Cette étude a été soutenue par le Centre Edmond Safra et Lily pour Brain Sciences (SB bourse), The Heritage biomédicale Programme de partenariat des sciences héritage de la Fondation Israël Sciences (Grant No. 378/11, le SH) et la Fondation allemande pour la recherche scientifique israélienne Recherche et Développement (GIF) (Grant No. 1093-32.2/2010, le SH).

1. Préparation lentivirus <ol><li> Cultiver des cellules HEK-293FT à 90% de confluence. </li><li> Le jour de milieu de cellules de changement de transfection de DMEM sans sérum supplémenté avec 1 mM de glutamine et 50 mg / ml de pénicilline-streptomycine. </li><li> Co-transfection des cellules avec un vecteur pLKO.1-Puro et avec des plasmides codant pour la delta R8.2 et VSV-G fractions et le miRNA d&#39;intérêt, en utilisant 10 pi de 1 mg / ml polyéthylénimine comme support 9. </li><li> Recueillir lentivirus emballés à 24 h et 48 h post-transfection, filtre à travers un filtre de 0,45 um. </li><li> Concentrer les lentivirus utilisant ultracentrifugation à 70.000 xg, pendant 2 heures et 15 ° C, aliquote et conserver à -70 ° C. </li><li> Mesure titre de virus en infectant des cellules HEK-293T avec les préparations de virus dilués en série (1 à 10 -6 ml de vecteur par puits). Le titre obtenu (un minimum de ~ 1 × 10 9 particules infectieuses par ml est recommandée) est évalué pour l&#39;expression du gene d&#39;intérêt, en utilisant la sélection à la puromycine et en quantifiant exprimant la GFP virus par comptage des cellules fluorescentes. </li></ol> Pour le protocole plus détaillé de la préparation des lentivirus voir 10. 2. Préparation pour la chirurgie Animaux <ol><li> Chirurgiens costume devrait inclure casaque, gants stériles, bonnet et masque. </li><li> Peser l&#39;animal, puis anesthésier avec un IP-injection d&#39;un mélange kétamine, le volume proportionnel au poids de l&#39;animal tel que spécifié pour chaque médicament. Pour un mélange kétamine / xylazine, une gamme de doses de 80-200 mg / kg de kétamine et de 7-20 mg / kg de xylazine est habituellement utilisé pour les souris. </li><li> Attendez jusqu&#39;à ce que l&#39;animal est complètement anesthésié, puis vérifier par manque de réflexe de retrait de la patte arrière de l&#39;animal par l&#39;extension de la jambe, puis en appuyant avec votre doigt. </li><li> Injecter l&#39;animal sous-cutanée avec Rimadyl, comme indiqué sur la boîte, pour le soulagement de la douleur. Intervalle de dose typique pour Rymadil est de 5-10 mg. </li><li> Placez l&#39;animal sur un coussin chauffant pour maintenir une température corporelle constante et humidifier les yeux avec de l&#39;huile. </li><li> Raser la zone entre les deux oreilles d&#39;une machine à déborder. </li><li> Désinfectez la peau avec de la bétadine. </li></ol> 3. L&#39;exposition de la Skull and Forage <ol><li> Placez l&#39;animal à l&#39;intérieur du stereotact en réglant les tiges dans les crevasses juste en avant de l&#39;oreille de l&#39;animal. </li><li> Utiliser un scalpel pour faire une incision antéro-postérieur d&#39;environ 1,5 cm entre les oreilles et le garder ouvert avec des pinces de chirurgie (serfines). </li><li> Nettoyer la surface du crâne avec un coton-tige jusqu&#39;à l&#39;intersection entre la suture coronale et sagittale sutures, c&#39;est à dire le bregma et l&#39;intersection entre les sutures coronale et lambdoid, c&#39;est-lambda, sont visibles. </li><li> Pointer le bout de la seringue, détenu par l&#39;stereotact, au point bregma, à chacun des trois axes. Notez les coordonnées. Ce point sera considéré comme le zéro point dans les trois axes. </li><li> Soulevez la seringue dans l&#39;axe vertical de sorte qu&#39;un mouvement plan ne serait pas gratter le crâne et déplacer la tête de la seringue à l&#39;emplacement correct. Injections de CA1 hippocampiques exigent coordonne la suivante par rapport au bregma en mm: -2 sur l&#39;axe antérieur / postérieur, ± 1,8 à l&#39;axe latéral / médial et -1,5 à l&#39;axe dorsal / ventral. </li><li> Abaissez le bout de la seringue jusqu&#39;à ce qu&#39;il touche le crâne et marquer l&#39;endroit avec un marqueur. Retirez la seringue en arrière pour éviter coups de couteau. </li><li> Percez un trou peu profond, que dans l&#39;os du crâne à l&#39;aide d&#39;une amende foreur. Maintenez le foreur stable de sorte qu&#39;il ne continuerait pas à percer le dessous des tissus mous. Vous pouvez éviter cela en stabilisant une main avec l&#39;autre et en forant à impulsions courtes. </li></ol> 4. L&#39;injection de la Lentivirus <ol><li> Prélever 0,5 ml de la solution concentrée de lentivirus. </li><li> Placez la seringue au-dessus du trou et abaissez lentement à la verticale jusqu&#39;à ce qu&#39;il REAches de la surface du crâne. Continuer à abaisser la seringue dans le cerveau très lentement. À cette étape du saignement peut se produire qui ne signifie pas nécessairement une pénétration échoué. En cas de saignement éponger avec un coton-tige. </li><li> Régler la pompe numérique à 0,02 ml / min (0,5 pi serait injecté dans 25 min) et démarrer la perfusion. Perfusion lente permet une diffusion efficace du virus dans les tissus et empêche le reflux. Dans certains types de seringues envisager d&#39;insérer la seringue pour une profondeur supplémentaire de 0,5 mm avant de se replier aux coordonnées originales et de la perfusion. </li><li> Après la perfusion est terminée attendre 5 min supplémentaire pour permettre à la matière de se propager dans le cerveau au lieu de se retirer en arrière dans le canal formé par la seringue. </li><li> Retirez la seringue très lentement et surveillez les flux de retour. Si un flux de retour est observé à cette étape, une fraction de la matière injectée était probablement perdue. </li></ol> 5. étanchéité de la plaie et de récupération <ol><li> Seal èmee enroulé avec histoacryl. Soyez sûr d&#39;éviter la fuite de la histoacryl dans les yeux. </li><li> Injecter par voie intrapéritonéale des animaux (IP) avec 1 ml de sérum physiologique préchauffé, pour éviter la déshydratation. </li><li> Placer l&#39;animal dans une cage de récupération qui est positionnée sur un tapis chauffant. Regardez l&#39;animal pendant qu&#39;il récupère pendant une heure supplémentaire. </li></ol> En cas de perte de poids, manque d&#39;appétit, faiblesse / incapacité d&#39;obtenir des aliments ou de l&#39;eau, état moribond ou d&#39;une infection, l&#39;euthanasie de l&#39;animal doit être effectuée. Méthodes acceptables pour l&#39;euthanasie des rongeurs sont les barbituriques, anesthésiques inhalés, CO 2, CO, ou chlorure de potassium en association avec une anesthésie générale. Après 4 à 6 semaines, d&#39;évaluer la mémoire de navigation de l&#39;animal est évaluée dans le labyrinthe d&#39;eau de Morris. Le lentivirus habituellement infecter la plupart des cellules à l&#39;intérieur de la sphère d&#39;injection. 6. L&#39;évaluation comportementale dans la piscine de Morris <ol><li> Former les animaux dans le Morris Water Maze. Pour la formation exacte et le protocole d&#39;essais, voir 11. Après chaque essai, sécher l&#39;animal avec une serviette sèche, remplacez-le dans sa cage et rafraîchir l&#39;eau dans le réservoir. </li><li> Testez les animaux dans le labyrinthe d&#39;eau de Morris pendant 3 jours consécutifs, 4 essais chaque jour. Chaque jour, insérer l&#39;animal dans le labyrinthe dans chacune des 4 directions du labyrinthe (nord, sud, est et ouest) dans un ordre changeant, par exemple le premier jour: est-ouest-nord-sud, deux jours: ouest-sud -nord-est. Essuyez les animaux après chaque essai. </li><li> Pendant l&#39;essai, les essais de suivre l&#39;animal avec un système de suivi telle que le système de suivi Noldus. </li><li> Après l&#39;essai de 12 e de test, insérez l&#39;animal dans le réservoir d&#39;eau sans la plate-forme pendant une minute. Ce serait utilisé pour analyser la stratégie de recherche de l&#39;animal prend. </li><li> Analyser les données comme suggéré dans 12. </li></ol>

