אנו מודים לעמיתינו בחוג לביולוגיה, אוניברסיטת פריבורג לדיונים פוריים. אנו מודים למרכז מאגר בלומינגטון למתן מניות לעוף. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי הקרן הלאומית למדע שוויצרי (PP00P3_123339) וקרן Velux לSGS

1. גידול הזחל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור לטוס זנים או צלבים גנטיים בתרבות המונים של 25 מעלות צלזיוס במדיום קמח תירס תחת אור של 12 שעות מחזור של 12 שעות חשכה בזבוב חממה מצויד באור ושעון עצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל שמרי תומכת במים ליצירת עיסה נוזלית (10 גרם של שמרי תומך מדוללים עם 3-4 מ&quot;ל מזוקק H 2 O). הוסף טיפה קטנה למזון קמח התירס ולכסות את הבקבוקונים. בואו יבש לשעה אחת לפחות, כדי למנוע זבובים בוגרים דבק דבק השמרים. לשים טיפה קטנה של שמרים מדוללים במים על פני השטח של המזון יכול לשפר את ההטלה. לחלופין, ניתן להשתמש בייקר שמרים להדביק, 20% חומצה אצטית (AcOH) (סיגמה אולדריץ, שוויץ A6283-100 מ&quot;ל). לשם כך, טובל את הקצה של Q-טיפ על הפתרון והמרווח על פני שטח מזון קמח התירס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים זבובים בוגרים (לפחות ארבעה ימים, אך לא יותר מעשרה ימים) בבקבוקוני מזון קמח תירס. שים מספיק מבוגרים לכל בקבוקון על מנת לקבל זחלים מספיק כדי לחזור על ההעדפהלבדוק כמה פעמים ולאפשר השוואה סטטיסטית. לצלבים גנטיים, אנו משתמשים בדרך כלל למינימום של 20 נקבות וזכרים 5-10 לכל בקבוקון, אבל כמה קווים דורשים יותר נקבות כדי להשיג צאצאי הזחל מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר למבוגרים להטיל ביצים ל12 שעות ולהעבירם לבקבוקונים חדשים. ניתן להעביר מבוגרים בבוקר ובערב. אנחנו בדרך כלל להעביר את המבוגרים במשך שבעה עד עשרה ימים, ואם נדרשו לקחת מבוגרים חדשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את אוספי הביצים שנלקחו בכל שעה 12 בחממה ולתת לגדול זחלים של 25 מעלות צלזיוס, חושך מחזור של 12 שעות אור 12 שעות ו 60% לחות. לבדיקת רכיבי היממה של זחלים חזותיים התנהגות מעבר לחשכה מתמדת (DD) 48 שעות לאחר איסוף ביצים (מקביל לשני מחזורי האור כהים). לשם כך, השתמש בחממה נפרדת בלי אור אבל לשמור על כל תנאים אחרים, כגון טמפרטורה ולחות זהה. הקפד להעביר את הבקבוקונים לחממת DD ממש לפני המעבר לשלב הכהה. לפני שעבר את הבקבוקונים לanothאה חממה לשים בקבוקונים בקופסא קרטון או לעטוף את הבקבוקונים עם רדיד אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור במהלך ההעברה (אריזה בקופסא קרטון או עטיפה שצריך לעשות בזמן &quot;כיבוי האורות בשלב&quot; לפני המשמרת בין חממות). למנוע את בעלי חיים מכל חשיפה לאור לאחר נקודה זו ועד תחילת ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 ימים (84-108 שעות מהטלה) לאסוף מוקדם L3 (זחלי האכלה) בנקודות הזמן שנבדקה (ראה 4. אור העדפת בדיקה, נקודה. 4.4.). </li></ol> 2. התקנת מבחן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניסויים בחדר חשוך עם טמפרטורה קבועה ותנאי לחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על שני רביעים של צלחת פטרי בחושך, לכסות את המכסה עם סרט שחור ורדיד אלומיניום. כדי לעשות זאת, סמן את מרכז היקף המכסה. גם לסמן ארבע נקודות בגבול של המכסה עם 90 מעלות של הפרדה ביניהם. כדי לעשות את זה קל יותר, לצייר ריבוע 20 ס&quot;מ מחולק לארבעה רבעים באורך 10 ס&quot;מ עלגיליון נייר או בעזרתו של מחשב. לחתוך 10 ס&quot;מ ריבועים של נייר אלומיניום וסרט שחור (איור 1 א). לכסות שני רביעים ההפך על ידי הדבקה של רדיד אלומיניום רבוע, כשכבה ראשונה וסרט שחור מכסה אותו, יש להיזהר גם כדי לכסות את הגבול של המכסה. בעבר שתי צורות מעט שונות של מבחני זה היו בשימוש. אנחנו כאן שימוש assay &quot;רבע הצלחת&quot;, שבו צלחת פטרי מחולקת לארבעה רבעים שווים 10. ב assay האלטרנטיבי &quot;חצי הצלחת&quot; צלחת פטרי מחולקת חצי (חצי נחשף לאור, בחשכה) 1,7,8. עד היום לא נמצא הבדלים משמעותיים בין שני מבחני כבר פורסם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבק גיליון רבע כגון זה המשמש לסימון את המכסים ממש מתחת למקור האור על השולחן. סמן היקף של צלחת פטרי התרכזה בצומת הרביעים. השתמש בסימנים כהתייחסות למקום את צלחת המבחן תמיד באותה התנוחה מתחת למקור האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקןמנורה, או הנורה פשוט אור לבן (פיליפס, Softtone 5W) או מנורת LED (מנורת LED, 80012 הלבנה, Osram) מעל צלחת פטרי עם העזרה של דוכן תמיכת ברזל (פישר סיינטיפיק, S47808). התאם את הגובה באופן שכל מבחן הצלחת מוארת homogenously. אנו ממליצים בחום על השימוש בנורות LED שכן הם פולטים אורכי גל מסוימים יותר מנורות רגילות. יתר על כן נוריות פולטות פחות חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את עוצמת אור בעזרת פוטומטר (סביבת מד PCE EM882). כדי להשיג את עוצמת האור הנדרשת של 350-760 לוקס, להזיז את המנורה כלפי מעלה או מטה בהתאם לצורך. חיבור המנורה לאספקת חשמל מתכווננת נותן יותר גמישות לשנות את העוצמות מבלי להזיז את המנורה (איור 1). </li></ol> 3. הכנת צלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות 200 מ&quot;ל של 2.5% אגר (סיגמא אולדריץ, שוויץ A5093-500G) עם מים מזוקקים פעמיים (Millipore). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צלחות פטרי על שולחן (90 מ&quot;מ קוטר;גריינר ביו אחד GmbH, 4550 Kremsmeinster, אוסטריה) בשורות כדי לאפשר לשפוך חם agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים את agarose במיקרוגל עד שהפתרון הוא שקוף לחלוטין ונוזלים. ודא שתמיסה נוזלית אינו מכילה בועות. זהירות: תחבורה בזהירות לשולחן מאז הפתרון יכול להיות חם מאוד! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים חם agarose לתוך צלחות פטרי עד שכל המשטח מכוסה homogenously עם שכבה דקה של הפתרון, על שתיים או שלושה מילימטרים הם מספיק. להיות מהיר כדי למנוע agarose חיזוק לפני הציפוי את כל הצלחות. בואו הצלחות להתקרר. אחסן את הצלחות בטמפרטורת חדר ולהשתמש בם רק באותו היום של הכנה. </li></ol> 4. מבחן זיקה לאור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבוד בתנאי אור אדומים בחדר הניסוי כדי למנוע השפעת האור לפני המבחן מאז תסיסנית אינו מסוגל לחוש אורכי גל של אור אדום. השתמש בנורה אדומה (פיליפס, PFE712E * 8) עלתה במנורה כדי להאיר לאהוא מקום העבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על טמפרטורה בכל הניסויים של 25 ° C. טמפרטורת חדר בקרה באמצעות מכשיר חימום או קירור במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח קצת אוכל מהבקבוקונים שגדלו לשני מחזורי יום תחת חשכה מתמדת (מסעיף 1). מאז זחלים בדרך כלל חופרים על פני השטח של המזון, לקחת את השכבה העליונה (כ -5 מ&quot;מ עמוק) עם עזרה של מרית (פישר סיינטיפיק, 14-373-25A). מורחים את האוכל בצד החיצוני של המכסה צלחת פטרי, להוסיף קצת מים ומערבבים בעדינות בעזרת המרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף