Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse CA141009 und GM39067 unterstützt. Wir danken E. Parnell und R. Yarrington für Kommentare zu den schriftlichen Teil.

1. Isolation von Maus Milz Naive CD4 T-Zellen <ol><li> Aufopferung der Maus auf humane Weise im Einklang mit Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) Protokolle. Präparieren Sie die Milz und legen Sie es in Petrischale mit 10 ml DMEM mit 10% FBS. </li><li> Crush die Milz mit mattierten Enden von zwei Glasplatten, die Splenozyten freizugeben. Übertragen Sie die Zellsuspension in einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Sammeln der Zellen durch Zentrifugation bei 200 xg (~ 1.200 UpM einer klinischen Zentrifuge mit einer typischen Rotordurchmesser) für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Die Zellen in 2 ml ACK-Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen, 1 min bei Raumtemperatur (RT). Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 8 ml DMEM mit FBS. </li><li> Sammeln der Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Die Zellen in 5 ml DMEM mit FBS und durch ein 70 um-Sieb (BD Falcon, Cat # 352350). Zählen Sie die Zellen und gehendie Isolation von naiven CD4-T-Zellen mit einem CD4 Isolation Kit (Miltenyi, Cat # 130-095-248) mit den Anweisungen des Herstellers. Sammeln naiven CD4 T-Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g für 5 min bei 4 ° C. Die Zellen in 10 ml DMEM mit FBS. </li></ol> 2. Herstellung von Chromatin <ol><li> In 37% Formaldehyd in einer Endkonzentration von 1% zu der Zellsuspension in DMEM und sanft bei Raumtemperatur (z. B. mit einem Nutator) schaukeln für 15 Minuten zu vernetzen DNA-Protein-Komplexe. </li><li> Stoppen Vernetzung durch Zugabe von 1 M Glycin bis zu einer Endkonzentration von 125 mM. Weiterhin für 5 min bei RT rocken. </li><li> Sammeln der Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Die Zellen werden durch Resuspendieren in 5 ml eiskaltem PBS enthaltend Proteaseinhibitoren. Waschen in eiskaltem PBS enthaltend Proteasehemmer 3 mal insgesamt und sammeln die Zellen durch Zentrifugation bei 4 ° C. </li><li> Die Zellen in 1 mleiskaltem Lyse-Puffer mit Protease-Inhibitoren. Inkubieren auf Eis für 15 min. Die Effizienz der Lyse kann durch Resuspendieren Ein kleines Aliquot von Zellen in 0,4% Trypan-Blau-Lösung (Sigma, Cat # T8154) und die Beobachtung mit einem Mikroskop bestimmt werden. </li><li> Sammeln der Kerne durch Zentrifugation bei 200 xg (typischerweise ~ 1.200 rpm) für 5 min bei 4 ° C. Vorsichtig den Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren die Kerne in 500 ul der nuklearen Lysepuffer Proteaseinhibitoren. Inkubieren auf Eis für 15 min. </li><li> Mit Ultraschall die Zellen unter Verwendung eines Misonix Sonicator 3.000, Sonde Größe 1,6 mm: Ausgangspegel 4, 15 sec Burst, 4 mal auf Eis. Jede Probe muss auf Eis für 1-2 min vor Beschallung es wieder eine Überhitzung zu vermeiden Proben gekühlt. Überhitzung kann bewirken, dass die Umkehrung der Querverweisen. </li><li> Zentrifuge die beschallte Chromatin bei 16.000 xg (13.200 rpm ~ in einer Mikrozentrifuge) für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Nehmen Sie einen 20 ul Aliquot klar Supernatant, fügen DNA Ladefarbstoff und überprüfen Sie die beschallte DNA durch Elektrophorese durch ein 2% Agarosegel (ideale Größe der beschallten DNA für die meisten Anwendungen ist 200-500 bp). </li><li> Bestimmen DNA-Konzentration mit einem UV-Spektralphotometer. Sheared Chromatin kann sofort verwendet werden, um die Einrichtung Chromatinimmunpräzipitation Reaktion oder bei -80 ° C. Typischerweise erhalten wir 7,5-10 ug DNA 2-3 X 10 6 gereinigten CD4 T-Zellen pro Maus. </li></ol> 3. Chromatin Immunopräzipitation (Alle Schritte müssen bei 0-4 ° C durchgeführt werden) <ol><li> Verdünnen Sie beschallten Chromatin zu einer DNA-Konzentration von 5-10 g / ml (Gesamtvolumen = 1 ml) in ChIP Verdünnungspuffers mit Protease-Inhibitoren. </li><li> Sparen Sie 100 ul (10%) als Eingabe. Lagern auf Eis. </li><li> Aliquot 450 ul jeweils in zwei 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen als Isotypenkontrolle (Maus oder Kaninchen-IgG) und Antikörper von Interesse bezeichnet. Wenn mehrere Antikörper des gleichen Isotyps verwendet werden, eine einzige Isotyp control ausreichen werden, um diese Analyse durchzuführen. Sie müssen mehrere Isotypkontrollen wenn Antikörper eines anderen tierischen Ursprungs oder Isotyp verwendet werden. </li><li> In 2-5 ug Antikörper, abhängig von der Spezifität der verwendeten Antikörper oder Isotyp-Kontrolle, um die jeweiligen Rohre. </li><li> Schaukeln Sie die Rohre mit einem Nutator Nacht bei 4 ° C, um die Bildung von Chromatin-Antikörper-Komplexe zu ermöglichen. </li><li> In 25 ul Protein G magnetischen Kügelchen (1:1 Slurry suspendiert Perlen) zu der obigen Mischung und lassen Sie sie für mindestens 2 Stunden bei 4 ° C rocken Perlen aus unserer Lieferanten können direkt verwendet werden. </li><li> Legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen auf einem magnetischen Standfuß und lassen die Perlen auf der magnetisierten Seite zu sammeln. