Cette étude a été financée par le Conseil suédois de la recherche (K2008-57X-20 676-01-3).

1. L&#39;isolement Exosome <ol><li> Cultiver des cellules dans un milieu avec exosomes sans sérum. Ainsi, tout sérum ajouté au milieu de culture cellulaire devrait être épuisée d&#39;exosomes par ultracentrifugation à 120 000 xg pendant la nuit à 4 ° C avant utilisation. </li><li> Transférer la suspension cellulaire à tubes coniques. </li><li> Centrifuger à 300 xg pendant 10 minutes à 4 ° C pour culotter les cellules. </li><li> Transférer le surnageant dans des tubes d&#39;ultracentrifugation et s&#39;il n&#39;est pas complètement plein ajouter du PBS. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 16 500 xg pendant 20 minutes à 4 ° C pour éliminer davantage les cellules et les débris cellulaires. </li><li> Filtrer le surnageant à travers un filtre de 0,2 um pour éliminer les particules plus grandes que 200 nm. </li><li> Transférer le surnageant filtré à des tubes d&#39;ultracentrifugation nouvelles et sceller les tubes avant d&#39;ultracentrifugation à 120 000 xg pendant 70 minutes à 4 ° C pour culotter les exosomes. </li><li> Jeter le surnageant. </li><li> Pour la récupération maximale exosomes, remettre en suspension les exosomes d&#39;enrichiréd granulés à plusieurs reprises dans un petit volume (~ 3 x 50 pi) d&#39;un tampon approprié. Ce tampon dépend des expériences aval planifiée après l&#39;isolement exosomes. Par exemple, un tampon de lyse est utilisé pour les protéines et l&#39;isolement d&#39;ARN, PBS est utilisé pour la microscopie électronique et la cytométrie en flux et pour les études fonctionnelles moyennes peuvent être préférés. </li></ol> Remarque: les exosomes peuvent également être isolés à partir des fluides corporels différents, tels que le plasma, en utilisant la même procédure que pour les milieux de culture cellulaire. Pour les fluides visqueux, il peut être nécessaire de diluer l&#39;échantillon avec du PBS avant la centrifugation et filtration. En ce qui concerne la vitesse de centrifugation pour le point 5 ci-dessus, il peut être augmenté à 29 500 xg, et l&#39;ultracentrifugation au point 7 peut être étendu à 90 minutes 18. Si l&#39;échantillon doit être purifié davantage l&#39;exosome culot peut être flotté sur un gradient de saccharose et les exosomes sera principalement trouvés dans la fraction representing une densité de 1.13 à 1.19 g / ml 2. 2. L&#39;identification Exosome par microscopie électronique <ol><li> Afin d&#39;éliminer les protéines contaminantes, remettre en suspension les exosomes enrichi culot dans du PBS et ultracentrifugation à 120 000 xg pendant 70 minutes à 4 ° C à re-sédimenter les exosomes. </li><li> Prenez une petite aliquote de l&#39;échantillon pour l&#39;isolement des protéines et de mesure des protéines totales. Assurez-vous que seule une petite partie de l&#39;échantillon est lysé et utilisé pour la mesure de protéines et de garder intacts les exosomes, résolu dans le PBS, séparés sur la glace ou à -80 ° C pour d&#39;autres expériences. </li><li> Déposer une goutte, environ 10 ug de protéine exosomales des exosomes intacte remis en suspension dans du PBS, sur un parafilm. Puis, avec une pince doucement la position d&#39;une grille de nickel de carbone formvar couché sur le dessus de chaque goutte pendant 30-60 minutes. Assurez-vous que la grille est placée avec le côté face à la chute de revêtement contenant des exosomes. </li><li> Placez trois gouttes, chaque ul 30, de PBS sur le tIl Parafilm et laver la grille en séquentiellement positionnement de la grille sur le dessus des gouttelettes de PBS, et utiliser un papier absorbant entre les deux. Utilisez le papier absorbant délicatement tout en le tenant près de la côté de la grille, sans contact avec la surface revêtue. </li><li> Fixer l&#39;échantillon par déposer une goutte de paraformaldéhyde 2% sur le Parafilm et le lieu de la grille sur le dessus de la chute pour 10 minutes. </li><li> Répétez l&#39;étape de lavage au point 4, avant immunomarquage avec un anticorps appropriés. Anticorps couramment utilisés sont les anti-CD63 et anti-CMH de classe II. La microscopie électronique peut également être effectuée sans que les exosomes immunomarquage peuvent être identifiés uniquement basée sur la taille