Le financement de ce travail est assuré par la National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC projet de subvention à 1011352 MEC et MJC; Independent Research Institutes programme de soutien des infrastructures [IRIISS] subvention à WEHI) et le gouvernement du Victoria (VESKI Innovation Bourse de MEC; gouvernement de l&#39;État de Victoria Soutien opérationnel Infrastructure à WEHI). MEC est une reine Elizabeth II Fellow de l&#39;Australian Research Council. EFXB reconnaît l&#39;appui du Programme des bourses d&#39;études Norma Hilda Schuster à l&#39;Université de Melbourne.

1. Le clonage et la conception Construct Cloner les séquences d&#39;intérêt dans le vecteur PMM-peptide (qui peut être fourni sur demande) en utilisant HindIII et sites de restriction BamHI (voir Figure 1). L&#39;insert d&#39;ADN double-brin doit intégrer, dans l&#39;ordre suivant: un site HindIII; un seul codon méthionine pour le clivage par CNBr; l&#39;E. coli codon optimisé séquence codant pour un peptide, un codon d&#39;arrêt, un site BamHI. Tous les autres méthionines dans le peptide doit être éliminée et la séquence dipeptide Asp-Pro doit être évitée car elle sera également clivé dans des conditions acides. Un résidu de cystéine unique doit être introduit dans chaque séquence peptidique selon le positionnement souhaité de la réticulation disulfure dans le complexe final, et tous les autres cystéines doit être muté en sérine. Le plasmide porte une cassette de résistance à la kanamycine pour la sélection. 2. Expression de trpLE-PeptiFusion de <ol><li> Assurez-vous et stérile milieu filtrant M9/Kan une croissance minime (0,1 mM CaCl 2, 2 mM MgSO 4, 3 g / L KH 2 PO 4, 7,5 g / L de Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0,5 g / L de NaCl, 1 g / L de NH 4 Cl, 4 g / L de glucose, 50 mg / l de sulfate de kanamycine). Supplément avec Centrum complet de A à Zinc de fournir des vitamines B et d&#39;oligoéléments:. Dissoudre 1 comprimé dans 40 ml H 2 O avec le mélange pendant 30 min, centrifuger pour éliminer la matière insoluble et stérile filtre le surnageant d&#39;orange Solution mère Conserver à 4 ° C dans l&#39;obscurité pendant 2 semaines et utiliser 4 ml / L dans M9. NOTE: 15 N-NH 4 Cl enrichi, 13 C-enrichie glucose ou d&#39;autres précurseurs des isotopes stables marqués peuvent être inclus dans un milieu M9 à ce stade si vous le souhaitez. </li><li> Inoculer une culture de 100 ml démarreur fraîchement transformé E. BL21 (DE3) souche coli dans un milieu M9/Kan. Développer une nuit à 37 ° C sous agitation à 200 rpm. </li><li> Le lendemain matin, cochez la DO 600 de la culture de départ - ce qui devrait être de l&#39;ordre de 2 ou plus. Diluer la culture de 100 ml de démarrage dans 1 litres total de Centrum supplémenté en milieu M9. Divisé en deux 2 flacons à chicanes L (500 ml de culture dans chaque flacon) et de croître à 37 ° C sous agitation à 140 tours par minute jusqu&#39;à ce que la DO 600 atteigne 0,6. </li><li> Réglez la température agitateur à 18 ° C et continuer agitation pendant 1 h, ce qui permet aux cultures de se refroidir complètement avant l&#39;induction. </li><li> Prélever un échantillon de pré-induction pour analyse SDS-PAGE (équivalent de 50 ul d&#39;une culture à une DO 600 = 1), puis ajouter IPTG à une concentration de 0,1 mM final pour induire l&#39;expression de la fusion trpLE-peptide. Continuer à croître à 18 ° C/140 rpm nuit (16-20 heures) sous induction IPTG. </li></ol> 3. Préparation corps d&#39;inclusion et reliure matrice de nickel <ol><li> La finale DO 600 de cultures d&#39;expression au jour le jour dans un milieu minimal est variable et should se situer entre 2,5 et 5,0. Prélever un échantillon pour analyse SDS-PAGE (équivalent de 50 ul d&#39;une culture à une DO 600 = 1) et prélever des cellules par centrifugation pendant 20 min à 5000 x g. </li><li> Resuspendre culot cellulaire de 1 L de culture dans 50 ml de tampon de lyse (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM de β-ME, 0,2 M de NaCl). Les suspensions cellulaires peuvent être conservés congelés pour un traitement ultérieur. </li><li> Lyser les cellules par sonication sur glace à la puissance maximale pendant 1 min et reste sur la glace pendant 5 min. Nous utilisons un Sonicator Misonix 3000 (max de sortie 600 watts) à panne ½ pouces haute intensité remplaçable. Répétez sonication / refroidissement pour les trois cycles. </li><li> Recueillir des corps d&#39;inclusion insolubles (IB) matériau par centrifugation pendant 15 minutes à 20.000 xg et jeter le surnageant. Un lâche, mince couche de débris cellulaires de couleur claire peut être visible sur le dessus de la pastille dense IB, ce qui peut être emportée avec de l&#39;eau ou un tampon en agitant doucement. Étapes 3.3 et 3.4 peut être répété pour améliorer la pureté de la fraction IB si desirouge. Des échantillons de granulés et de matériel