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Lösung durch Aspiration, ohne die Perlen. </li><li> 1 ml salzarme Waschlösung und lassen Sie sanft für 5 min auf einem Nutator rocken. Sammeln Sie die Perlen mit einem Magnetfuß und entfernen Sie die Waschlösung. Wiederholen einmal.</li><li> 1 ml der hohen Salz-Waschlösung und lassen Sie sie für 5 min auf einem Nutator rocken. Sammeln Sie die Perlen mit den magnetischen Standfuß und entfernen Sie die Waschlösung. Wiederholen einmal. </li><li> 1 ml Lithiumchlorid Waschlösung und lassen Sie für 5 min auf einem Nutator rocken. Sammeln Sie die Perlen mit den magnetischen Standfuß und entfernen Sie die Waschlösung. Wiederholen einmal. Die Verwendung von LiCl verbessert die effektive Entfernung von unspezifisch Chromatin-Wechselwirkungen mit den Beads. </li><li> 1 ml TE-Lösung und lassen Sie für 5 min auf einem Nutator rocken. Sammeln Sie die Perlen mit den magnetischen Standfuß und entfernen Sie die Waschlösung. </li><li> Eluieren der DNA von den Beads durch Zugabe von 250 ul Elutionspuffer. Schaukeln für 15 min bei Raumtemperatur. Pipette aus dem Eluat und speichern dieses Material in einem neuen 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie noch einmal und kombinieren beide Elutionen. Entsorgen Sie die Perlen. </li><li> Zur Umkehr des Vernetzungen werden 5 M NaCl auf eine Endkonzentration von 0,3 M und 1 ul RNase A (20 m<html> g / ml) zu der eluierten DNA. In 400 ul Elutionspuffer zu den Eingängen in Schritt 3.2, gespeichert, um das Volumen 500 ul zu machen. Um die Eingänge hinzuzufügen NaCl bis 0,3 M, 1 ul RNase A, 10 ul 0,5 M EDTA, 20 ul 1 M Tris-HCl pH 6,5 und 1 ul Proteinase K (20 mg / ml). </li><li> Die Röhrchen über Nacht bei 65 ° C in einem trockenen Heizblock. Zum Verdampfen von Proben Dichtung zu vermeiden oder zu platzieren ein Gewicht auf den Rohren, um sie von Öffnung zu halten. Hybridisierungsofen können ebenfalls verwendet werden. </li><li> Lassen Sie die Rohre auf RT abkühlen. 1 ml 100% Ethanol und Inkubation 2 h-Nacht bei -80 ° C zur Ausfällung von DNA. </li><li> Zentrifugieren bei 16.000 g für 15 min zur Pelletierung der DNA. Waschen Sie das DNA-Pellet einmal mit 70% Ethanol und Luft trocknen des Pellets. Resuspendieren des DNA-Pellet in 100 ul autoklavierte destilliertem Wasser. </li><li> Entschlacken DNA mit dem QIAquick Spin Columns und eluieren in einem Gesamtvolumen von 50 ul Elutionspuffer. Diese DNA ist einsatzbereit für die PCR. </li></ol>&quot;&gt; 4. Vorbereitung der PCR-Reaktion (Alle Schritte müssen auf Eis durchgeführt werden) <ol><li> Sammeln Sie alle DNA-Proben von Chip und entsprechenden Eingang Proben. Außerdem sammeln Sie alle PCR-Reagenzien und Primer für die Zielregion sowie eine Kontrolle Region. Verwenden Sie einen &quot;Warmstart&quot; Taq DNA Polymerase. Wir werden eine SYBR Green-basierte Assays zur DNA-Amplifikation in diesem Verfahren zu quantifizieren, aber qPCR Mastermix Kits können verwendet werden, wenn es erforderlich ist. </li><li> Einen seriellen Verdünnung der eingesetzten DNA, um eine Standardkurve in der qPCR Analyse zu erzeugen: zum Beispiel 10%, 1%, 0,1% und 0,01% in Elutionspuffer (von QIAquick Spin-Säulen in Schritt 3.18). Der Konzentrationsbereich und Zuwachs dieser Standardkurve Template-Set auf den erwarteten Niveaus von ChIP Anreicherung kann variieren, Abgabemotor etc. 10 ul Eingang DNA-Proben in entsprechenden Vertiefungen einer 96-Well-Platte (Genemate, cat # T-3182-1 ), in zweifacher Ausfertigung. </li><li> Dosiernadel 10 ml ChIP DNA von Isotyp-Kontrolle sowie spezifische Antikörper in jeweiligeBrunnen, in dreifacher Ausfertigung. </li><li> Machen Sie eine &quot;Master-Mix&quot;, die entweder Ziel Primer oder Kontroll-Primer (0,1 pM Endkonzentration von jedem Primer) und verzichten 10 ul in entsprechende Vertiefungen. Zum Beispiel wird in der Vorlage unter verzichten Mastermix enthaltenden gerichtete Primer in Vertiefungen grün markiert verzichten Mastermix mit Kontroll-Primer in Vertiefungen rot markiert. </li><li> Decken Sie die PCR-Platte mit optischem Kunststoff Versiegelungsfilm und Zentrifuge bei 500 xg in einer klinischen Zentrifuge (~ 1.200 rpm) für 1 min bei RT, alles auf dem Boden des Bohrlochs zu sammeln. </li><li> Starten Sie die PCR-Reaktion. Wir verwenden die LightCycler 480 II (Roche) Betriebssystem LightCycler 480SW 1.5 Software, um die qPCR in diesem Beispiel auszuführen. </li></ol> Pre-Inkubation: 1 Zyklus: 95 ° C / 5 min. Amplifikation: 40-45 Zyklen: 94 ° C / 5 sec, 60 ° C / 5 sec, 72 ° C/10 sec (Annealing-Temperatur um 2-3 ° C geringer als der Schmelzpunkt temperature der Primer). Schmelzkurve: 1 Zyklus. Kühlung: 1 Zyklus. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> A </td><td> 10% Eingangs- </td><td> 10% Eingangs- </td><td> Isotyp </td><td> Spezifische </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> B </td><td> 1% Eingang </td><td> 1% Eingang </td><td> Isotyp </td><td> Spezifische </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> C </td><td> 0,1% Eingang </td><td> 0,1% Eingang </td><td> Isotyp </td><td> Spezifische </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> D </td><td> 0,01% Eingang </td><td> 0,01% Eingang </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E </td><td> 10% Eingangs- </td><td> 10% Eingangs- </td><td> Isotyp </td><td> Spezifische </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> F </td><td> 1% Eingang </td><td> 1% Eingang </td><td> Isotyp </td><td> Spezifische </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> G </td><td> 0,1% Eingang </td><td> 0,1% Eingang </td><td> Isotyp </td><td> Spezifische </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> H </td><td> 0,01% Eingang </td><td> 0,01% Eingang </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Grün: Verwenden Zielregion Primer. Rot: Verwenden Steuerbereich Primer. 5. Analyse <ol><li> Programm der qPCR-Software für die Quantifizierung der absolute DNA-Menge. Wichtig ist, ermöglicht die Verwendung einer Standardkurve interpoliert DNA Mengen in den unbekannten Proben bestimmten Isotyp und die Auswertung und Anpassung der Qualität und Effizienz aller Primer setzt über einen Bereich von Konzentrationen in den Proben gefunden. Darüber hinaus ist es auch ein more zuverlässige Methode, um die Cq (C t oder C p)-Werte bis zur endgültigen relativen fache Anreicherung Ergebnisse als usingΔΔCq und verwandten Methoden zu konvertieren. </li><li> Gehen Sie auf die Sample-Editor und markieren Sie die Vertiefungen mit Eingang Proben von verschiedenen Verdünnungen (10%, 1%, 0,1% und 0,01%) mit ihren Standardkurve Werte. Auch bezeichnen die Brunnen mit unbekannten Chip-Proben, genau so, wie die PCR-Platte gelegt wird. In gleicher Software auch in anderen qPCR Maschinen bezeichnen Teilmengen entsprechend Reaktionen für jedes Primerpaar Standardkurve Wert und experimentelle und Isotypenkontrolle Probe entsprechend. </li><li> In der LightCycler-Software, um den Subset-Editor gehen und markieren Sie die Teilmengen einschließlich der Wells mit Eingang Proben sowie die unbekannten Chip-Proben. Die unbekannten Proben quantifiziert mittels Standardkurve aus den bekannten Konzentrationen des Eingangs Proben für die Analyse erzeugt werden. In gleicher Software auch in anderen qPCR Maschinen verwendet, bezeichnen Teilmengen entspr.onding allen Reaktionen für jeden Primer-Paaren. </li><li> Nach der PCR-Amplifikation abgeschlossen ist, führen Sie die Analyse mit &quot;Abs Quant/2nd Derivative Max&quot; und wählen Sie die Teilmenge zur Analyse und drücken Sie OK. In gleicher Software auch in anderen qPCR Maschinen, konvertieren Cq Wert auf die DNA-Menge in jeder Teilmenge. </li><li> Drücken Sie auf &quot;Berechnen&quot;, die in der Standard-Kurve mit den bekannten Konzentrationen des Eingangs Proben erzeugen und die absolute Menge der DNA in den unbekannten Proben anzuzeigen. </li><li> Wenn die Qualität der DNA geschert ist gut, und wenn die Primer spezifisch an die Zielregion, sollten PCR-Effizienz in der Nähe von 2 sein. </li><li> Führen Sie eine Schmelzkurvenanalyse mit &quot;Tm Calling&quot; für die gleiche Teilmenge, falls verfügbar. Einen einzelnen Peak zeigt an, dass nur ein bestimmter amplifiziert. Amplifikation spezifischer DNA kann auch durch Elektrophorese des PCR-Produkts mit DNA-Leiter auf einem Agarosegel getestet werden. </li><li> Exportieren von Daten als Tab-Textdatei, die in Microsoft Excel zur weiteren Analyse kann geöffnet werden. </li><li> Mit Microsoft Excel, teilen Sie die DNA-Menge für den spezifischen Antikörpers mit dem Isotypenkontrolle für gezielte Primer. Wiederholen Sie diesen Schritt für die Kontrolle Region Primer. Wenn mehrere Antikörper des gleichen Isotyps für verschiedene Immunpräzipitationen verwendet werden, zu normalisieren jeder von diesen mit den Werten aus dem gleichen Isotyp-Kontrolle. Außerdem, wenn mehrere gezielte Primer-Paare verwendet werden, sollte die DNA-Mengen von einer Steuerung Primerpaar Set zur Normalisierung jedes Targets (1 und 2) verwendet werden. Die Ausgangswerte stellen die spezifischen Antikörper Immunpräzipitation fache Anreicherung an jeder Stelle in Bezug auf nicht-spezifische Antikörper Hintergrund Immunpräzipitation. </li><li> Teilen Sie die fache Anreicherung (die Kontrolle Isotyp) zur gezielten Primer mit dem fache Anreicherung (die Kontrolle Isotyp) zur Steuerung Region Primer zu einer Anreicherung in Bezug auf eine zu bekommenKontrolle ungebundenen Region (Abbildung 1). Wichtig ist zu beachten, daß wegen der Erzeugung von Standardkurven mit insgesamt eingesetzten DNA für jede Probe, wobei jede der genannten Immunpräzipitation vom Standard-Kurven interpoliert werden bereits normalisiert, ausgedrückt als der Anteil der Gesamtmenge an von der Maschine Software. </li><li> Wenn die Stringenz der Puffer für die Immunpräzipitation oder Waschen verwendet wird, zu hoch ist, ist es möglich, dass robuste Amplifikation von Proben mit spezifischen Antikörpern immunpräzipitiert beobachtet wird, werden während Amplifikation von Isotyp-Kontrolle immunpräzipitiert Proben nicht beobachtet werden. In einem solchen Szenario ist es besser, die Menge an Isotypkontrollreagenzien Chip von spezifischen Antikörper-Chip sowohl für die Zielregion und der ungebundenen Region zu subtrahieren. Relative Anreicherung kann, indem die Differenz zur Zielregion von Differenz für ungebundene Region (Abbildung 3) berechnet werden. </li></ol>