et la morphologie. Cependant, nous recommandons d&#39;évaluer la taille, la morphologie et la présence d&#39;une protéine membranaire pour une validation plus concluants. </li><li> Transfert de la grille à une baisse de 30 pi de l&#39;anticorps primaire de choix et incuber pendant 40 minutes. Laver en répétant le point 4, mais l&#39;utilisation de 0,1% d&#39;albumine sérique bovine dans le PBS au lieu de PBS seul. </li><li> Répétez le point 7, mais avec le 10 nm d&#39;or anticorps secondaire marqué et se laver avec du PBS seul. </li><li> Post-fixer l&#39;échantillon en ajoutant une goutte de glutaraldéhyde à 2,5% de la parafilm et incuber la grille sur le dessus de la chute pour 10 minutes. Répéter le lavage au point 4, mais utiliser cinq gouttes d&#39;eau déminéralisée au lieu de trois gouttes de PBS. </li><li> Contraste de l&#39;échantillon en ajoutant une goutte d&#39;acétate d&#39;uranyle 2% de la parafilm et incuber la grille sur le dessus de la chute pour 15 minutes. </li><li> Intégrer l&#39;échantillon en ajoutant une goutte de méthyl-cellulose 0,13% et l&#39;acétate d&#39;uranyle 0,4% de la parafilm et incuber la grille sur le dessus de la chute pour 10 minutes. </li><li> Retirez l&#39;excès de liquide par les délicatement en utilisant un papier absorbant, avant de positionner la grille sur un papier avec le côté enduit et laissez sécher à l&#39;air pendant 5 minutes. </li><li> Examiner les préparatifs avec un microscope électronique ou stocker les grilles dans une case de la grille pour les travaux futurs. </li></ol> 3.Caractérisation Exosome par cytométrie en flux Comme les exosomes sont trop petites pour être détectées par des équipements de cytométrie de flux actuel, il est d&#39;abord nécessaire de lier les exosomes à des billes revêtues d&#39;anticorps (figure 1). Ces perles peuvent être achetés en tant que produit prêt à l&#39;emploi ou de fait dans le laboratoire avec l&#39;anticorps de choix. Selon l&#39;origine exosomales cellulaire, différents anticorps peuvent être couplés à des billes qui peuvent être soit de caractère magnétique ou le latex. Nous utilisons actuellement anti-CMH de classe II ou anti-CD63 billes revêtues de cette analyse. <ol><li> Pour l&#39;utilisation de la &quot;maison&quot; perles enrobées d&#39;anticorps, nous utilisons quatre billes de latex um recouverte d&#39;anticorps anti-CD63. Lavez 25 ul 4 billes de latex um (30 x 10 6 perles) deux fois dans 100 ul de tampon MES, 3 000 xg pendant 15-20 minutes et redissoudre le culot dans 100 pi de tampon MES. Préparer le mélange d&#39;anticorps contenant un volume égal de 12,5 mg d&#39;anticorps avec le même volume de tampon MES. Ajouter lesperles pour le mélange d&#39;anticorps et incuber sous agitation pendant la nuit à température ambiante. Laver les billes revêtues d&#39;anticorps à trois reprises avec du PBS (3 000 xg pendant 20 minutes) et de dissoudre le culot dans 100 ul de tampon de stockage (avec une concentration finale de 300 000 billes / pl). </li><li> Pour chaque échantillon (chaque anticorps), continuer avec un volume égal à un minimum de 30 ug de protéine exosomales (des exosomes intacte résolu dans le PBS) par ~ 100 000 perles enrobées d&#39;anticorps. </li><li> Incuber les exosomes et des perles, dans un volume total de 300 ul de PBS, pendant la nuit à 4 ° C sous mouvement doux. </li><li> Bloc en ajoutant 300 pi de 200 mM de glycine et incuber pendant 30 minutes. </li><li> Lavez les complexes exosomes-billes à deux reprises en tampon de lavage (sérum de 1-3% dans le PBS), 600 g pendant 10 minutes. </li><li> Incuber les complexes exosomes-billes avec 50 ul d&#39;anticorps IgG à 4 ° C. Lavez les complexes exosomes-billes à deux reprises en tampon de lavage comme décrit dans l&#39;étape 5. </li><li> Ajouter 90 ul de tampon de lavage et 10 pld&#39;anticorps de choix (idéalement anti-CD9, anti-CD63 ou anti-CD81) aux complexes exosomes-billes et incuber pendant 40 minutes sous mouvement doux. Lavez les complexes exosomes-billes deux fois dans le tampon de lavage comme décrit dans l&#39;étape 5. </li><li> Ajouter 300 ul de tampon de lavage et d&#39;acquérir des données en utilisant la cytométrie de flux. </li></ol> Comme discuté ci-dessus, des perles différentes peuvent être utilisées, telles que des billes