האכלת זחלי L3 ממזון. כהעדפת אור תיבחן, בחירה רק בתחילת / האכלת זחלי L3 הוא קריטי מאז Phototaxis השלילי מובטח. מאוחר / נדודי זחלי L3 או זחל גדול זוחלים על האוכל כנראה כבר עבר photobehavior שלהם. יכולים להיות מוכרים זחלי L3 האכלה (phototactic השלילי) כי spiracles הקדמי שלהם הם פתוח ובלט החוצה בצורה דמוית אצבע. Spiracle האחורייש שלושה פתחים של כל אחד, וארבע קבוצות של שערות מסועפות גדולות. בלוטות הרוק להאריך למגזר השני 11 הבטן. Staging זחל תחת מיקרוסקופ הוא נוח ואילו אמור לשמש לא אור לבן. מנורת אור אדומה היא הכרחית כדי להאיר את הזחלים אם זמני תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי לפני נדרשים ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף זחלים בקצרה במים ברז ולאסוף זחלים שלישי instar-האכלה המוקדמת (עדיין באור אדום). לפני העברת הזחלים לצלחת הבדיקה, לקחת את הזחלים עם מכחול רטוב ולספוג עודפי מים בזהירות במגבת נייר או נייר סינון. לא לייבש יתר על המידה זחלים מדי שכן הוא עלול לפגוע בבעלי החיים ולהשפיע על התנהגותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות המכחול הרטוב להעביר את הזחלים בזהירות לצלחות. הנח קבוצה של כ 30 זחלים במרכז הצלחת. מכסה את הצלחת עם המכסה כבר מוכן עם הרבעים והניח את הצלחת מתחת למקור האור מוכן לניסוי (ראה שניותtion 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדלק את מנורת האור הלבנה ולהתחיל את הטיימר. תן את הזחל לנוע בחופשיות על הצלחת למשך 5 דקות, ולאחר מכן להסיר במהירות את המכסה ולספור את מספר הזחלים בחושך ובאור הרביעים. סימון המיקום של כל זחל עם סמן יכול להקל על הספירה. לחלופין לקחת תמונה של הצלחת ולספור בדיעבד. זחלים מראים העדפה ברורה אור, כמו זחלים זוחלים על הקירות או מתחפרים לתוך אגר צריכים להיחשב כהעדפה ניטראלית ופשוט להיכלל במספר הכולל של זחלים כאשר מדד העדפת האור מחושב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הספירה, לבטל את הצלחת עם זחלים ולהחליף עם צלחת בדיקה חדשה לניסוי הבא. לאסוף צלחות בשימוש בשקית פלסטיק חיטוי לטיפול וסילוק מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שבצעת מספר מספיק של ניסויים ניתן נבדקו גנוטיפ חדש. 10-15 ניסויים לגנוטיפ מספיקים לניתוח. </li></ol> 5. ניתוח נתוניםשל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנוחיותך להעביר את הנתונים לגיליון נתונים כמו אקסל (Microsoft) או מקור (מעבדה מקור) במחשב לניתוח סטטיסטי נוסף. סדר בעמודה אחת את מספר בעלי החיים בחשכה, בעמודה שנייה את מספר בעלי החיים ברביעי אור ובשלישי הכולל של בעלי חיים בצלחת (כולל זחלים &quot;ניטראלי&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מדד ההעדפה (PREF) לחושך עבור כל ניסוי תוך שימוש בנוסחה הבאה: PREF (חושך) = (כמות זחלים בחושך - מספר הזחלים באור) / מספר כולל של זחלים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשוות סטטיסטי קבוצה של נתונים עם ניתוח מתאים לקבוצות. כאן, אנו משתמשים במבחן Wilcoxon להשוות סטטיסטי בין שתי קבוצות. מבחן ANOVA מרובה עם ההשוואה של טיוקי בדיעבד ניתן לעשות בדיקה, אם הנחת התפלגות נורמלית מתקיימת בהשוואת קבוצת סעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הגרפים שמראים באופן ברור השוואות בין קווים ונקודות זמן לאורך מחזור היום. Wתוכנת מקור שימוש בדואר (מעבדת מקור) כדי לבדוק את המובהקות סטטיסטיות וליצור גרפים מתאימים, אבל בכל תוכנה סטטיסטית אחרת יכולה להיות מועילה. </li></ol>