<ol>
	<li>Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chromatin+immunoprecipitation+to+clone+novel+E2F+target+promoters.">Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters.</a> Molecular and Cellular Biology. 21, 6820-6832 (2001).</li><li>Weinmann, A. S., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unknown+target+genes+of+human+transcription+factors+using+chromatin+immunoprecipitation.">Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation.</a> Methods. 26, 37-47 (2002).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+nuclear+localization+of+NFAT+in+Foxp3++regulatory+T+cells+independent+of+calcineurin+activity.">Constitutive nuclear localization of NFAT in Foxp3+ regulatory T cells independent of calcineurin activity.</a> J. Immunol. 188, 4268-4277 (2012).</li><li>Shakya, A., Kang, J., Chumley, J., Williams, M. A., Tantin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oct1+is+a+switchable,+bipotential+stabilizer+of+repressed+and+inducible+transcriptional+states.">Oct1 is a switchable, bipotential stabilizer of repressed and inducible transcriptional states.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 450-459 (2011).</li><li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(microChIP).">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).</li><li>Lubelsky, Y., Macalpine, H. K., Macalpine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+localization+of+replication+factors.">Genome-wide localization of replication factors.</a> Methods. 57, 187-195 (2012).</li><li>O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+characterization+of+the+early+embryo+with+a+chromatin+immunoprecipitation+protocol+applicable+to+small+cell+populations.">Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations.</a> Nature Genetics. 38, 835-841 (2006).</li><li>Sikes, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+method+for+rapid+and+sensitive+chromatin+immunoprecipitation.">A streamlined method for rapid and sensitive chromatin immunoprecipitation.</a> Journal of Immunological Methods. 344, 58-63 (2009).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution.">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147, 1408-1419 (2011).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes.">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483, 295-301 (2012).</li><li>Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+ChIP-seq+experiments+for+DNA-binding+proteins.">Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins.</a> Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li></ol>