de latex comme décrit dans le protocole ou des billes magnétiques. Si les billes magnétiques sont utilisés au lieu, s&#39;il vous plaît noter que le protocole est légèrement différent. L&#39;étape de blocage (point 4) Il n&#39;est pas nécessaire et le lavage est effectué en plaçant le tube dans un support magnétique au lieu d&#39;une centrifugation. Le tampon de stockage utilisé pour la &quot;maison&quot; perles d&#39;anticorps enduit, contiennent 0,1% et 0,1% de glycine sodique azid dans du PBS, avec un pH de 7,2. Surtout, veillez à utiliser le sérum exosomes appauvri pour le tampon de lavage de cytométrie en flux (1-3% de sérum dans le PBS), pour éviter touteexosomes sérique contaminer l&#39;analyse. Remarque: lors de l&#39;exécution de caractérisation exosomes en utilisant des anticorps billes couplées, il est important de reconnaître que ce n&#39;est qu&#39;une sous-population spécifique, spécifique de l&#39;anticorps utilisé, qui est isolé et caractérisé. 4. Détection Exosome par Western blot Western blot est une méthode bien établie et nous n&#39;allons pas entrer dans les détails concernant la méthode elle-même, mais se concentrer sur l&#39;importance d&#39;un isolement de protéines appropriés avant la Western blot et les différents anticorps utilisés. <ol><li> Dissoudre le culot dans exosomes le tampon de lyse des protéines de choix et de pipetage à fond, suivi par vortex de mélange. Pour mieux lyser les exosomes, soniquer l&#39;échantillon dans un bain d&#39;eau 3 x 5 minutes avec vortex de mélange entre les deux. Enfin centrifuger l&#39;échantillon, 13 000 xg pendant 5 minutes à température ambiante, et le transfert du surnageant dans un nouveau tube Eppendorf. </li><li> Mesure de la protéine totale par une méthode de choix et de la charge de 20 à 50 mg de protéine par puits. </li><li> Séparer et transférer des protéines par électrophorèse sur gel et électrotransfert. </li><li> Bloc et laver la membrane avant d&#39;effectuer immunomarquage contre les protéines enrichies en exosomes. </li><li> Détecter la protéine spécifique par chimiluminescence, le système d&#39;imagerie numérique et des logiciels d&#39;analyse. </li></ol> Comme il n&#39;existe pas de marqueurs spécifiques exosomes, des protéines qui sont enrichis en exosomes, de toutes origines différentes cellulaire, sont couramment utilisés pour la détection des exosomes. Ce sont des protéines telles que les tétraspanines (par exemple CD9, CD63 et CD81), cytosquelette protéine associée (par exemple, ezrine) et les protéines impliqués dans la biogenèse multivésiculaires (par exemple TSG101 et Alix). D&#39;autres protéines qui sont aussi couramment détecté dans les exosomes sont Flotillin, Hsc70 et des protéines Rab différentes, etc Toutefois, il ya aussi des cellules de protéines spécifiques dans les exosomes, comme A33 (cellules épithéliales intestinales), CD3(Cellules T) et du CMH de classe II (cellules présentatrices d&#39;antigènes). Ainsi, en fonction de ce type de cellule les exosomes sont libérés à partir des marqueurs pour la détection peuvent varier. Comme les autres compartiments de la cellule peut également produire des vésicules, il est recommandé en outre de déterminer la présence de protéines à partir de ces compartiments tels que le réticulum endoplasmique (par exemple calnexine et GRP78) et l&#39;appareil de Golgi (par exemple GM130). Ainsi, le manque de ces protéines indique une contamination peu ou pas de vésicules de d&#39;autres compartiments de l&#39;échantillon étudié. 5. L&#39;isolement de l&#39;ARN et l&#39;ARN exosomales analyse <ol><li> Dissoudre le culot dans exosomes le tampon de lyse ARN de choix et d&#39;effectuer l&#39;extraction d&#39;ARN. Différents kits d&#39;isolement d&#39;ARN peut être utilisé en fonction des expériences en aval, mais les méthodes colonne basée fournit des échantillons avec un spectre plus large de l&#39;ARN. Nous utilisons actuellement Kit miRCURY Isolement de l&#39;ARN par Exiqon, mais d&#39;autres kits peuvent être adaptés en fonction de la scquestion ientific à portée de main. </li><li> Lorsque vous effectuez l&#39;isolement d&#39;ARN, il est important de travailler dans un environnement exempt de RNase. Par conséquent l&#39;utilisation d&#39;acides nucléiques et nucléase sans embouts