<ol>
	<li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development.">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> J. Neurogenet. 10, 119-135 (1995).</li><li>Sprecher, S. G., Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+and+larval+photoreceptors+use+different+mechanisms+to+specify+the+same+Rhodopsin+fates.">Adult and larval photoreceptors use different mechanisms to specify the same Rhodopsin fates.</a> Genes Dev. 21, 2182-2195 (2007).</li><li>Sprecher, S. G., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switch+of+rhodopsin+expression+in+terminally+differentiated+Drosophila+sensory+neurons.">Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons.</a> Nature. 454, 533-537 (2008).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li><li>Diaz, N. N., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptors:+unconventional+ways+of+seeing.">Photoreceptors: unconventional ways of seeing.</a> Curr. Biol. 21, R25-R27 (2011).</li><li>Emery, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+CRY+is+a+deep+brain+circadian+photoreceptor.">Drosophila CRY is a deep brain circadian photoreceptor.</a> Neuron. 26, 493-504 (2000).</li><li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response.">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293-300 (2005).</li><li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment.">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> J. Neurosci. 31, 6527-6534 (2011).</li><li>Gong, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Pairs+of+Neurons+in+the+Central+Brain+Control+Drosophila+Innate+Light+Preference.">Two Pairs of Neurons in the Central Brain Control Drosophila Innate Light Preference.</a> Science. 330, 499-502 (2010).</li><li>Lilly, M., Carlson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=smellblind:+a+gene+required+for+Drosophila+olfaction.">smellblind: a gene required for Drosophila olfaction.</a> Genetics. 124, 293-302 (1990).</li><li>Bodenstein, D., Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postembryonic+development+of+Drosophila.">The postembryonic development of Drosophila.</a> Biology of Drosophila. , 275-367 (1950).</li><li>Pittendrigh, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+systems:+Entrainment.">Circadian systems: Entrainment.</a> Biological Rhythms. 4 Handbook of Behavioral Neurobiology, 95-124 (1981).</li><li>Collins, B., Kane, E. A., Reeves, D. C., Akabas, M. H., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balance+of+Activity+between+LN(v)s+and+Glutamatergic+Dorsal+Clock+Neurons+Promotes+Robust+Circadian+Rhythms+in+Drosophila.">Balance of Activity between LN(v)s and Glutamatergic Dorsal Clock Neurons Promotes Robust Circadian Rhythms in Drosophila.</a> Neuron. 74, 706-718 (2012).</li><li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+light:+photobehavior+in+fruit+fly+larvae.">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends Neurosci. 35, 104-110 (2012).</li><li>von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+visual+classical+conditioning+in+Drosophila+larvae.">Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae.</a> Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בדיקת העדפת האור תאר מנצלת photobehavior מולדת הזחל. Assay קל להקים, מאפשר חזרות רבות בעלות נמוכה ומספק מידע רב ערך על חישת אור ועיבוד. פרדיגמה הניסויית מאפשרת כימות מהירה יחסית של כמה אנשים מעדיפים אור או חושך. העדפה כזו יכולה להיות מוצגת כאחוזים גולמיים או לחלופין כמדד העדפות (PREF). PREF מתבטא בהבדל של בעלי חיים שאור מועדף ובעלי החיים שחושך מועדף מחולק בסכום הכולל של בעלי חיים. נקודה מכרעת למבחן העדפת האור היא משך הזמן של הניסויים. הנה, בדקנו חמש דקות, אולם זה אפשרי כי גנוטיפים אחרים או תחת הבדלי איכויות אור אחרים הם לא כל כך ברורים באמצעות משך ניסוי זה. לגירויים מסוימים (התעורר אצלם) יש לנו הבנו שניסויים ארוכים יותר, עם 20 דקות של משך זמן, לספק preferen נקיCES עם שונות קטנות יותר. בדיקת המשכים ניסיוניים שונים יכולה להיות הוגנת במיוחד בעת שימוש בו גנוטיפים תנועה או רגישות השפעה והזחלים דורשים זמן רב יותר כדי לחקור את צלחת הבדיקה. במקרה זה, הזמן צריך להיות מותאם באופן שווה לבקרות וגנוטיפים ניסיוניים. Assay גם מאפשר גילוי הבדלים בין נקודות זמן מאותו יום מחזור היממה כפי שמוצג כאן ובדוחות קודמים 7,13. תגובות אור לגירויי photic מוסדרים בחום על ידי השעון הביולוגי, ככל הנראה על ידי ויסות הרגישות של קולטני אור. תגובות זחל לאור ירידה בשתי שעות הראשונות של היום, ולהיות יציב בעשר שעות הנותרות של שלב האור. כדי להשוות בין קבוצות שונות במהלך היום, זה הוא חיוני כדי להפוך את הניסויים בנקודות זמן מקבילים או זהות של מחזור היממה לכל קבוצה. בנוסף, חשוב גם להימנע משינויים שיכול להשפיע על התנהגות הזחל, כתנודות תרמיות או תשומות אור קודמות לניסויים, אם עובדים בחושך. לשם כך, חשוב לגדל את הזחלים באותה הטמפרטורה והלחות מאשר אלה המשמשים לניסויים ולהיות זהיר על ידי שמירה על בעלי חיים בחושך בעת צורך. לפחות שלושה מסלולים שתוארו לאחרונה לתרום להדליק חישה בדרוזופילה זחל 5,14: 1) מערכת rhodopsin תלויה בתיווכו של העין הזחל, 2) את הנוירונים multidendritic הכיתה הרביעית, התפשט לאורך גוף הזחל ו3) חיישני אור כחולים שעון פנימי להביע לבכות. תרומה של מסלולי חישת אור שונים להתנהגות חזותית יכולה להיות מטופל על ידי בדיקת ההעדפה שתוארה כאן. מקורות שונים של תאורה עם עוצמות ואורכי גל מסוימים יכולים לשמש כדי לבדוק את איכויות אור שונות. אפשרות זו יכולה להיות תלויה בפרטים על הרגישות של אלמנטים בודדים של מערכת חישת האורד איך תשומות אור כזה מעובדות. לניסויים מפורט יותר בנוגע לגירוי אור, ניתן לשנות בקלות את assay כדי לבדוק את איכויות אור שונות. גדלה או קטן של עוצמות אור, כמו גם בדיקת אורכי גל אור שונה אפשרי על ידי שימוש במנורות LED תוצרת עצמית עם אורכי גל מסוימים (אפשרויות רבות זמינות בשוק). שליטה של ​​מנורות כאלה עם ספקי כוח מציעה מגוון טוב של עוצמות. אפשרויות אלה עבור מניפולציה איכויות אור מספקות מגוון רחב של המשתנים שנבדקו במבחן העדפת האור. יתר על כן, זחלים תסיסנית מסוגלים לשייך את העונש או תגמולים גם עם אור או חושך, שינוי photobehavior 15 ילידים. לשם כך, עיבוד של הפרוטוקול המתואר הועסק מראה את הרבגוניות של assay. לסיכום, במבחן העדפת אור בחושך הוא כלי בעל ערך רב תורם להבנה טובה יותר של מהירוהתנהגויות היממה נגזרות מגירויים קלים ובו אלמנטים של המערכת רגישה לאור והשעון הביולוגי של זחל תסיסנית מעורבות בתהליך זה.