Kein Interessenkonflikt erklärt.

Das Protokoll über eine robuste Methode zur Quantifizierung von DNA genau Anreicherung von primären Lymphozyten mit ChIP. Ein wichtiger Grund für Robustheit in diesem Protokoll ist die Aufnahme der biologischen Replikate. Die obige Protokoll verwendet drei Wiederholungen, die Anreicherung, für die unabhängig berechnet. Die Ausgänge werden dann gemittelt, um einen Grad der Anreicherung und Standardabweichungen berechnet, um ein Maß der Variabilität bereitzustellen. Für jede Probe repliziert drei technischen auch...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formaldehyde</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F-8775</td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline</td>
 <td>Hyclone</td>
 <td>SH30256.01</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease Inhibitor tablets</td>
 <td>Roche</td>
 <td>04693116001</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein G magnetic beads</td>
 <td>Active Motif</td>
 <td>101945</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase A (20 mg/ml)</td>
 <td>EMD Millipore</td>
 <td>556746</td>
 <td>Store at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Proteinase K (20 mg/ml)</td>
 <td>Roche</td>
 <td>03115879001</td>
 <td>Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Platinum Taq DNA Polymerase</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>10966-034</td>
 <td>Store at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SYBR Green I</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>S7567</td>
 <td>Store at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Glycine</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Prepare fresh</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.5 M EDTA</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris-HCl, pH 6.5</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table of Specific Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clay Adams Brand Nutator</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>Model: 421105</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnetic Stand</td>
 <td>Promega</td>
 <td>Z5342</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qiaquick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Masonix Sonicator 3000</td>
 <td>QSonica</td>
 <td>Model: S3000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UV Spectrophotometer</td>
 <td>NanoDrop Technologies</td>
 <td>ND-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heating Block</td>
 <td>VWR</td>
 <td>13259-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotator</td>
 <td>VWR</td>
 <td>80085-692 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Refrigerated bench top centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Model: Allegra X-12R</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcentrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5415 D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table of Equipment </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