de pipette et essuyez les deux banc et l&#39;équipement exempt de contaminants et RNases. </li><li> Pour l&#39;isolement d&#39;ARN, en utilisant Kit miRCURY Isolement d&#39;ARN, dissoudre le culot dans exosomes 350 pi de solution de lyse et d&#39;effectuer le mélange vortex pendant 15 secondes. </li><li> Ajouter 200 pi d&#39;éthanol à 95% et le vortex de mélange pendant 10 secondes. </li><li> Placer une colonne dans un tube de collecte et de transfert des exosomes lysées à la colonne et centrifuger 1 minute à 14 000 x g. </li><li> Laver trois fois en ajoutant 400 pi de solution de lavage dans la colonne contenant l&#39;ARN exosomales et centrifuger pendant 1 minute à 14 000 x g. </li><li> Centrifuger la colonne pendant 2 minutes à 14 000 xg pour s&#39;assurer que la colonne est sec et le lieu de la colonne sèche dans un tube Eppendorf sans RNase. </li><li> Ajouter 50 ul de tampon d&#39;élution de la colonne et centrifuger pendant 2<html> minutes à 200 xg, suivi par 1 minute à 14 000 x g. </li><li> Continuer avec l&#39;ARN isolé ou de le stocker dans -80 ° C. </li></ol> Pour la détection et l&#39;analyse de l&#39;ARN total extrait exosomales, utilisez un bioanalyseur Agilent 2100 avec le RNA 6000 Nano ou Kit Pico ARN 6000. L&#39;analyse montre le rendement exosomales ARN et la distribution de taille. 6. Les résultats représentatifs Les exosomes sont trop petits pour être détectés par les méthodes de cytométrie en flux, et sont donc attachés à revêtues d&#39;anticorps perles avant d&#39;être analysés (figure 1). Comme exosomes-billes complexes peuvent agréger le nuage de cytométrie en flux peut contenir différentes populations de simple, double et triple perles (figure 2A). La flèche indique la seule perles qui sont encore analysés. Un CD63 positif unique de perles exosomes de la population par rapport à son contrôle isotypique est montré dans la figure 2B. e_content &quot;&gt; En raison de la faible taille des exosomes, ils ne peuvent être directement visualisées par microscopie électronique, et non pas par microscopie optique. caractéristiques morphologiques typiques d&#39;exosomes sont de forme ronde et de 30 à 100 nm des vésicules membranaires de taille. Dans la figure 3, la microscopie électronique photographies montrent des exosomes immunocolorés (A) avec de l&#39;or-anticorps marqué pour le CD63 (indiqué par la flèche) et la non-immunocolorés exosomes (B). Afin de déterminer que les vésicules isolées sont en effet les exosomes et de mieux caractériser les protéines exosomales, Western blot est utilisé couramment. La figure 4 montre l&#39;absence de la calnexine, un marqueur du réticulum endoplasmique. Cela indique une faible contamination des vésicules du réticulum endoplasmique. Par ailleurs, la figure 4 montre la présence de CD81 dans les exosomes, qui est une tétraspanine fréquemment enrichi en exosomes. L&#39;ARN cellulaire contiennent principalements ARN ribosomal (ARNr), considérés comme les deux pics importants pour les sous-unités 18S et 28S rRNA dans une analyse Bioanalyzer (figure 5A). Toutefois, l&#39;ARN exosomales diffèrent dans leur profil comme exosomes manque les deux pics ARNr (18S et 28S) et sont enrichies en ARN courts comme l&#39;ARNm et miARN (figure 5B). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig1.jpg" /> Figure 1. En raison de la faible taille des exosomes (30-100 nm), ils ne peuvent pas être distinguer du bruit et de fond lorsque analysés avec la cytométrie de flux. Par conséquent, il est nécessaire de les attacher à des billes revêtues d&#39;anticorps avant la exosomes sont analysés, qui peuvent ensuite être visualisées par le laser. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig2.jpg" /> Figure 2. Les perles exosomes complexe peut agréger les uns avec les autres et former des billes doubles et triples (A). La flèche est la démonstration de la seule bille-exo<html> une certaine population qui est fermée et utilisée pour une analyse ultérieure. Cette population sera directement comparée à un contrôle isotypique (rempli de gris de pointe) pour déterminer la présence de molécules de la membrane des exosomes. CD63 exosomes positifs (noir de pointe ouverte) sont présentés dans la figure B. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig3.jpg" /> Figure 3. Les micrographies électroniques et des exosomes avec la morphologie typique et la taille (40-80 nm) (A et B). La flèche de la figure A indique la particule d&#39;or de l&#39;anticorps secondaire, vérifier que cette exosomes sont CD63 à sa surface de membrane. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig4.jpg" /> Figure 4. Résultats de Western-blot montrant l&#39;absence de la protéine de la calnexine réticulum endoplasmique, mais la présence de la protéine couramment enrichis en exosomes, tétraspanines CD81. ve_content &quot;&gt; <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig5.jpg" /> Figure 5. Des résultats montrant Bioanalyzer ARN présence dans les cellules (A) et les exosomes (B). Les flèches indiquent les sous-unités 18S et 28S ARNr présent dans les cellules. Comme exosomales ARN contiennent viril petit ARN ARNr peu ou pas est identifié dans les exosomes.

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	<li>Pan, B. -. T., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+the+transferrin+receptor+during+maturation+of+sheep+reticulocytes+in+vitro:+Selective+externalization+of+the+receptor.">Fate of the transferrin receptor during maturation of sheep reticulocytes in vitro: Selective externalization of the receptor.</a> Cell. 33, 967-978 (1983).</li><li>Chaput, N., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+immune+properties+and+potential+clinical+implementations.">Exosomes: immune properties and potential clinical implementations.</a> Semin. Immunopathol. , 10-1007 (2010).</li><li>L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-containing+exosomes+in+human+nasal+secretions.">RNA-containing exosomes in human nasal secretions.</a> Am. J. Rhinol. Allergy. 25, 89-93 (2011).</li><li>Caby, M. -. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma.">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).</li><li>Palanisamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructural+and+Transcriptomic+Analyses+of+Human+Saliva+Derived+Exosomes.">Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes.</a> PLoS ONE. 5, e8577-e8577 (2010).</li><li>Admyre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+with+Immune+Modulatory+Features+Are+Present+in+Human+Breast+Milk.">Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk.</a> J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).</li><li>Almqvist, N., L&#246;nnqvist, A., Hultkrantz, S., Rask, C., Telemo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-derived+exosomes+from+antigen-fed+mice+prevent+allergic+sensitization+in+a+model+of+allergic+asthma.">Serum-derived exosomes from antigen-fed mice prevent allergic sensitization in a model of allergic asthma.</a> Immunology. 125, 21-27 (2008).</li><li>Prado, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+Bronchoalveolar+Fluid+of+Tolerized+Mice+Prevent+Allergic+Reaction.">Exosomes from Bronchoalveolar Fluid of Tolerized Mice Prevent Allergic Reaction.</a> J. Immunol. 181, 1519-1525 (2008).</li><li>Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+established+murine+tumors+using+a+novel+cell-free+vaccine:+dendritic+cell-derived+exosomes.">Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes.</a> Nature. Medicine. 4, 594-600 (1998).</li><li>Ashiru, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Is+Suppressed+by+Exposure+to+the+Human+NKG2D+Ligand+MICA*008+That+Is+Shed+by+Tumor+Cells+in+Exosomes.">Natural Killer Cell Cytotoxicity Is Suppressed by Exposure to the Human NKG2D Ligand MICA*008 That Is Shed by Tumor Cells in Exosomes.</a> Cancer. Research. 70, 481-489 (2010).</li><li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Mammary+Carcinoma+Exosomes+Promote+Tumor+Growth+by+Suppression+of+NK+Cell+Function.">Murine Mammary Carcinoma Exosomes Promote Tumor Growth by Suppression of NK Cell Function.</a> The Journal of Immunology. 176, 1375-1385 (2006).</li><li>Viaud, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cell-Derived+Exosomes+Promote+Natural+Killer+Cell+Activation+and+Proliferation:+A+Role+for+NKG2D+Ligands+and+IL-15R&#945;.">Dendritic Cell-Derived Exosomes Promote Natural Killer Cell Activation and Proliferation: A Role for NKG2D Ligands and IL-15R&#945;.</a> PLoS ONE. 4, e4942-e4942 (2009).