כאן אנו מתארים assay התנהגותית המבוסס על העדפת הזחל לכהה (או בהיר). זחלים להגיב עם תגובת photonegative חזקה וסטריאוטיפית בשלבי ליקוט (L1 לתחילת L3) 1. Assay נועד להעריך את התנהגות photophobic של הזחל ומשווה את ההעדפה בהירה או כהה של קבוצה של זחלים לנוע בחופשיות בצלחת פטרי מצופה באגר. assay התנהגותי זה מספק מידע על רגישות, אינטגרציה וזמן הפלסטיות של מערכת הראייה לא רק, זה עוד יותר מספק רמזים על איך רגישות לאור והתהליך שלה נשלט על ידי מערכת היממה. עין הזחל דרוזופילה (Bowlig איברים מכונים גם: BO), היא האיבר העיקרי לתפיסת אור. כל עין מורכבת מקולטנית אור 12 (PR), שמונה הפורטוריקנים להביע rhodopsin6 הירוק רגיש (RH6) וארבעה הפורטוריקנים להביע rhodopsin5 הכחול הרגישים (rh5) 2,3. בנוסף לPRS, alsנוירונים o Class IV multidendritic, אשר מכסים את קיר גוף הזחל, זוהו להגיב לעוצמות אור רעילים 4,5. כמו כן, ידוע כי נוירונים קוצבים לב הנמצאים במוח הזחל המרכזי להביע רגיש חלבון Cryptochrome האור (Cry) שפועל כחיישן אור כחול שעון פנימי בתוך המוח 6,7. מסקרן photophobicity של בעלי חיים מסוג בר מציג מרכיב ביולוגי בנקודות זמן שונות במהלך היום ובלילה בעת בדיקה עם assay זה. תגובות לאור של זחל L3 ליקוט הראו photophobicity החזק עם שחר וphotophobicity נמוך יותר בשעה בין הערביים, כאשר נבדקו על העדפת אור בחושך 7. מעניין רק Rh5-הפורטוריקנים נדרשים להימנעות אור, ואילו RH6-הפורטוריקנים הם מיותר. שניהם, Rh5-הפורטוריקנים וRH6-הפורטוריקנים מעורבים באיפוס השעון המולקולרי על ידי אור 8. מסלול Cry חייב להיות מתואם עם מסלולי אור חישה-האחרים לתזמר פלט התנהגותי מתאים בבמהלך היום. אצטילכולין בהפורטוריקנים ממלא תפקיד חיוני בהתנהגות הימנעות אור, כמו גם מחדירה של השעון המולקולרי. חסימה עצבית אצטילכולין מהפורטוריקנים לנוירונים קוצב היממה מפחיתה את תגובת photophobic בassay העדפת אור החושך 8. העסקתו assay, שני זוגות סימטריים של נוירונים שזוהו לאחרונה כדי לעבור את העדפת האור של הזחל instar השלישי של דרוזופילה 9. שני זוגות אלו של נוירונים ניתן לתפקד בשלבי זחל מאוחרים, כאשר בעלי חיים להשאיר את האוכל למצוא אתר מתאים pupariation ככל הנראה. עם זאת, השאלה של איך את מסלולי ויזואליים אינטראקציה ולשלוט בהתנהגות חזותית הזחל באופן היממה נותרה במידה רבה ללא מענה. Assay העדפת האור מאפשר השוואות בין נקודות זמן היממה, לטוס קווים ומדינת היממה תחת איכויות אור שונות. Assay הוא קלות מוכן ולא יקר וכבר שימושי בעבר אניn כמה מעבדות לתאר וללמוד את ההתנהגות נגזרת אור בזחל.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agar</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A5093-500G</td>
 <td>2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes</td>
 <td>Greiner Bio-One GmbH</td>
 <td>633180</td>
 <td>90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LEDs Lamp</td>
 <td>OSARAM </td>
 <td>80012 White</td>
 <td>LED lamp, 80012 White</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Environment Meter</td>
 <td>PCE</td>
 <td>PCE EM882</td>
 <td>Lux, Temp, RH%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thermostatic cabinet</td>
 <td>Aqua Lytic (Liebherr)</td>
 <td>ET636-6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Light timer</td>
 <td>Timer T</td>
 <td>6185.104</td>
 <td>230V/50HZ (check specifications for your country)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Universal thermostat</td>
 <td>Conrad</td>
 <td>UT200</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Humidifier</td>
 <td>Boneco</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Balck tape</td>
 <td>Tesa</td>
 <td></td>
 <td>5 cm </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glue</td>
 <td>Uhu</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>lncubator lamp</td>
 <td>Phillips</td>
 <td>Softtone</td>
 <td>5W</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Timer clock</td>
 <td>Ziliss</td>
 <td></td>
 <td>Ziliss, Switzerland</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Excel Software</td>
 <td>Microsoft</td>
 <td></td>
 <td>Excel</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Origin Software 8.5</td>
 <td>OriginLab</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Backer Yeast</td>
 <td>Migros Switzerland</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iron support stand 17X28CM</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>S47808</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic acid</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>A6283-100ML</td>
 <td>20% acetic acid dilluted in H2O</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Red light lamp</td>
 <td>Phillips</td>
 <td>PFE712E*8C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spatula </td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>14-373-25A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Power supply</td>
 <td>EA</td>
 <td>EA PS 2042-06B</td>
 <td>Optional</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminium foil</td>
 <td>Prix Coop</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heater</td>
 <td>GOON</td>
 <td>NSB200C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microwave Oven</td>
 <td>Intertronic</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Standard corn meal fly food</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Destilled water </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in drosophila larvae