<ol>
	<li>Siegel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+screen+implicates+microRNA-138-dependent+regulation+of+the+depalmitoylation+enzyme+APT1+in+dendritic+spine+morphogenesis.">A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).</li><li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+interaction+between+the+fragile+X+mental+retardation+protein+and+the+microRNA+pathway.">Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway.</a> Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).</li><li>Simon, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+miR-1+regulates+a+MEF-2-dependent+retrograde+signal+at+neuromuscular+junctions.">The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions.</a> Cell. 133, 903-915 (2008).</li><li>Consiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+therapy+of+metachromatic+leukodystrophy+by+lentiviral+vectors:+correction+of+neuropathology+and+protection+against+learning+impairments+in+affected+mice.">In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice.</a> Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).</li><li>Jakobsson, J., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+for+use+in+the+central+nervous+system.">Lentiviral vectors for use in the central nervous system.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).</li><li>Berson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic-associated+loss+of+hnRNP-A/B+in+Alzheimer's+disease+impairs+cortical+splicing+and+cognitive+function+in+mice.">Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice.</a> EMBO Molecular Medicine. , (2012).</li><li>Haramati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+as+repressors+of+stress-induced+anxiety:+the+case+of+amygdalar+miR-34.">MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).</li><li>Shaltiel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+microRNA-132+mediates+stress-inducible+cognitive+deficits+through+its+acetylcholinesterase+target.">Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target.</a> Brain Structure &amp; Function. , 10-1007 (2012).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+HIV-+or+FIV-based+lentivector+expression+constructs+&amp;+transduction+of+VSV-G+pseudotyped+viral+particles.">Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs &amp; transduction of VSV-G pseudotyped viral particles.</a> J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+Water+Maze+Experiment.">Morris Water Maze Experiment.</a> J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).</li><li>Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+water+maze+test+for+learning+and+memory+deficits+in+Alzheimer's+disease+model+mice.">Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice.</a> J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).</li><li>Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+approach+for+intracerebroventricular+delivery.">Genetic approach for intracerebroventricular delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Injection stéréotaxique d&#39;un lentivirus est une méthode relativement rapide pour l&#39;évaluation in vivo à la fois pour la régulation des gènes différents et miARN haut ou. La principale alternative est une souris génétiquement modifiée qui est une technique consommant beaucoup plus laborieux et puis injection de lentivirus direct. En outre, la réglementation en place, en injection de lentivirus, survient à un moment spécifique chez la souris adulte et ne comprend pas toute possibilité de d?...