efficient chromatin immunoprecipitation using limiting amounts of biomass

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) ist eine weit verbreitete Methode zur Bestimmung der Wechselwirkungen verschiedener Proteine ​​mit DNA in Chromatin lebender Zellen. Beispiele umfassen sequenzspezifische DNA-bindende Transkriptionsfaktoren, Histone und ihre verschiedenen Modifikationen Zustände, Enzyme, wie RNA-Polymerasen und zugehörige Faktoren und DNA-Reparatur-Komponenten. Trotz seiner Allgegenwart, gibt es einen Mangel an up-to-date, detaillierte Methoden sowohl für Bank Vorbereitung des Materials und für die genaue Analyse ermöglicht quantitative Metriken der Interaktion. Durch diesen Mangel an Informationen, und auch, weil, wie jeder Immunpräzipitation Bedingungen müssen für neue Sätze von experimentellen Bedingungen neu optimiert werden kann, ist der Chip-Assay anfällig für fehlerhafte oder schlecht quantitative Ergebnisse. Unser Protokoll wird schließlich vom bahnbrechenden Arbeiten auf Transkriptionsfaktor abgeleitet: DNA-Wechselwirkungen 1,2, sondern beinhaltet eine Reihe von Verbesserungen an Sensibilisierungvity und Reproduzierbarkeit für schwer zu erhalten Zelltypen. Das Protokoll wurde erfolgreich eingesetzt, 3,4, beide unter Verwendung von DNA-qPCR Bereicherung quantifizieren, oder mit Hilfe eines semi-quantitative Variante des unter Protokoll. Diese quantitative Analyse der PCR-amplifizierten Materials rechnerisch durchgeführt und stellt einen begrenzenden Faktor in dem Assay. Wichtige Kontrollen und andere Überlegungen schließen die Verwendung eines Isotyp-Antikörper, sowie Auswertung einer Kontrolle Region von genomischer DNA, wie ein Zwischengenregion vorhergesagt nicht durch das Protein unter Studie (oder erwartet gebunden werden keine Änderungen unter zeigen die experimentellen Bedingungen). Darüber hinaus wird eine Standardkurve von Vormaterial für jeden Span Probe zur Ableitung absoluten Werte der Anreicherung im experimentellen Material. Verwendung von Standard-Kurven hilft zur Berücksichtigung von Unterschieden zwischen Primer-Sets nehmen, unabhängig davon, wie vorsichtig sie sind entworfen, und auch Effizienz unterscheidenschiede über den Bereich der Template-Konzentrationen für eine Primer-Set. Unser Protokoll ist anders als die anderen, die verfügbar sind 5-8 in die wir ausgiebig decken die später Analysephase.