surnageant doit être pris pour analyse SDS-PAGE pour confirmer la localisation de fusion trpLE-TM de corps d&#39;inclusion. </li><li> Dissoudre IB pellets en solution de guanidine (6 M guanidine-HCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 1% de Triton X-100, 5 mM β-ME), en utilisant 25-50 ml par litre de culture traitée. Cette étape nécessitera plusieurs heures avec agitation occasionnelle et sonication douce. </li><li> Effacer le lysat par centrifugation IB pendant 1 heure à 75,000-100,000 xg et 20 ° C. Décanter le surnageant et filtrer à travers une membrane de 0,2 um. </li><li> Combiner le lysat effacé IB, dans un tube de 50 ml conique ou un plus grand récipient pouvant être fermé solidement, avec de la résine d&#39;affinité au nickel qui a été lavé avec de l&#39;eau et on équilibre à une solution de guanidine. Utiliser 3-4 ml de résine réglé par litre de culture traitée pour des fusions qui expriment à un degré similaire à celle trpLE-DAP12TM montré ici (figure 3, ligne 2). Bind lots, en incubant nuit à t salle<html> empérature en mélangeant doucement. </li></ol> 4. La réticulation oxydative sur colonne <ol><li> Chargez la suspension de résine IB lysat / nickel dans une colonne à écoulement par gravité vide avec support de lit poreux, ajoutant en continu jusqu&#39;à ce que la totalité du volume traverse. Recueillir et mettre de côté le flux continu, qui peut encore contenir des protéines de fusion non lié. </li><li> Laver la résine de nickel par écoulement gravitaire avec 5 volumes de lit de solution d&#39;urée (8 M d&#39;urée, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl) contenant 5 mM de β-ME. </li><li> Laver la résine de nickel à nouveau avec 5 volumes de lit de solution d&#39;urée sans β-ME. </li><li> Laver la résine de nickel pour la troisième fois avec 5 volumes de lit de solution d&#39;urée qui a été complétée par 20 uM CuSO 4 et 2 mM de glutathion oxydé. Après ce lavage, fermer la sortie de la colonne et incuber 30 minutes à température ambiante pour permettre la formation de pont disulfure maximale. </li></ol> 5. Élution TFA et quantification contenu &quot;&gt; ATTENTION: L&#39;acide trifluoroacétique (TFA) provoque de graves brûlures au contact avec la peau et les vapeurs sont extrêmement irritantes concentré TFA doit être utilisé que dans une hotte chimique approuvé fumées avec des lunettes de protection et des gants sans latex Vérifier la compatibilité chimique de tous.. les matériaux utilisés, le polypropylène est compatible avec toutes les étapes de ce protocole. <ol><li> Laver la solution d&#39;urée oxydant avec 10 volumes de lit d&#39;eau et sécher le lit de la colonne en appliquant une ligne vide à la sortie de la colonne. </li><li> Fermez la sortie de la colonne et ajoutez 1,5 volumes de lit de neat (99-100%) TFA. Mélanger la résine de nickel avec une petite spatule à assurer une exposition à l&#39;acide et incuber pendant 5 min. Ouvrir la sortie de la colonne et recueillir l&#39;éluat acide, sous pression lentement avec une seringue ou d&#39;air comprimé si nécessaire pour faire sortir tout le liquide. </li><li> Répéter l&#39;étape d&#39;élution acide avec encore 1,5 volumes de lit de TFA pur. Travailler rapidement à cette étape pour éviter la dissolution totale de l&#39;Beaded matrice d&#39;agarose. Production de protéine peut être déterminée à ce stade, selon l&#39;équation de Beer-Lambert et le coefficient d&#39;extinction molaire théorique de la séquence trpLE-peptide. Diluer un échantillon de l&#39;éluat TFA (1:20 à 1:50) dans le trifluoroéthanol (TFE) et de mesurer l&#39;absorbance à 280 nm, en utilisant un mélange TFA / TFE à la même dilution en blanc. </li></ol> 6. La digestion par CNBr ATTENTION: Le bromure de cyanogène (CNBr) est extrêmement toxique et doit être manipulé que sous une hotte chimique approuvé fumées. PPE, y compris des lunettes de sécurité, blouse de laboratoire et gants sans latex sont absolument nécessaires. CNBr est réactif à l&#39;humidité et doit être amené à température ambiante avant ouverture. Communiquez avec votre bureau de la sécurité institutionnelle pour obtenir des instructions sur la neutralisation / élimination des CNBr contaminés par des solutions et des matériaux. <ol><li> Diluer l&#39;éluat acide à la concentration de TFA 80% final par addition goutte à goutte de l&#39;eau tout en mélangeant délicatement. Si un précipité se forme, unjj revenir un petit volume (0,5 à 1 ml) de TFA pur jusqu&#39;à ce que la solution devienne limpide, puis re-bonne à 80% avec de l&#39;eau. Prenez un 5 pl pré-digérer l&#39;échantillon pour analyse SDS-PAGE, le gel dans de l&#39;azote liquide et lyophilisation de l&#39;échantillon immédiatement. </li><li> Ajouter cristaux CNBr à environ 0,2 g / ml, en prenant soin de peser le produit chimique toxique en toute sécurité dans des lieux fermés, pré-pesés tubes ou à l&#39;aide d&#39;un