Le rôle des miARN particulier dans le fonctionnement du système nerveux a récemment été contestée par injection lentiviral dans plusieurs études. MiRNAs ont été trouvés à être crucial pour le maintien et remodeler la structure synapse 1, synaptogénèse 2 et le remodelage et la maintenance 3 synapse. Ces études suggèrent fortement que les miARN sont engagés, via des effets régulateurs multileveled à la fois dans la formation et dans le maintien de la sortie principale du système nerveux, les fonctions cognitives. Injection stéréotaxique de particules lentivirus dans des régions spécifiques du cerveau des rongeurs permet la recherche de modifications de la morphologie synapse et l&#39;activité neuronale, et a été utilisée pour établir la signification fonctionnelle des transcriptions surexprimés 4,5. L&#39;infection directe des neurones dans les zones du cerveau bien définis avec des miRNA exprimant lentivirus peut être impliqué dans des études sur le vieillissement, les troubles cérébraux et les maladies neurodégénératives, les études de miRNAs dans le domaine de la régulation comportementale 6-8 sont dans un état ​​beaucoup moins avancé, et l&#39;injection stéréotaxique de miRNA exprimant particules de lentivirus suivies par des tests de comportement peut être utile à de telles fins. Une méthode beaucoup plus laborieux pour induire sur-ou sous-expression implique génétiquement knock-in ou souris knock-out. Systèmes génétiques peuvent en outre permettre un contrôle conditionnel et temporelle de l&#39;expression (par exemple, Cre-Lox, les systèmes Tet), mais ceux-ci difficilement offrir la spécificité spatiale de la procédure d&#39;injection et il ya presque toujours une certaine quantité de perméabilité. En outre, les procédures techniques ne nécessitent pas d&#39;intervention chirurgicale et peuvent être utilisés dans des laboratoires avec relativement bonne reproductibilité, mais ils sont plus lents et exigent beaucoup plus de ressources humaines et financières. En outre, le contrôle temporel de la sous-expression chez les souris injectées sur-ou est beaucoup plus précis par rapport à des souris génétiquement modifiées.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="748">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rodent weigh scale</td>
			<td>Burtons (UK)</td>
			<td>115-455</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24">heating pad</td>
			<td>FIRstTechnology</td>
			<td>DCT-25</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">trimming machine</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51465</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">stereotact</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Scalpel and blades</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>INS500348</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Harland syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7632-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">driller</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51449</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">digital pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>704507</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Water tank and platform</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>60135</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">ketamine </td>
			<td>Vetoquinol(Lure France)</td>
			<td>3055503</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">domitor</td>
			<td>Orion pharma</td>
			<td>107140-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rimadyl</td>
			<td>Pfizer animal health</td>
			<td>24751</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="118">
			<td height="138" rowspan="2">moisture ointment - Synthomycine 5%</td>
			<td rowspan="2">Rekah Pharmaceutical</td>
			<td rowspan="2">195</td>
			<td rowspan="2"> </td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">histoacryl</td>
			<td>Braun</td>
			<td>112101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactic injection of microrna-expressing lentiviruses to the mouse hippocampus ca1 region and assessment of the behavioral outcome

Les microARN (miARN) sont de petites molécules d&#39;ARN simple brin de réglementation à travers 22 nucléotides de long qui peut chaque cible de nombreux transcrits d&#39;ARNm et dim un gène entier voie d&#39;expression par la destruction d&#39;induction et / ou inhibition de la traduction de ces objectifs. Plusieurs miARN jouent un rôle clé dans le maintien de la structure et la fonction neuronale et dans les fonctions cérébrales de haut niveau, et les méthodes sont recherchés pour manipuler leurs niveaux pour explorer ces fonctions. Ici, nous présentons une méthode in vivo directe pour examiner les conséquences cognitives de miARN forcées en excès chez les souris par injection stéréotaxique de particules virales miRNA-encodage. Plus précisément, le protocole actuel consiste à injecter dans la région CA1 hippocampique, qui contribue à la consolidation des mammifères de la mémoire, l&#39;apprentissage, et les réactions au stress, et offre un site d&#39;injection pratique. Les coordonnées sont mesurées selon le bregma de la souris et de la perfusion du virus est contrôlée et maintenue très lent numériquement.Après l&#39;injection, la plaie de la chirurgie est scellé et les animaux récupérer. Les lentivirus codant silencieux des ARNm cibles correspondantes servent à impliquer l&#39;interaction des miARN / cible spécifique responsable de l&#39;effet observé, avec des souris naïves, des souris injectées avec une solution saline et des souris injectées avec des vecteurs de lentivirus «vides» comme témoins. Un mois après l&#39;injection, les animaux sont examinés dans le labyrinthe d&#39;eau de Morris (MWM) pour évaluer leur apprentissage de la navigation et des capacités de mémoire. Le MWM est un réservoir rond rempli d&#39;eau colorée avec une petite plate-forme immergée 1 cm en dessous de la surface de l&#39;eau. Des repères visuels d&#39;équilibre autour de la cuve pour permettre la navigation spatiale (sonore et le champ magnétique de la terre peut aussi aider les animaux dans la navigation). surveillance par caméra vidéo permet de mesurer le chemin de baignade et le temps de trouver et le montant de la plate-forme. La souris est d&#39;abord enseigné que le montage de la plate-forme cachée offre une évasion de la baignade forcée, il est ensuite testé pour l&#39;utilisation de cette évasion et fnfin, la plateforme est enlevé et les tests de sonde examiner si la souris se souvient de son emplacement précédent. Des tests répétés sur plusieurs jours consécutifs soulignent une amélioration des performances des souris testées à des latences plus courtes pour trouver et monter la plate-forme, et les routes plus directes que pour atteindre la plate-forme ou son emplacement. Le défaut de montrer cette amélioration représente une déficience apprentissage et la mémoire et / ou de l&#39;anxiété, qui peut ensuite être testé spécifiquement (par exemple dans le labyrinthe surélevé). Cette approche permet la validation des miARN spécifiques et les transcriptions des cibles dans le développement cognitif étudié et / ou des processus liés au stress.