Das Chromatin Immunopräzipitation (ChIP)-Protokoll hier vorgestellten Steuerungen für Unterschiede, wenn überhaupt, in der Höhe von DNA in der PCR durch die Verwendung eines Primer-Paar, das ein ungebundenes Region Genom verstärkt eingesetzt und dienen somit als &quot;Ladekontrolle&quot;. In dem Beispiel in 3 gezeigt ist, haben wir die kodierende Region des Maus istB Gen als eine Region in unseren ungebundenes Protein von Interesse und des Transkriptionsfaktors NFAT Bindungsstelle auf Maus...

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Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Wir beschreiben eine robuste Methode zur Chromatinimmunpräzipitation mit primären T-Zellen. Die Methode basiert auf Standard-Ansätzen gegründet, nutzt aber einen bestimmten Satz von Bedingungen und Reagenzien, die Effizienz für begrenzte Mengen von Zellen einer zu verbessern. Wichtig ist, dass auf eine detaillierte Beschreibung des Datenanalysephase dargestellt.

Effiziente Chromatin Immunopräzipitation mit limitierende Mengen an Biomasse

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.2K Aufrufe.  University of Utah School of Medicine. Wir beschreiben eine robuste Methode zur Chromatinimmunpräzipitation mit primären T-Zellen. Die Methode basiert auf Standard-Ansätzen gegründet, nutzt aber einen bestimmten Satz von Bedingungen und Reagenzien, die Effizienz für begrenzte Mengen von Zellen einer zu verbessern. Wichtig ist, dass auf eine detaillierte Beschreibung des Datenanalysephase dargestellt.

Serie: Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Forschung

Biologie

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

Methylierte DNA Immunpräzipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) zur Assay Dynamische Histonmodifikationen in Activated Gene Expression in menschlichen Zellen

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

Die Quantifizierung der Häufigkeit von Tumor-Ausbreitung Cells Mit Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngene Zebrafisch

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) mit Drosophila Gewebe

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants. Low affinity interactions can be preserved through the use of less-stringent buffer conditions and remain readily identifiable. This protocol discusses the labeling of tissue culture cells with stable isotope labeled amino acids, transfection and immunoprecipitation of an affinity tagged protein of interest, followed by the preparation for submission to a mass spectrometry facility. This protocol then discusses how to analyze and interpret the data returned from the mass spectrometer in order to identify cellular partners interacting with a protein of interest. As an example this technique is applied to identify proteins binding to the eukaryotic translation initiation factors: eIF4AI and eIF4AII.

SILAC immunoprecipitation experiments represent a powerful means for discovering novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants, and low affinity interactions preserved through use of less-stringent buffer conditions.

Identifizierung von Protein-Interaktionspartner in Säugetierzellen mit SILAC-Immunpräzipitation Quantitative Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Chromatinimmunpräzipitation Assay zur Identifizierung von Arabidopsis-Protein-DNA-Wechselwirkungen<em&gt; In-vivo-</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Effiziente Chromatin Immunopräzipitation mit limitierende Mengen an Biomasse

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