équilibre intérieur de la hotte pour vapeur chimique. Mélanger doucement jusqu&#39;à dissolution complète. Rincer et sceller le récipient de réaction sous gaz inerte (azote ou argon flux) et incuber 3-4 heures à la température ambiante, à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Prenez un 5 pl post-digestion de l&#39;échantillon pour analyse SDS-PAGE et de geler immédiatement et lyophiliser. Transférer la réaction de digestion à une cassette de dialyse en cellulose régénérée ou le tube (acétate de cellulose se dissout dans l&#39;acide concentré) avec un seuil de coupure de poids moléculaire de 3,5 kDa ou moins, en fonction de la taille du complexe peptide attendu. Dialyser pendant une nuit à 4 litres d&#39;eau dans lehotte pour réduire la concentration de TFA et décomposer toute CNBr n&#39;ayant pas réagi. Laissez de la place dans la cassette de dialyse ou le tube pour une augmentation significative du volume (autant que de deux à trois fois) pendant la dialyse pendant la nuit. </li><li> Retirer la solution de réaction dialysée avec précipité en suspension à partir de la cassette de dialyse ou un tube (plus de la protéine va précipiter lorsque la concentration de TFA est réduite) et transférer la suspension de tubes de 50 ml coniques. Geler et lyophiliser pour éliminer l&#39;eau et des traces de CNBr / TFA. Cette étape est susceptible de nécessiter plusieurs jours. ATTENTION: Tant la réaction de dialyse digest et l&#39;eau de dialyse devraient continuer à être traité comme toxiques et manipulés / éliminés avec les précautions qui s&#39;imposent. </li><li> Des échantillons de cultures de stades pré-induction et de récolte, de corps d&#39;inclusion surnageant et le culot, éluat TFA et CNBr digéré matériau peut être analysé par SDS-PAGE. Préparer des échantillons par chauffage à 95 ° C dans Invitrogen NuPAGE sampl LDSe tampon. Éluat TFA et digérer des échantillons doivent être préparés dans des conditions réductrices et à la fois non réductrice afin de faciliter l&#39;identification des produits et l&#39;évaluation de réticulation oxydative. </li><li> Séparez les échantillons sur un 12% NuPAGE bis-tris gel d&#39;acrylamide préfabriqué en utilisant MES-tampon SDS courir pour une résolution optimale des produits plus petits digérer. </li></ol> 7. En phase inverse Purification HPLC de disulfure réticulés complexes peptidiques <ol><li> Dissoudre jusqu&#39;à 100 mg de produits lyophilisés digérer dans 2-3 ml d&#39;acide formique pur et la charge sur une échelle préparative (21,2 x 150 mm) Agilent ZORBAX SB-300 C3 PrepHT colonne dans le solvant A (typiquement 10-20% d&#39;acétonitrile ou 5 -10% d&#39;isopropanol dans de l&#39;eau avec 0,1% de TFA). </li><li> Éluer les produits de digestion dans un gradient de solvant B (acétonitrile ou de l&#39;isopropanol avec 0,1% de TFA) pendant au moins 5 volumes de colonne. Voir la discussion des suggestions sur le choix des conditions optimales pour gradient séquences peptidiques différentes. </li><li> Prendre50-100 échantillons ul de chaque fraction HPLC pour analyse SDS-PAGE et congeler et lyophiliser immédiatement. L&#39;élimination des solvants HPLC est rapide et devrait être achevée en 1-2 heures. </li><li> Préparer des échantillons lyophilisés pour HPLC SDS-PAGE en chauffant à 95 ° C dans un tampon d&#39;échantillon NuPAGE Invitrogen LDS sans agent réducteur. Laisser refroidir et diviser chaque échantillon de façon égale dans 2 tubes à centrifuger, ajouter 100 mM de DTT à l&#39;un d&#39;eux et le réchauffage brièvement. </li><li> Séparer les échantillons réduits et non réduits HPLC sur un 12% de bis-tris NuPAGE gel d&#39;acrylamide préfabriqué avec MES-SDS exécutant tampon que ci-dessus. Les petits peptides hydrophobes souvent ne prennent pas de Coomassie tache bien et peut ne pas fonctionner à leurs poids moléculaires attendus. Cependant, la comparaison des échantillons réduits et non réduits devrait faciliter l&#39;identification des produits peptidiques réticulés et l&#39;évaluation de la pureté. </li><li> Analyser les candidats peptide fractions contenant par laser assistée par matrice ionisation par désorption temps de vol (MALDI-AF) spectrométrie de masse (voir la discussion) afin d&#39;identifier les espèces d&#39;intérêt et de confirmer sa masse attendue. </li><li> Mélanger, geler et lyophiliser les fractions HPLC contenant le pur, réticulé TM peptide complexes et prennent du poids sec du produit final pour déterminer le rendement. Fractions ayant un contenu élevé isopropanol ne peut pas rester congelés. Si fractions peptidiques sécher vers le bas pour un film plutôt qu&#39;un produit lyophilisé moelleux, re-dissoudre complètement le film dans un petit volume de pure hexafluoroisopropanol (HFIP), congeler et lyophiliser nouveau. Le produit HFIP traité devrait être un petit cône blanc qui est facilement renversée et pesés. </li></ol>