L&#39;injection de 0,5 lentivirus pi dans la région CA1 de l&#39;hippocampe de souris, avec le débit indiqué dans la section de protocole génère une sphère infecté d&#39;environ 1 mm dans l&#39;axe rostrale-caudale, et environ 0,5 mm de la médiane-latérale et la partie antérieure -postérieur axes (Figure 3). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50170/50170fig1.jpg" /> Figure 1. Point Bregma et un appareil d&...

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Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

Les microARN ont des rôles importants dans la structure et la fonction du cerveau. Nous décrivons ici une méthode pour appliquer miRNA hippocampe surexpression par injection stéréotaxique d&#39;un lentivirus miRNA exprimant ingénierie. Cette approche peut servir comme un moyen relativement rapide pour évaluer l&#39;<em&gt; In vivo</em&gt; Effets des miARN surexprimés dans des régions spécifiques du cerveau.

Injection stéréotaxique de micro-ARN exprimant lentivirus à la souris hippocampe CA1 Région et l&#39;évaluation du résultat comportemental

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

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Research

JoVE Journal

Behavior

22.6K vues.  The Hebrew University of Jerusalem. Les microARN ont des rôles importants dans la structure et la fonction du cerveau. Nous décrivons ici une méthode pour appliquer miRNA hippocampe surexpression par injection stéréotaxique d'un lentivirus miRNA exprimant ingénierie. Cette approche peut servir comme un moyen relativement rapide pour évaluer l' In vivo Effets des miARN surexprimés dans des régions spécifiques du cerveau.

Vidéo: Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station (INBEST)

Due to rapid advances in genetic engineering, small rodents have become the preferred subjects in many disciplines of biomedical research. In studies of chronic CNS disorders, there is an increasing demand for murine models with high validity at the behavioral level. However, multiple pathogenic mechanisms and complex functional deficits often impose challenges to reliably measure and interpret behavior of chronically sick mice. Therefore, the assessment of peripheral pathology and a behavioral profile at several time points using a battery of tests are required. Video-tracking, behavioral spectroscopy, and remote acquisition of physiological measures are emerging technologies that allow for comprehensive, accurate, and unbiased behavioral analysis in a home-base-like setting. This report describes a refined phenotyping protocol, which includes a custom-made monitoring apparatus (Integrated Behavioral Station, INBEST) that focuses on prolonged measurements of basic functional outputs, such as spontaneous activity, food/water intake and motivated behavior in a relatively stress-free environment. Technical and conceptual improvements in INBEST design may further promote reproducibility and standardization of behavioral studies.

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station INBEST

Prolonged and comprehensive monitoring of mice in a home-cage environment provides a deeper understanding of aberrant behavior in murine models of brain diseases. This paper describes the Integrated Behavioral Station (INBEST) as the key component of contemporary behavioral analysis.

Behavioral phénotypage de modèles de maladies murin avec la station intégrée comportementale (INBEST)

Due to rapid advances in genetic engineering, small rodents have become the preferred subjects in many disciplines of biomedical research. In studies of ...

Recherche

Sciences du comportement

Behavioral Assessment of the Aging Mouse Vestibular System

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of studies show changes in balance phenotype with age in rodents, very few isolate the vestibular contribution to balance under either normal conditions or during senescence. We use two standard behavioral tests to characterize the balance performance of mice at defined age points over the lifespan: the rotarod test and the inclined balance beam test. Importantly though, a custom built rotator is also used to stimulate the vestibular system of mice (without inducing overt signs of motion sickness). These two tests have been used to show that changes in vestibular mediated-balance performance are present over the murine lifespan. Preliminary results show that both the rotarod test and the modified balance beam test can be used to identify changes in balance performance during aging as an alternative to more difficult and invasive techniques such as vestibulo-ocular (VOR) measurements.