מעשי אור כאות סביבתית לשלוט בהתנהגות בעלי חיים ברמות שונות. מערכת העצבים תסיסנית הזחל משמשת כמודל ייחודי כדי לענות על שאלות בסיסיות על האופן בו מידע מעובד ואור משותף בין התנהגויות מהירות ויממה. זחלים תסיסנית להציג התנהגות הימנעות סטריאוטיפית בעת חשיפה לאור. כדי לחקור התנהגויות האור תלויות יכולות להיות מיושמות בדיקות בכורה אור כהות comparably פשוטות. בבעלי חוליות ופרוקי רגלי המסלולים העצביים המעורבים בחישה ועיבוד תשומות חזותיות חופפים באופן חלקי עם מידע היממה photic אלה עיבוד. השאלה המרתקת של איך מערכת חישת האור ומערכת היממה אינטראקציה כדי לשמור על תפוקות התנהגות מתואמות נשארה במידה רבה שלא נחקר. דרוזופילה היא מודל משפיע ביולוגי לגשת לשאלות אלה, בשל מספר קטן של תאי עצב במוח ובזמינות של כלים גנטיים לmanipul העצביation. Assay העדפת אור האפל הציג מאפשר החקירה של מגוון רחב של התנהגויות חזותיות כולל בקרה ביולוגי של Phototaxis.

בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל, בדקנו העדפת אור בחושך באצטדיון הזחל שלישי המוקדם של סוג בר קנטון-S טסה בשתי פעמים Ct0 וCT12 שונות היממה. מבוגרים גודלו 12 שעות אור 12 שעות חושך והשאירו להטיל ביצים עבור 12 שעות. זחלים לגדול ביומיים הראשונים תחת אותו משטר אור בחושך. מכיוון שאנו רוצים לבדוק אפנון היממה בתנאים קבועים (ריצה ללא שעון הביולוגי), זחלים שלאחר מכן הועברו לחשכה מתמדת במשך שלושת הימים הבאים עד לביצוע בדיקה (איור 3 א). כאן, אנו משמשים 350 לוקס שכן הוכח כי מדובר בעוצמת האור האופטימלית כדי לזהות הבדלים של תגובת אור זחל תסיסנית לאורך מחזור היממה בהשוואה לעוצמות אחרות (70 ו 600 לוקס) 7. הבדלים ברגישות לאור, ולכן בתגובה הוא ציין אור כאשר משווים CT0 עם CT12. בדרוזופילה, CT0 יעלה בקנה אחדים עם עלות השחר, במחצית המחזור בין CT0-CT12 נחשב היום סובייקטיבית ומCT12 לCT24 סובייקטיבית הלילה 12. רגישות לאור גבוהה יותר לזמן קצר לאחר מעבר מחושך לאור, כאשר כמעט 77% מהזחלים מעדיפים את החושך בהשוואה לכמעט 69% מהעדפה חשוכה בלילה סובייקטיבית המוקדם (איור 3). זה בא לידי ביטוי גם במדד ההעדפה הכהה (PREF (חושך)) מחושב עם נוסחה שהוצגה לעיל עבור כל ניסוי. ממוצע של כל החזרות שהשגנו מדד העדפה של 0.52 לCT0 ושל 0.36 לCT12. באמצעות בדיקת Wilcoxon (מקור) הבדל משמעותי סטטיסטי בין שתי נקודות זמן מוצג (p = 0.0229). <img src="/files/ftp_upload/50237/50237fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1. () סימון רביעים בעפעפי צלחת פטרי. יכולים להיות מסומנים ברביעים את המכסה צלחת פטרי עם עזרה<html> מרבע מודפס משמש בד. בדיעבד את השכבה הראשונה של נייר אלומיניום יכול להיות מודבק על פני השטח החיצוני של הצלחת ולהיות מכוסה בסרט שחור בשני הרביעים המנוגדים לחשכה. (ב &#39;) סכמטי להגדיר עבור מבחן העדפת האור הכהה. (ג) פטרי צלחת מכוסות ברביעים כהים ומלאה ב2.5% אגר, מוכן לשמש לניסויים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50237/50237fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img src="/files/ftp_upload/50237/50237fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2 מבחן העדפת אור כהה., דוגמה של צלחת מייד אחרי הגדרת זחל על צלחת הבדיקה (התחלה) ואחרי 5 דק &#39;(סוף). בדרך כלל, אנחנו משתמשים בקבוצה של 30 בעלי חיים עבור כל ניסוי. tp_upload/50237/50237fig3.jpg &quot;alt =&quot; איור 3 &quot;עבור: = תוכן ברוחב&quot; 5.5in &quot;FO-src =&quot; / files/ftp_upload/50237/50237fig3highres.jpg &quot;/&gt; איור 3. (א) ואחריו משטר אור כדי לבדוק את העדפת אור בהאכלת זחל L3. (ב) אחוז ההעדפה הכהה עבור שניהם נקודות הזמן שנבדק (CT0 וCT12). אחוז מהזחל שהחושך והאור המועדף נספרים לכל חזרה וחזרתי שוב ושוב את כל ממוצע. זחלים בגבולות הצלחת או החפירה באגר נחשבים כניטראליים. (ג) מדד העדפה אפל מחושב לאותן נקודות הזמן. הבדל סטטיסטי מובהק בין קבוצות מוצג על ידי בדיקת סכום הדרגה Wilcoxon (p &lt;0.05). (N = 18 (540 זחלים) לכל נקודת זמן). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50237/50237fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae at JoVE.com