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Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêts financiers.

Expression de trpLE-TM fusions. D&#39;après notre expérience, trpLE-TM fusions sont mal exprimé dans un milieu de culture riche à 37 ° C, et les conditions de culture décrites ici ont fait leurs preuves pour de nombreuses séquences différentes contenant de une à quatre domaines TM avec des rendements allant 50 à 150 mg / L de pur, de fusion intacte. Fusions encodage de trois ou quatre fragments TM RCPG (CCR5 humain TM1-TM3 et TM4-TM7, respectivement) ou un fragment de noyau catalytique de peptidase du...

Ce protocole détaille une procédure que nous avons développé pour produire des complexes disulfure stabilisées transmembranaire (TM) de peptides destinés à des études structurales par RMN solution. La procédure prend avantage de l&#39;expression robuste offerte par le système ΔtrpLE1413 fusion (voir ci-dessous) et permet des complexes peptidiques TM de composition définie pour être générés en utilisant des techniques sophistiquées d&#39;étiquetage des isotopes stables pour les modernes des expériences de RMN multidimensionnelles. Nous avons utilisé ces techniques pour déterminer les structures RMN plusieurs qui ont révélé de nouveaux renseignements importants sur la façon d&#39;activation des lymphocytes immunorécepteurs sont assemblées à partir de plusieurs sous-unités de protéines membranaires par des interactions entre leurs domaines TM (récemment revu à 1). Ces techniques sont applicables à de nombreux autres systèmes de protéines membranaires, ainsi que toute une gamme de méthodes analytiques en aval, en plus de RMN en solution. Bien que l&#39;exemple donné ici utilise des résidus cystéine nativespour créer un complexe qui imite la nature liaisons disulfure des protéines, le design est aussi bien adapté pour la création de ponts disulfures d&#39;ingénierie pour stabiliser des complexes qui sont normalement maintenues ensemble par des faibles, des interactions non covalentes comme homo-et hétéro-dimères complexes de MC Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)-protéines de la famille ou des hétérodimères αβ 04.02 complexes intégrines 5,6. Extrêmement séquences peptidiques hydrophobes tels que ceux issus de la bicouche lipidique, couvrant des portions de protéines TM sont des sujets extrêmement difficiles pour les études biochimiques et biophysiques. En plus d&#39;être très difficile à manipuler à l&#39;aide de protéines standard et des techniques de chimie des peptides, ils sont souvent très toxiques pour les cellules et sont donc difficiles à produire par recombinaison. Nous et les autres 7,8 9-11 ont connu un succès important en exprimant ces séquences peptidiques difficiles chez les bactéries que dans le même cadre carboxy-terminalefusions avec une version modifiée de la séquence dérivée de la ΔtrpLE1413 E. coli opéron trp 12. Le polypeptide ~ 13 kDa trpLE codée par cette séquence peut être produite à des niveaux élevés en vertu d&#39;un promoteur T7 et est entièrement localisée à corps d&#39;inclusion où les problèmes liés à la toxicité et / ou d&#39;instabilité sont contournées. Modification de la séquence par l&#39;addition d&#39;un amino-terminale 9-histidine étiquette 13 et l&#39;élimination des résidus internes de méthionine et de cystéine de la séquence trpLE 14 souhaités trpLE-peptide fusions d&#39;être purifiés par des ions métalliques et la chromatographie d&#39;affinité digéré à l&#39;aide de bromure de cyanogène (CNBr ) pour libérer la séquence peptidique désirée. Nous avons utilisé avec succès ce système pour exprimer plus d&#39;une douzaine de séquences différentes sous forme de fusions trpLE représentant des fragments de protéines membranaires qui contiennent moins de quatre domaines TM (7,8 et résultats non publiés; voir également la section Discussion). Lainnovation majeure dans ce protocole est l&#39;identification des conditions dans lesquelles les non-structurées et très peu soluble trpLE-TM fusions peuvent être efficacement disulfure réticulé dans le contexte d&#39;un flux de travail optimisé. Plusieurs aspects de l&#39;expression à haut rendement, la manipulation et la purification des produits peptidiques ont également été soigneusement optimisé, ainsi que les recommandations présentées ici sont tout aussi pertinentes pour la production de disulfure non-réticulés (monomère) produits peptidiques TM.