Il a été bien établi que les structures de nombreuses protéines sont stabilisées dans des liens de disulfure covalents. Dans des travaux récents, ce lien a été classé comme une modification post-translationnelle. Ainsi, il est important d’être en mesure d’identifier les complexes multimères stabilisés à la cystéine dans les cellules vivantes en utilisant une méthode rapide et simple.
Le principal avantage de cette technique est que les résultats peuvent être obtenus et interprétés rapidement, facilement et avec un coût minimum. Pour commencer, cultivez des cellules U-2 OS dans un plat de six centimètres carrés en minimum essentiel à haute teneur élevée en glucose, complété par 10% FBS et 1% pyruvate de sodium à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5%. Faire un bouillon frais d’iodoacetamide de 10 millimollar juste avant utilisation.
Après que les cellules atteignent 50 à 60% confluency, ajoutez l’iodoacetamide final millimolar de concentration 0.1 millimolar directement au média de culture cellulaire. Faire bercer doucement le plat à température ambiante pendant deux minutes. Ensuite, aspirez les médias des cellules, et lavez les cellules avec cinq millilitres de PBS froid trois fois.
Aspirez la solution finale de lavage PBS et ajoutez un millilitre de PBS froid. Racler les cellules du fond du plat à l’aide d’un grattoir cellulaire. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, dessinez le PBS et la suspension cellulaire et distribuez tout le liquide dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.
Faites tourner les cellules à 7500 fois g en quatre degrés Celsius pendant trois minutes. Aspirez le PBS en laissant la pastille cellulaire derrière. La pastille cellulaire peut être stockée à moins 80 degrés Celsius jusqu’au traitement.
Pour extraire la protéine, préparer 100 microlitres d’un tampon de lyse 1X dilué dans de l’eau distillée double. Ajouter le PMSF immédiatement avant l’utilisation à une concentration finale d’un millimlaire. Ajouter ensuite 50 microlitres du tampon de lyse 1X directement à la pastille cellulaire et les suspendre à nouveau.
Incuber l’extrait sur la glace pendant cinq minutes. Sonicate pendant huit secondes en utilisant le mode impulsion constante à 40%garder l’extrait sur la glace. Faites tourner l’extrait à 4 degrés Celsius et 16 000 fois g pendant cinq minutes.
Effectuez l’analyse de Bradford pour déterminer la concentration de protéines si désiré. Pour préparer l’échantillon, prenez 10 microlitres de l’extrait de protéine soluble et ajoutez 10 microlitres d’un tampon d’échantillon 1X Laemmli SDS. Gardez les échantillons sur la glace.
Chauffer l’échantillon à 85 degrés Celsius pendant cinq minutes avant de faire fonctionner le gel. Pour commencer le formaldéhyde de liaison croisée, faire croître les cellules U-2 OS dans un flacon de 175 centimètres carrés à 70 à 80% confluency. Dans une hotte de fumée ajouter le fixatif de formaldéhyde directement au milieu à une concentration finale de 1% et incuber à température ambiante avec une agitation douce pendant 15 minutes.
Pour étancher la réaction ajouter 1,25 glycine molaire à une concentration finale de 0,125 molaire et incuber à température ambiante avec une agitation douce sur un rocker pendant cinq minutes. Lavez les cellules avec cinq millilitres de PBS froid trois fois. Aspirez la solution finale de lavage PBS et ajoutez 10 millilitres de PBS.
Racler les cellules du fond du flacon à l’aide d’un grattoir cellulaire. À l’aide d’une pipette de 10 millilitres, tracez la suspension PBS et cellulaire et distribuez tout le liquide dans un tube de centrifugeuse conique de 15 millilitres. Faites tourner les cellules à 500 fois g et quatre degrés Celsius pendant deux minutes.
Aspirez le PBS en laissant la pastille cellulaire derrière. Préparez 10 millilitres du tampon d’homogénéisation en ajoutant 0,25 saccharose molaire, un millimolaire EDTA, 10 millimolaire HEPES et 0,5%BSA au pH 7,4. Immédiatement avant l’utilisation, ajouter le PMSF à une concentration finale d’un millimolaire et à trois millilitres du tampon de suspension des noyaux.