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

כאן אנו מתארים מבחן העדפת אור בחושך לזחל דרוזופילה. assay זה מספק מידע על רגולציה מולדת ויממה של photobehavior חישה ועיבוד אור.

Assay העדפות אור לחקר Photobehavior מוסדר מולדת ויממה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

light-preference-assay-to-study-innate-circadian-regulated

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

12.8K Views.  University of Fribourg. כאן אנו מתארים מבחן העדפת אור בחושך לזחל דרוזופילה. assay זה מספק מידע על רגולציה מולדת ויממה של photobehavior חישה ועיבוד אור.

Video: Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Assaying פעילות של תנועה כדי ללמוד בקצב היממה ושינה פרמטרים תסיסנית</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Measuring Circadian and Acute Light Responses in Mice using Wheel Running Activity

Circadian rhythms are physiological functions that cycle over a period of approximately 24 hours (circadian- circa: approximate and diem: day)1, 2. They are responsible for timing our sleep/wake cycles and hormone secretion. Since this timing is not precisely 24-hours, it is synchronized to the solar day by light input. This is accomplished via photic input from the retina to the suprachiasmatic nucleus (SCN) which serves as the master pacemaker synchronizing peripheral clocks in other regions of the brain and peripheral tissues to the environmental light dark cycle3-7. The alignment of rhythms to this environmental light dark cycle organizes particular physiological events to the correct temporal niche, which is crucial for survival8. For example, mice sleep during the day and are active at night. This ability to consolidate activity to either the light or dark portion of the day is referred to as circadian photoentrainment and requires light input to the circadian clock9. Activity of mice at night is robust particularly in the presence of a running wheel. Measuring this behavior is a minimally invasive method that can be used to evaluate the functionality of the circadian system as well as light input to this system. Methods that will covered here are used to examine the circadian clock, light input to this system, as well as the direct influence of light on wheel running behavior.

This article will review methods that can be used to determine circadian function and light responsiveness in mice.

התגובות מדידת אור היממה ואת חריפה בעכברים באמצעות פעילות גלגל ריצה

Circadian rhythms are physiological functions that cycle over a period of approximately 24 hours (circadian- circa: approximate and diem: day)1, 2.  They ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

שיטות Assay תסיסנית התנהגות

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

שיטות מקומיים וכלל עולמיים של הערכת Nociception תרמי ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; רימה

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

למידה אסוציאטיבית הרחה באפטטיבית<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, including rats, hamsters, and mice, are active during the night and relatively inactive during the day. Many other behavioral and physiological measures also exhibit daily rhythms, but in rodents, running-wheel activity serves as a particularly reliable and convenient measure of the output of the master circadian clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. In general, through a process called entrainment, the daily pattern of running-wheel activity will naturally align with the environmental light-dark cycle (LD cycle; e.g. 12 hr-light:12 hr-dark). However circadian rhythms are endogenously generated patterns in behavior that exhibit a ~24 hr period, and persist in constant darkness. Thus, in the absence of an LD cycle, the recording and analysis of running-wheel activity can be used to determine the subjective time-of-day. Because these rhythms are directed by the circadian clock the subjective time-of-day is referred to as the circadian time (CT). In contrast, when an LD cycle is present, the time-of-day that is determined by the environmental LD cycle is called the zeitgeber time (ZT).
Although circadian rhythms in running-wheel activity are typically linked to the SCN clock6-8, circadian oscillators in many other regions of the brain and body9-14 could also be involved in the regulation of daily activity rhythms. For instance, daily rhythms in food-anticipatory activity do not require the SCN15,16 and instead, are correlated with changes in the activity of extra-SCN oscillators17-20. Thus, running-wheel activity recordings can provide important behavioral information not only about the output of the master SCN clock, but also on the activity of extra-SCN oscillators. Below we describe the equipment and methods used to record, analyze and display circadian locomotor activity rhythms in laboratory rodents.

Circadian rhythms in voluntary wheel-running activity in mammals are tightly coupled to the molecular oscillations of a master clock in the brain. As such, these daily rhythms in behavior can be used to study the influence of genetic, pharmacological, and environmental factors on the functioning of this circadian clock.

הקלטה וניתוח של מקצבי יממה בריצת גלגל פעילות במכרסמים

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

Assay העדפות טעם למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival.  The most obvious application of these chemosenses is to be able to ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Assay רומן עבור הקרה Nociception ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...