Les animaux transgéniques sont essentiels à la recherche biomédicale moderne car ils permettent des études de la fonction génique dans les organismes vivants. Diverses méthodes de modifications génétiques ont été appliquées dans les études sur les animaux. Ici, nous présentons une technique largement accessible et efficace qui utilise les vecteurs lentiviraux comme un outil pour l’incorporation transgénique dans le génome d’un embryon de rat.
Après l’administration chorionique humaine de gonadotropine, accouplez les rats femelles de Wistar de cinq semaines un-à-un avec les mâles sexuellement fertiles de trois à 10 mois de Wistar. Le lendemain matin, à 8 h .m, vérifiez la présence d’une prise vaginale et récoltez les oviductes des femelles avec une prise d’accouplement au plus tard 10 .m.
dans un plat de collection contenant un milieu M2 préchauffé. Lorsque tous les oviductes ont été recueillis, transférer les tissus dans un plat de 35 millimètres contenant un milieu M2 préchauffé complété par 0,5 milligramme par millilitre d’hyaluronidase à partir de testicules bovins et placer le plat sous un microscope stéréo. Utilisez des forceps fins pour ouvrir les parois de l’oviducte et appuyez sur l’ampulla jusqu’à ce que les embryons soient libérés.
Pour faciliter la libération des embryons des cellules cumulus, utilisez une pipette de transfert de verre reliée à un tube d’aspirateur à commande buccale pour pipette doucement les embryons de haut en bas. Lorsque tous les embryons ont été libérés, lavez les cellules à quelques reprises dans un milieu M2 frais pour enlever l’hyaluronidase et les débris cellulaires. Transférer les embryons dans des gouttes individuelles de 50 microlitres de milieu M16 prééquilibré recouvert d’huile minérale dans un plat de 60 millimètres.
Placez ensuite le plat dans un incubateur humidifié de 37 degrés Celsius avec une atmosphère de dioxyde de carbone de 5 % jusqu’à leur injection. Pour la microinjection vectorielle lentiviral sous la zona pellucida des embryons à un stade cellulaire, utilisez un puller pipette pour préparer des capillaires en verre borosilicate de microinjection avec un filament. Après chaque fois que le filament est changé ou un nouveau capillaire en verre est utilisé, exécutez un test rampe pour définir les paramètres optimaux.
Ensuite, utilisez une pointe de microchargeur pour charger environ deux microlitres de solution lentivirale fraîchement décongelée par pipette de microinjection sous un capot d’écoulement laminaire de biosécurité. Ajouter une goutte de 100 microlitres de milieu M2 au centre du couvercle à partir d’une boîte de Pétri de 60 millimètres. Couvrir le milieu d’huile minérale et monter la pipette de fixation et le virus chargé capillaires microinjection sur un micromanipulateur.
Placer le plat de microinjection sous un microscope inversé et transférer 15 à 20 embryons à un stade cellulaire dans la goutte M2 dans le plat de microinjection. Capturez un embryon avec la pipette de fixation et utilisez le grossissement 400 fois et le capillaire de verre pour injecter la solution lentiviral sous la zona pellucida dans l’espace périvitelline tenant le capillaire sous la zona pellucida pendant un moment après que le virus a été livré. Lorsque tous les embryons ont été injectés, utilisez une pipette fine pour retourner les cellules injectées dans le plat de culture et retourner le plat à l’incubateur de culture cellulaire jusqu’à leur implantation.
Pour préparer les mères adoptives au transfert d’embryons, accoupler les femelles Sprague-Dawley sexuellement matures avec des mâles vasectomisés et vérifier les femelles le lendemain matin pour une prise vaginale. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale chez les femelles anesthésiées avec un bouchon viable, appliquez de l’onguent sur les yeux de l’animal et rasez la fourrure de l’arrière de chaque animal. Placez le premier rat en position couchée sur une surface propre sur un coussin chauffant sous un microscope chirurgical.