</li><li>Szajnik, M., Czystowska, M., Szczepanski, M. J., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-Derived+Microvesicles+Induce,+Expand+and+Up-Regulate+Biological+Activities+of+Human+Regulatory+T+Cells+(Treg).">Tumor-Derived Microvesicles Induce, Expand and Up-Regulate Biological Activities of Human Regulatory T Cells (Treg).</a> PLoS ONE. 5, e11469-e11469 (2010).</li><li>Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> J. Exp. Med. 183, 1161-1172 (1996).</li><li>Abusamra, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+exosomes+expressing+Fas+ligand+mediate+CD8++T-cell+apoptosis.">Tumor exosomes expressing Fas ligand mediate CD8+ T-cell apoptosis.</a> Blood Cells, Molecules, and Diseases. 35, 169-173 (2005).</li><li>Valadi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 654-659 (2007).</li><li>Eldh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+communicate+protective+messages+during+oxidative+stress;+possible+role+of+exosomal+shuttle+RNA.">Exosomes communicate protective messages during oxidative stress; possible role of exosomal shuttle RNA.</a> PLoS One. 5, e15353-e15353 (2010).</li><li>L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+saliva,+plasma+and+breast+milk+exosomes+contain+RNA:+uptake+by+macrophages.">Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages.</a> J. Transl. Med. 9, 9-9 (2011).</li></ol>

JL est un co-propriétaire d&#39;un brevet lié à l&#39;utilisation des exosomes comme vecteurs pour le transfert d&#39;ARN dans les cellules.

Lorsque l&#39;on étudie le contenu moléculaire et / ou la fonction des exosomes, il est crucial d&#39;utiliser une méthode d&#39;isolation de haute qualité qui offre un rendement approprié et le degré le plus bas possible de la contamination. La méthodologie décrite dans ce papier est une méthode bien établie pour isoler les exosomes et d&#39;étudier leur contenu en ARN et la fonction biologique. Par ailleurs, l&#39;importance de la caractérisation des exosomes isolés, par une combinaison de différentes méthodes, y compris la microscopie électronique, cytométrie en flux, et Western blot, est mis en surbrillance. Lorsque isoler les exosomes, la première phase de centrifugation (300 xg) est utilisé pour sédimenter les cellules qui pourraient être présents dans les cellules en suspension ou le fluide étudié biologique. La seconde centrifugation à 16 500 xg besoins d&#39;être suffisamment forte pour sédimenter les cellules mortes, les débris importants, les corps apoptotiques et d&#39;autres organites. Après cette centrifugation, certains protocoles comprennent une étape de nano-filtration, mais certains investigators avons exclu de cette étape. Toutefois, nous soulignons l&#39;importance de fragments de l&#39;éradication et des vésicules plus grandes que 200 nm et est donc fortement recommandé notamment une étape de filtration. Si une isolation plus strictes sont nécessaires, 100 nm filtres peuvent être utilisés, mais notez que si fluides visqueux sont utilisés, ces filtres peuvent facilement devenir bloqué et matériels exosomales est perdu. En outre, une filtration à 100 nm peuvent affecter la morphologie des exosomes et en outre si les exosomes sont sur la grande échelle, ils pourraient être perdus. Ainsi, les 200 filtres nm semble pas approprié pour l&#39;isolement exosomes. Après la filtration, l&#39;ultracentrifugation obligatoire à 120 000 xg est utilisé pour agglomérer les exosomes. Les exosomes peuvent encore être lavées avec du PBS, lié à des billes revêtues d&#39;anticorps et lavées, ou placé sur un gradient de saccharose pour éliminer les protéines de contamination. Toutefois, cela peut être un processus très consommateur de ressources que nous soutiennent ne pas être nécessaire, surtout si le volume de l&#39;échantillon de départ est faible et / ou la teneur en ARN of les exosomes est faible, comme des mesures supplémentaires seront de diminuer sensiblement le matériel supplémentaire. Toutefois, là encore, la nature des vésicules isolées doit être prouvée par la présence et l&#39;absence de certaines protéines. À ce jour, aucun marqueur protéique absolument unique pour les exosomes a été identifié pour vérifier que l&#39;échantillon contient des exosomes et rien d&#39;autre. En conséquence, une combinaison de méthodes sont nécessaires