Motor control and balance performance are known to deteriorate with age. This paper presents a number of standard noninvasive behavioral tests with the addition of a simple rotary stimulus to challenge the vestibular system and show changes in balance performance in a murine model of aging.

Évaluation du comportement du système vestibulaire vieillissement de souris

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of ...

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific genes in encoding experience is one of the main objectives of molecular neuroscience. Furthermore, the functional association of defined genes with specific behaviors has implications for understanding the basis of neuropsychiatric disorders. Induction of robust transcription programs has been observed in the brains of mice following various behavioral manipulations. While some genetic elements are utilized recurrently following different behavioral manipulations and in different brain nuclei, transcriptional programs are overall unique to the inducing stimuli and the structure in which they are studied1,2.
In this publication, a protocol is described for robust and comprehensive transcriptional profiling from brain nuclei of mice in response to behavioral manipulation. The protocol is demonstrated in the context of analysis of gene expression dynamics in the nucleus accumbens following acute cocaine experience. Subsequent to a defined in vivo experience, the target neural tissue is dissected; followed by RNA purification, reverse transcription and utilization of microfluidic arrays for comprehensive qPCR analysis of multiple target genes. This protocol is geared towards comprehensive analysis (addressing 50-500 genes) of limiting quantities of starting material, such as small brain samples or even single cells.
The protocol is most advantageous for parallel analysis of multiple samples (e.g. single cells, dynamic analysis following pharmaceutical, viral or behavioral perturbations). However, the protocol could also serve for the characterization and quality assurance of samples prior to whole-genome studies by microarrays or RNAseq, as well as validation of data obtained from whole-genome studies.

This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.

Analyse détaillée de la dynamique de transcription à partir d&#39;échantillons de cerveau après l&#39;expérience comportementale

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the test mouse is placed in a standardized apparatus and relevant behaviors are assessed in three different sessions (called session I, II, and III).
The apparatus has three compartments (see Figure 1), the left and right compartments contain an inverted cup which can house a mouse (called &#34;stimulus mouse&#34;).
In session I, the test mouse is placed in the cage and its mobility is characterized by the number of transitions made between compartments. In session II, a stimulus mouse is placed under one of the inverted cups and the sociability of the test mouse is quantified by the amounts of time it spends near the cup containing the enclosed stimulus mouse vs. the empty inverted cup. In session III, the inverted cups are removed and both mice interact freely. The sociability of the test mouse in session III is quantified by the number of social approaches it makes toward the stimulus mouse and by the number of times it avoids a social approach by the stimulus mouse.
The automated evaluation of the movie detects the nose of the test mouse, which allows the determination of all described sociability measures in session I and II (in session III, approaches are identified automatically but classified manually). To find the nose, the image of an empty cage is digitally subtracted from each frame of the movie and the resulting image is binarized to identify the mouse pixels. The mouse tail is automatically removed and the two most distant points of the remaining mouse are determined; these are close to nose and base of tail. By analyzing the motion of the mouse and using continuity arguments, the nose is identified.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52508/52508fig1.jpg" /> 
Figure 1. Assessment of Sociability During 3 sessions. Session I (top): Acclimation of test mouse to the cage. Session II (middle): Test mouse moving freely in the cage while the stimulus mouse is enclosed in an inverted cup. Session III (bottom): Both test mouse and stimulus mouse are allowed to move freely and interact with each other.

This protocol describes a method to quantify mouse sociability. Mice are videotaped as they move and interact in a special cage. Movie processing allows for the automated quantification of sociability with excellent accuracy and reliability.