Couvrir le rat d’un drapé stérile avec un petit trou coupé sur le bas du dos et faire une incision cutanée d’environ deux centimètres parallèle à la colonne vertébrale lombaire. Utilisez des ciseaux pointus pour faire une coupure dans la paroi abdominale et utilisez des forceps pour saisir un coussin de graisse ovarienne. Retirer l’ovaire et l’oviducte de la cavité abdominale sur un morceau de gaze trempée de chlorure de sodium à 0,9 %.
Chargez le milieu M2, trois bulles d’air et les embryons dans un capillaire de transfert. Utilisez des microscisseurs pour faire une petite incision dans l’oviducte entre l’infundibulum et l’ampulla et insérer la pointe de la pipette de transfert dans l’incision. Expulser doucement les embryons et les bulles d’air dans l’oviducte, puis utiliser des forceps contondants pour placer l’appareil reproducteur de nouveau dans la cavité abdominale.
Suture de la paroi abdominale avec des sutures absorbables à l’acide polyglycolique et fermer l’incision cutanée avec des pinces à plaies et placer l’animal dans une cage propre sur une plaque chauffante avec surveillance jusqu’à ce que la pleine écume. Pour vasectomiser les partenaires potentiels, après avoir préparé le rat mâle pour la chirurgie comme démontré, utilisez 70% d’éthanol et un gommage chirurgical pour désinfecter la peau sur les testicules. Appuyez doucement sur l’abdomen pour exposer les testicules dans le sac scrotal et couvrir le rat d’un drapé stérile avec un petit trou sur le site chirurgical et utiliser des ciseaux scrotal pour faire une incision de 0,5 centimètre au milieu du sac.
Poussez soigneusement les testicules vers la gauche et localisez les déférents de vas entre le testicules et la ligne médiane comme conduit blanc avec un seul vaisseau sanguin. Utilisez les forceps de l’horloger pour tirer doucement les déférents vas hors du sac scrotal et tenant le navire avec des forceps, utilisez des ciseaux fins pour enlever un fragment d’un centimètre du conduit. Répétez la procédure pour le deuxième testicules comme vient de le démontrer et fermez la peau avec des sutures absorbables à l’acide polyglycolique.
Ensuite, placez le rat dans une cage propre sur une plaque chauffante avec surveillance jusqu’à ce que la charge complète. Dans cette expérience représentative dans laquelle des embryons simples ont été injectés plusieurs fois, huit rats sont nés d’embryons qui ont été injectés deux fois, dont trois ont été confirmés pour porter le transgène. L’un des fondateurs n’a pas transféré le transgène à la progéniture et trois femelles adoptives ont été utilisées pour chaque configuration expérimentale.
L’approche choisie a permis la génération de lignées de rats transgéniques stables qui exprimaient la protéine de fusion TDP-43-eGFP sous le contrôle de la synapse neuronale chez un promoteur dans tout le système nerveux central. La transgenèse à base de lentivirus a donné lieu à une insertion à copie unique du transgène, comme le démontre le PCR quantitatif. Lorsque cette méthode a été utilisée pour d’autres vecteurs lentiviraux, un taux de survie d’environ 90 % a été observé.
Le pourcentage d’embryons qui ont survécu aux injections pronucléaires était significativement inférieur. Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent que les rats femelles enceintes peuvent être utilisés comme mères adoptives avec une efficacité comparable. Notamment, les données numériques analysées pour des cycles individuels de microinjection indiquaient que l’efficacité de l’implantation dépendait directement du nombre d’injections dans un embryon et indirectement de la charge virale.
L’utilisation de vecteurs lentiviraux garantit l’intégration génomique et la transmission du transgène et facilite un taux de survie élevé des embryons micromanipulés même lorsque de multiples injections subdermiques sont effectuées. Cette procédure peut être appliquée efficacement à d’autres espèces et peut être considérée comme une alternative à la transgenèse conventionnelle.
