağlarken özel antikorlar, ile immünopresipitasyon işleminden örnekleri adlı işletmeye sağlam bir amplifikasyon, dikkat edilmesi doyurmaya ki mümkündür olduğunu. Böyle bir senaryoda yılında, bu, hedeflenen bölge ve ilişkisiz bir bölgeye her ikisi için de spesifik bir antikor ChIP adlı işletmeye İzotip; Eş tip kontrol çipi bölgesinin miktar n artt rp bulundunuz daha da güzelleşir olduğunu. Bağıl zenginleştirme ilişkisiz bölgesi (Şekil 3) için fark tarafından hedeflenen bölge için fark bölünmesi ile hesaplanabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chromatin+immunoprecipitation+to+clone+novel+E2F+target+promoters.">Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters.</a> Molecular and Cellular Biology. 21, 6820-6832 (2001).</li><li>Weinmann, A. S., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unknown+target+genes+of+human+transcription+factors+using+chromatin+immunoprecipitation.">Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation.</a> Methods. 26, 37-47 (2002).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+nuclear+localization+of+NFAT+in+Foxp3++regulatory+T+cells+independent+of+calcineurin+activity.">Constitutive nuclear localization of NFAT in Foxp3+ regulatory T cells independent of calcineurin activity.</a> J. Immunol. 188, 4268-4277 (2012).</li><li>Shakya, A., Kang, J., Chumley, J., Williams, M. A., Tantin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oct1+is+a+switchable,+bipotential+stabilizer+of+repressed+and+inducible+transcriptional+states.">Oct1 is a switchable, bipotential stabilizer of repressed and inducible transcriptional states.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 450-459 (2011).</li><li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(microChIP).">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).</li><li>Lubelsky, Y., Macalpine, H. K., Macalpine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+localization+of+replication+factors.">Genome-wide localization of replication factors.</a> Methods. 57, 187-195 (2012).</li><li>O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+characterization+of+the+early+embryo+with+a+chromatin+immunoprecipitation+protocol+applicable+to+small+cell+populations.">Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations.</a> Nature Genetics. 38, 835-841 (2006).</li><li>Sikes, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+method+for+rapid+and+sensitive+chromatin+immunoprecipitation.">A streamlined method for rapid and sensitive chromatin immunoprecipitation.</a> Journal of Immunological Methods. 344, 58-63 (2009).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution.">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147, 1408-1419 (2011).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes.">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483, 295-301 (2012).</li><li>Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+ChIP-seq+experiments+for+DNA-binding+proteins.">Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins.</a> Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li></ol>

Herhangi bir çıkar çatışması ilan etti.

Protokol Yukarıdaki doğru bir şekilde ChIP kullanarak birincil Lenfositlerden elde DNA zenginleştirme miktarının bir sağlam bir yöntem sağlar. Bu protokolde sağlamlık için bir önemli nedeni biyolojik çoğaltır dahil edilmesi. , Yukarıda bulunan iletişim kuralı üç, bağımsız bir şekilde hesaplanır, hangi için en zenginleştirme çoğaltır kullanır. Çıkışlar daha sonra zenginleşme, ve değişkenliği bölgesinin sağlamak için bir önlem hesaplanan standart sapma daha bölgesinin bir ölç...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formaldehyde</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F-8775</td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline</td>
 <td>Hyclone</td>
 <td>SH30256.01</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease Inhibitor tablets</td>
 <td>Roche</td>
 <td>04693116001</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein G magnetic beads</td>
 <td>Active Motif</td>
 <td>101945</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase A (20 mg/ml)</td>
 <td>EMD Millipore</td>
 <td>556746</td>
 <td>Store at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Proteinase K (20 mg/ml)</td>
 <td>Roche</td>
 <td>03115879001</td>
 <td>Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Platinum Taq DNA Polymerase</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>10966-034</td>
 <td>Store at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SYBR Green I</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>S7567</td>
 <td>Store at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Glycine</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Prepare fresh</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.5 M EDTA</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris-HCl, pH 6.5</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table of Specific Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clay Adams Brand Nutator</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>Model: 421105</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnetic Stand</td>
 <td>Promega</td>
 <td>Z5342</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qiaquick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Masonix Sonicator 3000</td>
 <td>QSonica</td>
 <td>Model: S3000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UV Spectrophotometer</td>
 <td>NanoDrop Technologies</td>
 <td>ND-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heating Block</td>
 <td>VWR</td>
 <td>13259-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotator</td>
 <td>VWR</td>
 <td>80085-692 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Refrigerated bench top centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Model: Allegra X-12R</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcentrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5415 D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table of Equipment </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