Évaluation expérimentale de la souris Sociabilité L&#39;utilisation d&#39;un traitement automatisé Approche d&#39;image

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or knockdown gene expression in a relatively focused region without significant damage to the brain tissue. After recovery, the injected mouse can be tested on various behavioral tasks such as the Open Field Test (OFT) and the Forced Swim Test (FST). The OFT is designed to assess locomotion and the anxious phenotype in mice by measuring the amount of time that a mouse spends in the center of a novel open field. A more anxious mouse will spend significantly less time in the center of the novel field compared to controls. The FST assesses the anti-depressive phenotype by quantifying the amount of time that mice spend immobile when placed into a bucket of water. A mouse with an anti-depressive phenotype will spend significantly less time immobile compared to control animals. The goal of this protocol is to use the stereotactic injection of a lentivirus in conjunction with behavioral tests to assess how genetic factors modulate animal behaviors.

Stereotactic injection of lentiviruses expressing cDNAs or shRNAs can modulate gene expression in specific brain areas of mice. Here, we present a protocol to combine stereotactic injections with behavioral tasks, such as the Open Field Test (OFT) and the Forced Swim Test (FST).

Application Technique d&#39;injection stéréotaxique pour étudier les effets génétiques sur les comportements des animaux

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been maintaining the behavior. There is close correspondence between fear and human anxiety, and therefore studies of extinction learning might provide insight into the biological nature of anxiety-related disorders such as post-traumatic stress disorder, and they might help to develop strategies to treat them. Preclinical research aims to aid extinction learning and to induce targeted plasticity in extinction circuits to consolidate the newly formed memory. Vagus nerve stimulation (VNS) is a powerful approach that provides tight temporal and circuit-specific release of neurotransmitters, resulting in modulation of neuronal networks engaged in an ongoing task. VNS enhances memory consolidation in both rats and humans, and pairing VNS with exposure to conditioned cues enhances the consolidation of extinction learning in rats. Here, we provide a detailed protocol for the preparation of custom-made parts and the surgical procedures required for VNS in rats. Using this protocol we show how VNS can facilitate the extinction of conditioned fear responses in an auditory fear conditioning task. In addition, we provide evidence that VNS modulates synaptic plasticity in the pathway between the infralimbic (IL) medial prefrontal cortex and the basolateral complex of the amygdala (BLA), which is involved in the expression and modulation of extinction memory.

Vagus nerve stimulation (VNS) has emerged as a tool to induce targeted synaptic plasticity in the forebrain to modify a range of behaviors. This protocol describes how to implement VNS to facilitate the consolidation of fear extinction memory.

Stimulation du nerf vague comme un outil pour induire la plasticité dans les voies pertinentes pour l&#39;extinction d&#39;apprentissage

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

Behavioral Assessment of Hearing in 2 to 4 Year-old Children: A Two-interval, Observer-based Procedure Using Conditioned Play-based Responses

Collecting reliable behavioral data from toddlers and preschoolers is challenging. As a result, there are significant gaps in our understanding of human auditory development for these age groups. This paper describes an observer-based procedure for measuring hearing sensitivity with a two-interval, two-alternative forced-choice paradigm. Young children are trained to perform a play-based, motor response (e.g., putting a block in a bucket) whenever they hear a target signal. An experimenter observes the child&#39;s behavior and makes a judgment about whether the signal was presented during the first or second observation interval; the experimenter is blinded to the true signal interval, so this judgment is based solely on the child&#39;s behavior. These procedures were used to test 2 to 4 year-olds (n = 33) with no known hearing problems. The signal was a 1,000 Hz warble tone presented in quiet, and the signal level was adjusted to estimate a threshold corresponding to 71%-correct detection. A valid threshold was obtained for 82% of children. These results indicate that the two-interval procedure is both feasible and reliable for use with toddlers and preschoolers. The two-interval, observer-based procedure described in this paper is a powerful tool for evaluating hearing in young children because it guards against response bias on the part of the experimenter.

This paper describes a procedure for measuring hearing sensitivity in 2 to 4 year-old children. Children are trained to perform play-based responses when they hear a target signal. Thresholds are then estimated in a two-interval, two-alternative forced-choice paradigm, based on observations of the child&#39;s behaviors.

Évaluation du comportement d&#39;audience dans 2 à 4 ans, les enfants: Une procédure, basée à Observer deux intervalle utilisant les réponses en fonction Play-Cond

Collecting reliable behavioral data from toddlers and preschoolers is challenging. As a result, there are significant gaps in our understanding of human ...

