Ce protocole permet une extraction reproductible et fiable de la chromatine à partir d’échantillons de foie congelés pour des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine. Pour commencer, placez le tube contenant le tissu congelé dans le mortier et laissez-le reposer là pendant cinq minutes. Appliquez ensuite une pression sur l’échantillon à l’aide d’un pilon pré-refroidi jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de crumbles solides.
Retirer le tube contenant l’échantillon du mortier. Ajouter 950 microlitres de PBS glacé avec les inhibiteurs requis, et pipeter doucement de haut en bas jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement remis en suspension. Transférer immédiatement la suspension tissulaire dans l’homogénéisateur et appliquer 20 à 30 coups avec le pilon A pour obtenir une suspension plus fine.
Évitez de déplacer le pilon à l’extérieur de la phase liquide pour éviter la formation de mousse. Transférer l’homogénat dans un nouveau tube de 1,5 millilitre préalablement refroidi sur de la glace. Ensuite, centrifugez le tube pendant cinq minutes à 1 300 G et quatre degrés Celsius.
Retirez délicatement le surnageant et remettez complètement en suspension la pastille dans 950 microlitres de PBS à température ambiante par pipetage doux. Ajoutez ensuite 63,6 microlitres de formaldéhyde 16% sans méthanol pour obtenir une concentration finale de 1%Faites tourner immédiatement le tube pendant 10 minutes à température ambiante. Après rotation, ajoutez 113 microlitres de glycine molaire 1,25 molaire à température ambiante pour obtenir une concentration finale de 125 millimolaires et faites tourner le tube pendant cinq minutes supplémentaires.
Ensuite, centrifuger l’échantillon à 1 300 G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille avec précaution en pipetant 950 microlitres de PBS glacé avec les inhibiteurs requis. Centrifuger à nouveau l’échantillon et remettre la pastille en suspension comme démontré précédemment.
Répétez l’étape de centrifugation une fois de plus et passez immédiatement à la procédure d’isolement de la chromatine. Ajouter 950 microlitres de tampon A avec les inhibiteurs requis à la pastille et mélanger doucement par pipetage jusqu’à ce que la pastille soit complètement remise en suspension. Ensuite, tournez le tube pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Après rotation, centrifuger l’échantillon à 2 000 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et retirer délicatement le surnageant. Ajouter 950 microlitres de tampon B avec les inhibiteurs requis à la pastille et mélanger doucement par pipetage jusqu’à ce que la pastille soit complètement remise en suspension. Ensuite, tournez le tube pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Après rotation, centrifuger à nouveau l’échantillon. Retirez le surnageant. Ajoutez ensuite 300 microlitres de tampon C à température ambiante avec les inhibiteurs requis à la pastille et à la pipette vigoureusement.
Vortex l’échantillon pendant 15 à 30 secondes. Ensuite, faites tourner brièvement le tube pour recueillir les gouttes sur le couvercle. Après avoir soniqué l’échantillon de chromatine, ajoutez 30 microlitres de solution de Triton X-100 à 10% et vortex pendant cinq à 10 secondes.
Centrifuger l’échantillon à 16 000 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Et transférer le surnageant dans un tube propre de 1,5 millilitre pré-refroidi sur de la glace. Transférer 10 à 25 microlitres de chromatine cisaillée dans un nouveau tube, et ajouter le tampon C pour atteindre un volume final de 200 microlitres.
Aliquote et choc congèlent le reste de la chromatine à moins 80 degrés Celsius jusqu’à nouvel usage. Ajouter huit microlitres de chlorure de sodium à cinq molaires et incuber pendant au moins six heures à 65 degrés Celsius dans le bloc chauffant tout en agitant à 1 000 tr / min. Prolongez l’incubation pendant la nuit si possible.