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Le bromure de cyanogène </td><td> ALDRICH </td><td> P.No-C91492, CAS-506-68-3 </td><td> SUBSTANCE DANGEREUSE. MARCHANDISES DANGEREUSES. Très toxique par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion. Le contact avec des acides, dégage un gaz très toxique. Très toxique pour les organismes aquatiques, peut entraîner à long terme des effets néfastes pour l&#39;environnement aquatique. </td></tr><tr><td> L&#39;acide trifluoroacétique </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.CODE-1000984387, numéro CAS 76-05-1 </td><td> SUBSTANCE DANGEREUSE. MARCHANDISES DANGEREUSES., Provoque de graves brûlures. Nocif par inhalation. Nocif pour les organismes aquatiques, peut entraîner à long terme des effets néfastes pour l&#39;environnement aquatique. </td></tr><tr><td> 2-mercaptoéthanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.No M7154, numéro CAS 60-24-2 </td><td> SUBSTANCE DANGEREUSE. MARCHANDISES DANGEREUSES. Toxique par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion. Irritant pour la peau. Risque de lésions oculaires graves. Peut entraîner une sensibilisation par contact avec la peau. Très toxique pour les organismes aquatiques, peut entraîner à long terme des effets néfastes pour l&#39;environnement aquatique. </td></tr><tr><td> 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Numéro de produit 52512, CAS-No. 920-66-1 </td><td> SUBSTANCE DANGEREUSE. MARCHANDISES DANGEREUSES. Nocif par inhalation et par ingestion. Provoque des brûlures. </td></tr><tr><td> L&#39;acide formique </td><td> Merck KGaA </td><td> K41186564 </td><td> Liquide et vapeurs inflammables. Provoque des brûlures graves de la peau et des lésions oculaires. </td></tr><tr><td> Urée </td><td> UNIVAR, AJAX Finechem </td><td> Numéro de produit, 817, N ° CAS 57-13-6 </td><td> Lorsqu&#39;il est chauffé, decomposes de dioxyde de carbone et l&#39;ammoniac; si brûlé, émet de faibles quantités d&#39;oxydes d&#39;azote. Peut causer des rougeurs et irritations de la peau et les yeux. </td></tr><tr><td> Chlorhydrate de guanidine </td><td> Amresco </td><td> P.No-M110, Numéro CAS: 50-01-1 </td><td> Nocif en cas d&#39;ingestion, irritant pour les yeux graves, Provoque une irritation cutanée, la toxicité aiguë par voie orale, irritant pour la peau Irritant pour les yeux,. </td></tr><tr><td> TRITON X-100 </td><td> SIGMA </td><td> Nombre-T8532 Produit N ° CAS: 9002-93-1 </td><td> Triton X-100 est un détergent non ionique, 100% d&#39;ingrédient actif, qui est souvent utilisé dans des applications biochimiques pour solubiliser les protéines. Triton X-100 n&#39;a pas de propriétés antimicrobiennes et considéré comme un relativement doux détergent non dénaturant </td></tr><tr><td> Son-Sélect nickel-affinité sur gel </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Catalogue Num-P6611 </td><td> EST-Select Gel affinité nickel est un métal immobilisé-ion chromatographie d&#39;affinité (CMAP) de produit. L&#39;Nick HIS-Selectel affinité gel est un chélate de propriété quadridentate sur billes d&#39;agarose chargé avec du nickel qui est conçu pour se lier spécifiquement des protéines contenant histidine. </td></tr><tr><td> (-)-Glutathion oxydé </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Catalogue num 150568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misonix S-3000 sonicateur </td><td> QSONICA </td><td> S-3000 (discontinué) </td><td> Puissance de sortie 600 watts. 1/2-inch remplaçable pointe de la sonde prend 1/2-inch forte intensité, haut volume conseils et une gamme de haute intensité et de faible volume conseils. Plus proches des modèles actuellement disponibles dans cette entreprise sont Q500 Q700 et. </td></tr><tr><td> Version du logiciel système de chromatographie BioLogic DuoFlow, 5,3: RP-HPLC </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> Catalogue Num 760-0047, No Config: AU500571, N ° de série: 484BR3705 </td><td> Peptides se lie d&#39;inverser la phase colonnes HPLC en haute aqueous phase mobile et sont élués des colonnes HPLC RP avec grande phase mobile organique. En RP HPLC des peptides sont séparés en fonction de leur caractère hydrophobe. Peptides peuvent être séparés par l&#39;exécution d&#39;un gradient linéaire de solvant organique. </td></tr><tr><td> Prep HT C3 ZORBAX 300SB-analytique Colonne HPLC, 21,2 x 150 mm granulométrie de 5 um </td><td> Agilent </td><td> Pas de produit: 895150-909 </td><td> HPLC en phase inverse colum </td></tr><tr><td> NuPAGE 12% Bis-Tris Gels </td><td> Life Technologies </td><td> NP0341BOX </td><td> Gels pré coulés pour l&#39;électrophorèse des protéines </td></tr><tr><td> Slide-A-lyseur de cassettes de dialyse G2, 3,5 K MWCO </td><td> Thermo Scientific </td><td> Pas de produit: 87724 </td><td> Dialyse échantillon </td></tr></tbody></table>