A Behavioral Test Battery for the Repeated Assessment of Motor Skills, Mood, and Cognition in Mice

Pharmacological and toxicological studies in neurodegeneration require comprehensive behavioral analysis in mice because motor dysfunctions and dysfunctions in mood and cognition are common and often shared symptoms in neurodegenerative diseases. Shown here is a behavioral test battery for motor, mood, and cognition, which can be repeatedly tested in a longitudinal study. This battery assesses the overall behavioral phenotype in mice by examining each domain of behavior with at least two independent well-accepted tests (i.e., open-field test and rotarod test for motor function, social interaction test, elevated plus maze test, and forced swim test for emotional function, and Morris water maze test and novel object recognition test for cognitive function). Therefore, this sensitive and comprehensive test battery is a powerful tool for the study of behavioral alternation in neurodegeneration.

A comprehensive behavioral test battery of motor skills, mood&#8212;including social interaction, depression, and anxiety&#8212;and cognition is designed for the repeated assessment of neurodegeneration-related behavioral changes in mice.

Une batterie de tests comportementaux pour l’évaluation répétée de la motricité, l’humeur et Cognition chez les souris

Pharmacological and toxicological studies in neurodegeneration require comprehensive behavioral analysis in mice because motor dysfunctions and ...

Utilizing a Reconfigurable Maze System to Enhance the Reproducibility of Spatial Navigation Tests in Rodents

Several maze shapes are used to test spatial navigation performance and behavioral phenotypes. Traditionally, each experiment requires a unique maze shape, thus requiring several separate mazes in different configurations. The maze geometry cannot be reconfigured in a single environment to accommodate scalability and reproducibility. The reconfigurable maze is a unique approach to address the limitations, allowing quick and flexible configurations of maze pathways in a repeatable manner. It consists of interlocking pathways and includes feeders, treadmills, movable walls, and shut-off sensors. The current protocol describes how the reconfigurable maze can replicate existing mazes, including the T-shaped, plus-shaped, W-shaped, and figure-eight mazes. Initially, the T-shaped maze was constructed inside a single experimental room, followed by modifications. The rapid and scalable protocol outlined herein demonstrates the flexibility of the reconfigurable maze, achieved through the addition of components and behavioral training phases in a stepwise manner. The reconfigurable maze systematically and precisely assesses the performance of multiple aspects of spatial navigation behavior.

The present protocol describes a reconfigurable maze, a unique system for testing spatial navigation and behavioral phenotypes in rodents. The adaptability of this maze system enables the execution of various experiments in a single physical environment. The ease of structural rearrangement generates reliable and reproducible experimental results.

Utilisation d’un système de labyrinthe reconfigurable pour améliorer la reproductibilité des tests de navigation spatiale chez les rongeurs

Several maze shapes are used to test spatial navigation performance and behavioral phenotypes. Traditionally, each experiment requires a unique maze ...

Validation d’un modèle murin du syndrome d’Angelman à l’aide de tests comportementaux

Behavioral Characterization of an Angelman Syndrome Mouse Model

This manuscript describes a battery of behavioral tests available to characterize Angelman syndrome (AS)-like phenotypes in an established murine model of AS. We use the rotarod learning paradigm, detailed gait analysis, and nest building test to detect and characterize animal motor impairments. We test animal emotionality in the open field and elevated plus maze tests, as well as the affect in the tail suspension test. When AS mice are tested in the open field test, the results should be interpreted with care, since motor dysfunctions influence mouse behavior in the maze and alter activity scores.
The reproducibility and effectiveness of the presented behavioral tests has already been validated in several independent Uba3a mouse lines with different knockout variants, establishing this set of tests as an excellent validation tool in AS research. Models with the relevant construct and face validity will warrant further investigations to elucidate the pathophysiology of the disease and grant the development of causal treatments.

Pleins feux sur l’auteur : Une batterie de tests comportementaux hautement reproductibles pour valider un modèle murin du syndrome d’Angelman 

This manuscript presents a set of highly reproducible behavioral tests to validate an Angelman syndrome mouse model.

Caractérisation comportementale d’un modèle murin du syndrome d’Angelman

This manuscript describes a battery of behavioral tests available to characterize Angelman syndrome (AS)-like phenotypes in an established murine model of ...