Ajouter cinq millilitres du tampon d’homogénéisation directement à la pastille cellulaire et resuspendre complètement. Centrifuger la suspension à 500 fois g et quatre degrés Celsius pendant deux minutes. Après centrifugation, jetez le supernatant et réutilisez la pastille en cinq millilitres du tampon d’homogénéisation.
Ensuite, avec un verre moulant téflon homogénéiseur dounce homogénéiser les cellules à 10 coups par 500 RPM et centrifugeuse de la suspension à 1500 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Après centrifugation jeter le supernatant. Resuspendez la pastille dans un millilitre du tampon de suspension des noyaux et incubez sur la glace pendant 10 minutes.
Après l’incubation, centrifugeuse à 600 fois g pendant 10 minutes. Après la centrifugation, jeter le supernatant, resuspendre la pastille dans un millilitre de la suspension des noyaux tampon et centrifugeuse à nouveau. La pastille finale sera les noyaux isolés.
Extraire les protéines telles que décrites avant d’ajouter 25 microlitres du tampon de lyse 1X directement à la pastille cellulaire. Ensuite, préparez deux échantillons pour SDS PAGE en prenant 10 microlitres chacun de l’extrait de protéine soluble et ajouter 10 microlitres de 2X Laemmli SDS tampon échantillon et un microlitres de BME. Chauffer un échantillon à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes et le deuxième échantillon à 98 degrés Celsius pendant 15 minutes pour inverser le lien de formaldéhyde.
Préparez un litre de tampon de fonctionnement 1X Tris-glycine en mélangeant 25 millimolaires Tris, 192 millimolar glycine et 0,1% poids par volume SD. Configurez ensuite l’appareil d’exécution SDS PAGE. Ouvrez le paquet TGX SDS-PAGE préfabriqué à 16 % selon le protocole du fabricant et retirez la cassette. Retirez le peigne qui tapisse les puits et le ruban du bas de la cassette et placez le gel dans l’appareil en marche.
Remplissez la chambre avec le tampon de fonctionnement 1X jusqu’à ce que les puits soient immergés dans le liquide. À l’aide d’une pipette en plastique rincer les puits avec tampon en cours d’exécution. Chargez les échantillons sur le gel avec 10 microlitres du marqueur standard pré-taché.
Enfin, faire fonctionner le gel à 200 volts jusqu’à ce que le front de teinture est d’environ un centimètre du fond du gel. Une analyse occidentale de tache des extraits totaux de cellules en l’absence de l’agent réducteur de BME a démontré une formation complexe multimérique dans différentes populations humaines de cellules. Le complexe a disparu avec l’ajout de BME dans les quatre lignées cellulaires examinées, indiquant la présence d’un lien de disulfide.
La confirmation monomère du dUTPase dans les cellules humaines au moment de la récolte est une combinaison d’au moins trois des isoformes du dUTPase : l’isoforme mitochondrial, l’isoforme nucléaire, et une version tronquée notée à M24. L’isoforme mitochondrial utilisé comme contrôle n’a pas forgé de lien de disulfide et a migré vers le poids moléculaire prévu pour la protéine monmérique. Le lien de formaldéhyde du dUTPase nucléaire a démontré la formation complexe multimérique.
Lorsque le lien croisé a été inversé en incubant l’échantillon à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes, le complexe a été déstabilisé et a pu être visualisé dans son état monomère. L’ajout d’iodoacetamide est une étape importante dans cette procédure pour bloquer les résidus libres de cystéine et pour s’assurer que les liens de disulfide ne sont pas une conséquence de la procédure d’extraction. Il est important de se rappeler de ne pas ajouter d’agent réducteur, comme le BME ou le DDT à vos échantillons SDS-PAGE, car ceux-ci réduiront les liens de disulfide présents dans votre échantillon.