Après avoir laissé les échantillons refroidir à température ambiante pendant cinq minutes, ajouter deux microlitres de RNase A et incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius tout en agitant à 1 000 tr / min. Retirer les échantillons du bloc chauffant et ajouter sept microlitres de chlorure de calcium 300 millimolaires et deux microlitres de protéinase K.Incuber les échantillons dans le bloc chauffant à 56 degrés Celsius pendant 30 minutes tout en agitant à 1 000 tr / min. Pendant ce temps, préparez un tube de séparation de phase pour chaque échantillon en les centrifugeant jusqu’à 16 000 G pendant une minute à quatre degrés Celsius.
Après avoir retiré les tubes du bloc chauffant et les avoir laissés s’équilibrer à température ambiante pendant trois minutes, transférer 400 microlitres de l’échantillon dans le tube de séparation de phase préalablement centrifugé. Ensuite, ajoutez 400 microlitres de solution d’alcool isoamylique de chloroforme de phénol et vortex pendant cinq secondes. Centrifuger le tube à 16 000 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Ajoutez ensuite 400 microlitres de chloroforme et de vortex pendant cinq secondes. Centrifuger le tube pendant cinq minutes supplémentaires et transférer 400 microlitres de la phase supérieure dans un nouveau tube de 1,5 millilitre contenant 24 microlitres de chlorure de sodium molaire et 0,75 microlitre de glycogène. Puis brièvement vortex le tube.
Ajouter 1 055 microlitres d’éthanol à 100%. Ensuite, vortex à fond et incuber l’échantillon à moins 80 degrés Celsius pendant une heure ou à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Une fois l’incubation terminée, centrifuger l’échantillon à 16 000 g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius et retirer délicatement le surnageant sans disloquer la pastille.
Ajouter 500 microlitres d’éthanol froid à 70% et incliner doucement le tube pour s’assurer que la pastille est lavée. Centrifuger le tube à 16 000 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Retirez délicatement le surnageant entier et laissez sécher le granulé à température ambiante.
Alternativement, incuber le tube à 37 degrés Celsius pour un séchage plus rapide. Ajouter 50 microlitres de solution Tris-EDTA et placer le tube sur le bloc chauffant pendant cinq à 10 minutes sous agitation à 300 tr/min. Analysez ensuite l’ADN sur un gel d’agarose à 1%.
Après la réticulation de la chromatine et la visualisation de l’ADN sur gel d’agarose, un cisaillement réussi peut être reconnu par la présence de fragments dans la gamme de 100 à 300 paires de bases. La chromatine a été précipitée avec succès avec des anticorps de triméthylation H3K4, d’acétylation H3K27 et de triméthylation H3 K27 et analysée plus avant par qPCR. Le chromosome un cadre de lecture ouvert 43, la sous-unité bêta deux du protéasome 20S et les régions promotrices de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase qui sont activement transcrites dans le foie ont montré un enrichissement pour la triméthylation H3K4 et l’acétylation H3K27.
En comparaison, l’homéobox C13, l’homéoboîte C12 et les régions promotrices du facteur de transcription de la myéline de souris qui sont réduites au silence dans le foie n’ont pas été enrichies comme prévu. La triméthylation H3 K27 montre le comportement inverse, confirmant ainsi le succès de l’immunoprécipitation de la chromatine ou du test ChIP. La chromatine a été soumise avec succès à ChIP-Seq.
Après séquençage, les roseaux ont été alignés sur un indice préalablement préparé et séparés selon les espèces. La triméthylation H3K4 et le dépôt d’acétylation H3K27 aux sites de départ de la transcription génique se sont opposés au dépôt de triméthylation H3K27 comme prévu. L’amas Hox C est connu pour être inactif sur le plan transcriptionnel dans les foies de souris et d’humains.
Le profilage de la triméthylation H3K4 et de l’acétylation H3K27 montre des pics pour ces deux modifications post-traductionnelles à l’extérieur de l’amas, tandis que l’intensité du signal de la triméthylation H3K27 tend à augmenter dans le groupe de gènes. L’extraction de la chromatine à partir d’échantillons de tissus congelés présente une grande variabilité intrinsèque, qui dépend fortement de la finesse de la suspension cellulaire et de la température pendant la réticulation. Assurer des conditions de laboratoire fixes aide à maintenir la reproductibilité de la plage de taille des fragments.