efficient chromatin immunoprecipitation using limiting amounts of biomass

Kromatin immunoprecipitation (ChIP) canlı hücrelerinin kromatin DNA ile farklı proteinlerin etkileşimleri belirlemek için bir yaygın olarak-kullanılan bir yöntemdir. Örnekleri arasında belli bir sekansa özel DNA bağlanma transkripsiyon faktörleri, histon ve onların farklı bir değişiklik Birleşik Devletleri, bu tür, RNA polimeraz ve ancillary faktörler olarak enzimler, ve DNA onarım bileşenleri yer alıyor. Onun aynı anda her yerde rağmen, malzeme her iki tezgah hazırlanması için ve etkileşim kantitatif ölçümlerini izin veren doğru analiz için kadar-to-date, ayrıntılı metodolojileri bir eksikliği vardır. Bu bilgi eksikliği nedeniyle, ve aynı zamanda herhangi bir immünopresipitasyon gibi, koşullar deneysel koşullar yeni setleri için yeniden-optimize edilmiş olmalıdır, çünkü, ChIP tahlil yanlış veya kötü kantitatif sonuçlar karşı hassastır. Bizim protokolü sonuçta transkripsiyon faktörü üzerinde ufuklar açan işten türetilmiştir: DNA etkileşimleri 1,2, ama sensitizasyon için bir dizi iyileştirme içerirzor-to-elde hücre tipleri için vite ve tekrarlanabilirlik. Protokol başarılı bir şekilde kullanılır olmuştur 3,4, DNA zenginleştirme ölçmek için qPCR kullanarak, ya da altında protokolün bir yarı-nicel varyant kullanarak her iki. PCR-amplifiye malzeme bölgesinin Bu, kantitatif analiz hesaplama açısından ısırttı, ve tahlil otelinin, bir kısıtlayıcı bir faktör temsil eder edilir. Önemli kontroller ve diğer hususlar uygulaması sonucunda oluşan değişiklikleri göster: Aile bulundunuz değil, böyle bir çalışmada altındaki bir protein (ya da beklenen edenler tarafından bağlı olmayı bulundunuz olmayacağı tahmininde bulundu, bir intergenik bir bölge olarak bir izotip-eşlemeli antikor bölgesinin kullanımı, hem de olarak kullanmak genomik DNA&#39;nın bölgesinin, bir kontrol bölgesi bölgesinin değerlendirmesi, tüm , deneysel şartları yaratarak). Buna ek olarak, her bir ChIP örnek için giriş malzeme bölgesinin, bir standart bir eğri deneme girdileri ve materyaldeki açısından önemli ölçüde zenginleşme bölgesinin mutlak düzeyleri aç türetmek için kullanılır edilir. Standart eğrileri kullanımı ne olursa olsun onlar tasarlanmış nasıl dikkatli bir şekilde ki, primer setleri arasındaki hesabınıza farklılıkları içine almak, ve aynı zamanda verimlilik farklılık için yardımcı olurbir tek bir astar kümesi için şablon konsantrasyonlarının aralığı boyunca referanslarınıza. Bizim protokolü biz yoğun bir şekilde daha sonra, analiz aşamasında kapsayacak bu içinde 5-8 mevcuttur diğerlerinden farklıdır.

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü böylece bir &quot;yükleme kontrol&quot; olarak hizmet veren, genomun bir ilişkisiz bölge güçlendirir bir primer çifti kullanımı yoluyla PCR içinde kullanılan DNA miktarında, herhangi bir eğer, farklar için burada kontrolleri sundu. Şekil 3, otelinin ve gösterilen örnekte de, biz hedef bölge olarak seçilmesi fare il2 promoteri ilgili sayısız Faiz ve olan transkripsiyon faktör olan NFAT bağlayıcı bir Alanı bölgesinin Bizim ...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass at JoVE.com

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Biz primer T hücreleri kullanarak kromatin immunoprecipitation için bir sağlam bir yöntem tarif. Metodu standart yaklaşımlar üzerine kurulmuştur, ama hücrelerin sınırlı bir miktarda için verimliliği artırmak koşulları ve reaktifler belirli bir kümesi kullanır edilir. Önemli olarak, veriler analiz aşaması bölgesinin, bir ayrıntılı bir açıklama sunulmaktadır edilir.

Biyokütle Limit Tutarlar kullanarak Verimli Kromatin Immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

efficient-chromatin-immunoprecipitation-using-limiting-amounts

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K Görüntüleme.  University of Utah School of Medicine. Biz primer T hücreleri kullanarak kromatin immunoprecipitation için bir sağlam bir yöntem tarif. Metodu standart yaklaşımlar üzerine kurulmuştur, ama hücrelerin sınırlı bir miktarda için verimliliği artırmak koşulları ve reaktifler belirli bir kümesi kullanır edilir. Önemli olarak, veriler analiz aşaması bölgesinin, bir ayrıntılı bir açıklama sunulmaktadır edilir.

Video: Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Biyoloji

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

Metillenmiş DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Kromatin Immunoprecipitation İnsan Hücrelerinde Aktif Gen İfadesi Testi Dinamik Histon Modifikasyon (ChIP)

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

Singenik Zebra balığı Tümör propaganda Hücreler Frekans miktarının sınırlandırılması Seyreltme Hücre Transplantasyonu

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

Kullanarak Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) Drosophila Doku

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Yüksek verim Sıralama için Yüksek Kalite Kromatin Immunoprecipitation DNA Şablon üretimi (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants. Low affinity interactions can be preserved through the use of less-stringent buffer conditions and remain readily identifiable. This protocol discusses the labeling of tissue culture cells with stable isotope labeled amino acids, transfection and immunoprecipitation of an affinity tagged protein of interest, followed by the preparation for submission to a mass spectrometry facility. This protocol then discusses how to analyze and interpret the data returned from the mass spectrometer in order to identify cellular partners interacting with a protein of interest. As an example this technique is applied to identify proteins binding to the eukaryotic translation initiation factors: eIF4AI and eIF4AII.

SILAC immunoprecipitation experiments represent a powerful means for discovering novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants, and low affinity interactions preserved through use of less-stringent buffer conditions.

SILAC-immunoprecipitation Kantitatif PROTEOMİK kullanma Memeli Hücrelerde Protein Etkileşim Ortakların Kimlik

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...