production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies

Interactions physiques entre les lipides incorporés hélice alpha domaines de protéines membranaires jouent un rôle crucial dans le repliement et l&#39;assemblage des complexes protéiques membranaires et dans des processus dynamiques tels que transmembranaire (TM) de signalisation et de régulation de la teneur en protéines de la surface cellulaire. Comprendre les caractéristiques structurelles de conduite de l&#39;association des séquences particulières nécessite des analyses sophistiquées biophysiques et biochimiques de complexes peptidiques TM. Cependant, l&#39;hydrophobie extrême de domaines TM rend très difficile à manipuler à l&#39;aide des techniques standard de chimie des peptides, et la production de matériel d&#39;étude approprié s&#39;avère souvent prohibitif difficile. Identifier les conditions dans lesquelles les peptides peuvent adopter des conformations hélicoïdales stables et forment des complexes ajoute spontanément un autre niveau de difficulté. Nous présentons ici un procédé pour la production d&#39;homo-ou hétéro-dimères complexes peptidiques TM à partir de matériaux qui sont exprimées dans E. coli, ce qui permet l&#39;incorporation de marqueurs isotopiques stables pour la résonance magnétique nucléaire (RMN) ou non-naturelles des acides aminés pour d&#39;autres applications relativement peu de frais. La principale innovation de cette méthode est que les complexes de MC sont produites et purifiées comme covalente disulfure associés (réticulé) qui peuvent former des assemblages de structures stables, stoechiométrique et homogène après reconstitution dans un détergent, lipides ou d&#39;autres matériaux de membrane-mimétiques. Nous présentons également des procédures soigneusement optimisés pour l&#39;expression et la purification qui sont également applicables si la production de simples domaines TM ou complexes réticulés et donner des conseils pour adapter ces méthodes à de nouvelles séquences TM.

Le niveau d&#39;expression atteint des fusions trpLE est variable et dépend fortement de la séquence d&#39;acides aminés du peptide ci-joint. Figure 3 montre l&#39;analyse par SDS-PAGE de pré-induction (piste 1) et l&#39;heure de la récolte (piste 2) échantillons provenant d&#39;une culture qui a produit environ 120 mg de pur, intact trpLE-DAP12TM de fusion de 1 litre de culture et de 4 ml matrice de nickel. Tous de la fusion trpLE-DAP12TM a été localisé le corps d&#39;inclusion de pellets (pis...

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Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Les études biophysiques et biochimiques des interactions entre les domaines de la protéine membranaire embarqués face à de nombreux défis techniques, dont le premier est l&#39;obtention de matériel d&#39;étude approprié. Cet article décrit un protocole de production et de purification du disulfure stabilisées complexes peptide transmembranaire qui sont appropriés pour l&#39;analyse structurale par une solution de résonance magnétique nucléaire (RMN) et d&#39;autres applications analytiques.

La production de disulfure stabilisées complexes peptide transmembranaire pour des études structurales

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

production-disulfide-stabilized-transmembrane-peptide-complexes-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

14.0K vues.  The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research. Les études biophysiques et biochimiques des interactions entre les domaines de la protéine membranaire embarqués face à de nombreux défis techniques, dont le premier est l'obtention de matériel d'étude approprié. Cet article décrit un protocole de production et de purification du disulfure stabilisées complexes peptide transmembranaire qui sont appropriés pour l'analyse structurale par une solution de résonance magnétique nucléaire (RMN) et d&#39...

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Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization of OGG1 is undertaken to measure the rates of 8-oxoG excision and product release. When the OGG1 concentration is lower than substrate DNA, time courses of product formation are biphasic; a rapid exponential phase (i.e. burst) of product formation is followed by a linear steady-state phase. The initial burst of product formation corresponds to the concentration of enzyme properly engaged on the substrate, and the burst amplitude depends on the concentration of enzyme. The first-order rate constant of the burst corresponds to the intrinsic rate of 8-oxoG excision and the slower steady-state rate measures the rate of product release (product DNA dissociation rate constant, koff). Here, we describe steady-state, pre-steady-state, and single-turnover approaches to isolate and measure specific steps during OGG1 catalytic cycling. A fluorescent labeled lesion-containing oligonucleotide and purified OGG1 are used to facilitate precise kinetic measurements. Since low enzyme concentrations are used to make steady-state measurements, manual mixing of reagents and quenching of the reaction can be performed to ascertain the steady-state rate (koff). Additionally, extrapolation of the steady-state rate to a point on the ordinate at zero time indicates that a burst of product formation occurred during the first turnover (i.e. y-intercept is positive). The first-order rate constant of the exponential burst phase can be measured using a rapid mixing and quenching technique that examines the amount of product formed at short time intervals (&lt;1 sec) before the steady-state phase and corresponds to the rate of 8-oxoG excision (i.e. chemistry). The chemical step can also be measured using a single-turnover approach where catalytic cycling is prevented by saturating substrate DNA with enzyme (E&gt;S). These approaches can measure elementary rate constants that influence the efficiency of removal of a DNA lesion.

Time courses for the glycosylase activity of 8-oxoguanine DNA glycosylase are biphasic exhibiting a burst of product formation and a linear steady-state phase. Utilizing quench-flow techniques, the burst and the steady-state rates can be measured, which correspond to excision of 8-oxoguanine and release of the glycosylase from the product DNA, respectively.

L&#39;état d&#39;équilibre des mesures cinétiques, pré-état stationnaire, et un seul chiffre d&#39;affaires de l&#39;activité de ADNglycosylase

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Recherche

Chimie

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the chromatograms to microbial suspensions (e.g. fungi or bacteria in broth or agar), allowing time for the microbes to grow in a humid environment, and visualizing zones with no microbial growth.&#160;The effectiveness of this screening method, known as bioautography, depends on both the quality of the chromatographic separation and the care taken with microbial culture conditions.&#160;This paper describes standard protocols for TLC and contact bioautography&#160;with a novel application to amino acid-fermenting bacteria. The extract is separated on flexible (aluminum-backed) silica TLC plates, and bands are visualized under ultraviolet (UV) light.&#160;Zones are cut out and incubated face down onto agar inoculated with the test microorganism.&#160;Inhibitory bands are visualized by staining the agar plates with tetrazolium red.&#160;The method is applied to the separation of red clover (Trifolium pratense cv. Kenland) phenolic compounds and their screening for activity against Clostridium sticklandii, a hyper ammonia-producing bacterium (HAB) that is native to the bovine rumen.&#160;The TLC methods apply to many types of plant extracts&#160;and other bacterial species (aerobic or anaerobic), as well as fungi, can be used as test organisms if culture conditions are modified to fit the growth requirements of the species.

Thin-layer Chromatographic TLC Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

Methods are described for thin-layer chromatographic (TLC) separation of plant extracts and contact bioautography to identify antibacterial metabolites. The methods are applied to the screening of red clover phenolic compounds inhibiting hyper&#160;ammonia-producing bacteria (HAB) native to the bovine rumen.

Mince couche chromatographique (CCM) Séparations et essais biologiques d&#39;extraits végétaux pour identifier des composés antimicrobiens

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the ...

Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. Compared to other analytical separation techniques, such as chromatography, CE is cheap, robust and effectively requires no sample preparation (for a number of complex natural matrices or polymeric samples). CE is fast and can be used to follow the evolution of mixtures in real time (e.g., chemical reaction kinetics), as the signals observed for the separated compounds are directly proportional to their quantity in solution.
Here, the efficiency of CE is demonstrated for monitoring the covalent grafting of peptides onto chitosan films for subsequent biomedical applications. Chitosan&#39;s antimicrobial and biocompatible properties make it an attractive material for biomedical applications such as cell growth substrates. Covalently grafting the peptide RGDS (arginine - glycine - aspartic acid - serine) onto the surface of chitosan films aims at improving cell attachment. Historically, chromatography and amino acid analysis have been used to provide a direct measurement of the amount of grafted peptide. However, the fast separation and absence of sample preparation provided by CE enables equally accurate yet real-time monitoring of the peptide grafting process. CE is able to separate and quantify the different components of the reaction mixture: the (non-grafted) peptide and the chemical coupling agents. In this way the use of CE results in improved films for downstream applications.
The chitosan films were characterized through solid-state NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy. This technique is more time-consuming and cannot be applied in real time, but yields a direct measurement of the peptide and thus validates the CE technique.

Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

Electrophorèse Capillaire pour surveiller Peptide greffant sur chitosan Films en temps réel

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. ...

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, allowing for the synthesis of isotactic poly(&#945;-hydroxy acids) with expected molecular weights (&#62;140 kDa) and narrow molecular weight distributions (Mw/Mn &#60; 1.1). This ring-opening polymerization is mediated by Ni and Zn complexes in the presence of an alcohol initiator and a photoredox Ir catalyst, irradiated by a blue LED (400 - 500 nm). The polymerization is performed at a low temperature (-15 &#176;C) to avoid undesired side reactions. The complete monomer consumption can be achieved within 4 - 8 hours, providing a polymer close to the expected molecular weight with narrow molecular weight distribution. The resulted number-average molecular weight shows a linear correlation with the degree of polymerization up to 1000. The homodecoupling 1H NMR study confirms that the obtained polymer is isotactic without epimerization. This polymerization reported herein offers a strategy for achieving rapid, controlled O-carboxyanhydrides polymerization to prepare stereoregular poly(&#945;-hydroxy acids) and its copolymers bearing various functional side-chain groups.

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

A protocol for the controlled photoredox ring-opening polymerization of O-carboxyanhydrides mediated by Ni/Zn complexes is presented.

Contrôlé Photoredox polymérisation par ouverture de O- Carboxyanhydrides médiées par les Complexes de Ni/Zn

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, ...

Preparation of Stable Bicyclic Aziridinium Ions and Their Ring-Opening for the Synthesis of Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the aziridine ring. The utility of bicyclic aziridinium ions, specifically 1-azoniabicyclo[3.1.0]hexane and 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate highlighted in the aziridine ring openings by the nucleophile with the release of the ring strain to yield the corresponding ring-expanded azaheterocycles such as pyrrolidine, piperidine and azepane with diverse substituents on the ring in regio- and stereospecific manner. Herein, we report a simple and convenient method for the preparation of the stable 1-azabicyclo[4.1.0]heptane tosylate followed by selective ring opening via a nucleophilic attack either at the bridge or at the bridgehead carbon to yield piperidine and azepane rings, respectively. This synthetic strategy allowed us to prepare biologically active natural products containing piperidine and azepane motif including sedamine, allosedamine, fagomine and balanol in highly efficient manner.

Bicyclic aziridinium ions such as 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate were generated from 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl]aziridine, which was utilized for the preparation of substituted piperidines and azepanes via regio- and stereospecific ring-expansion with various nucleophiles. This highly efficient protocol allowed us to prepare diverse azaheterocycles including natural products such as fagomine, febrifugine analogue and balanol.

Préparation des Ions Aziridinium bicycliques Stable et leur ouverture pour la synthèse de Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the ...

Novel Techniques for Observing Structural Dynamics of Photoresponsive Liquid Crystals

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational spectroscopy and time-resolved electron diffraction. Liquid crystal phase is an important state of matter that exists between the solid and liquid phases and it is common in natural systems as well as in organic electronics. Liquid crystals are orientationally ordered but loosely packed, and therefore, the internal conformations and alignments of the molecular components of LCs can be modified by external stimuli. Although advanced time-resolved diffraction techniques have revealed picosecond-scale molecular dynamics of single crystals and polycrystals, direct observations of packing structures and ultrafast dynamics of soft materials have been hampered by blurry diffraction patterns. Here, we report time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffractometry to acquire ultrafast snapshots of a columnar LC material bearing a photoactive core moiety. Differential-detection analyses of the combination of time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffraction are powerful tools for characterizing structures and photoinduced dynamics of soft materials.

Here, we present the protocols of differential-detection analyses of time-resolved infrared vibrational spectroscopy and electron diffraction which enable observations of the deformations of local structures around photoexcited molecules in a columnar liquid crystal, giving an atomic perspective on the relationship between the structure and the dynamics of this photoactive material.

Nouvelles Techniques d’observation dynamique des structures des cristaux liquides photopériode

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Analyse des Architectures de protéine et Complexes protéine-Ligand par spectrométrie de masse structurelle intégrative

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Preparation of SNS Cobalt(II) Pincer Model Complexes of Liver Alcohol Dehydrogenase

Chemical model complexes are prepared to represent the active site of an enzyme. In this protocol, a family of tridentate pincer ligand precursors (each possessing two sulfur and one nitrogen donor atom functionalities (SNS) and based on bis-imidazole or bis-triazole compounds) are metallated with CoCl2&#183;6H2O to afford tridentate SNS pincer cobalt(II) complexes. Preparation of the cobalt(II) model complexes for liver alcohol dehydrogenase is facile. Based on a quick color change upon adding the CoCl2&#183;6H2O to acetonitrile solution that contains the ligand precursor, the complex forms rapidly. Formation of the metal complex is complete after allowing the solution to reflux overnight. These cobalt(II) complexes serve as models for the zinc active site in liver alcohol dehydrogenase (LADH). The complexes are characterized using single crystal X-ray diffraction, electrospray mass spectrometry, ultra-violet visible spectroscopy, and elemental analysis. To accurately determine the structure of the complex, its single crystal structure must be determined. Single crystals of the complexes that are suitable for X-ray diffraction are then grown via slow vapor diffusion of diethyl ether into an acetonitrile solution that contains the cobalt(II) complex. For high quality crystals, recrystallization typically takes place over a 1 week period, or longer. The method can be applied to the preparation of other model coordination complexes and can be used in undergraduate teaching laboratories. Finally, it is believed that others may find this recrystallization method to obtain single crystals beneficial to their research.

Preparation of SNS CobaltII Pincer Model Complexes of Liver Alcohol Dehydrogenase

The preparation of SNS pincer cobalt(II) model complexes of liver alcohol dehydrogenase is presented here. The complexes can be prepared by reacting the ligand precursor with CoCl2&#183;6H2O and can then be recrystallized by allowing diethyl ether to slowly diffuse into an acetonitrile solution that contains the cobalt complex.

Préparation de SNS Cobalt(II) Pincer Model Complexs of Liver Alcohol Dehydrogenase

Chemical model complexes are prepared to represent the active site of an enzyme. In this protocol, a family of tridentate pincer ligand precursors (each ...

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.