pour caractériser les exosomes, y compris la détermination de la taille et la morphologie des exosomes par microscopie électronique. En outre, la pureté de l&#39;échantillon peut être déterminée par microscopie électronique, que cette méthode peut fournir un aperçu du niveau de contamination de l&#39;échantillon, par exemple avec de grandes vésicules, telles que des microparticules, des corps apoptotiques ou des débris cellulaires. Par ailleurs, la teneur en protéines des exosomes peuvent être déterminées par cytométrie en flux et Western blot, et la combinaison de ces résultats deux méthodes dans une analyse de la membrane à la fois liés (par exemple CD63 etCD81) et intériorisé protéines (par exemple TSG101 et Alix) des exosomes. La détection des protéines enrichies en exosomes, comme CD63, TSG101 et Alix, et l&#39;absence de protéines tels que la protéine de réticulum endoplasmique calnexine, est une indication que l&#39;exosome enrichi granulés est en effet exosomes et de ne pas contaminer les vésicules d&#39;autres compartiments de la cellule. Le profil de l&#39;ARN qui est détecté dans les exosomes est fondamentalement différente de celle de l&#39;ARN dans les cellules intactes. Ainsi, l&#39;ARN exosomales analysés par bioanalyseur ou en gel à base d&#39;approches d&#39;analyse d&#39;ARN n&#39;ont pas les deux pics pour les sous-unités 18S et 28S ARNr, qui sont importants dans l&#39;analyse de l&#39;ARN cellulaire. Nous soutenons donc que la détection de quantités importantes de toute l&#39;ARNr dans un échantillon indique que l&#39;ARN total extrait n&#39;est pas d&#39;origine exosomales seul, et donc que la méthode d&#39;isolement doit être améliorée et la qualité assurée.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> L&#39;isolement Exosome </td></tr><tr><td> Optima L-90K Ultracentrifuger </td><td> Beckman Coulter </td><td> 65670 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes d&#39;ultracentrifugation Quick-Seal </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> Selon le rotor utilisé différents tubes sont nécessaires. Ti70 (342 414), Ti45 (345776) </td></tr><tr><td> Quick-Seal Tube Cordless Topper kit </td><td> Beckman Coulter </td><td> 358312 </td><td></td></tr><tr><td> Filtropur filtre seringue, 0.20μm </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1826.001 </td><td> Pour les fluides visqueux et / ou des volumes importants, un système de filtration sous vide, 0,2 um, de VWR International peut être utilisé à la place (514-0600). </td></tr><tr><td> La microscopie électronique </td></tr><tr><td> Formvar / carbone grilles de nickel revêtement </td><td> Ted Pella Inc </td><td> 1GN200 </td><td></td></tr><tr><td> Souris anti-CD63 humain </td><td> BD Bioscience </td><td> 556019 </td><td> Finale conc: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> Contrôle isotypique; IgG1κ (MOPC 21) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9269 </td><td> Finale conc: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> IgG anti-souris conjugué d&#39;or, 10 nm </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7777 </td><td> Concentration finale: 1% </td></tr><tr><td> LEO 912AB Omega au microscope électronique </td><td> Carl Zeiss NTS </td><td></td><td> Ou matériel équivalent. </td></tr><tr><td> La cytométrie en flux </td></tr><tr><td> 4μm aldéhyde / sulfate de billes de latex </td><td> Dynamique interfaciale </td><td> 12-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps pour le revêtement de l&#39;billes de latex </td><td></td><td></td><td> Par exemple anti-CD63 de BD Bioscience (556019) </td></tr><tr><td> Intelli-mixeur RM-2L </td><td> ELMI </td><td></td><td> Ou matériel équivalent. </td></tr><tr><td> IgG de sérum humain </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I4506 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps pour la détection </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td> Par exemple: PE anti-CD63 (556 020) de contrôle anti-CD9 PE (555 372) Isotype PE anti-CD81 (555 676) (555 749) </td></tr><tr><td> BD FACSAria </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Western Blot </td></tr><tr><td> Transsonic T 490 DH </td><td> ELMA </td><td></td><td> Ou matériel équivalent. </td></tr><tr><td> L&#39;isolement de l&#39;ARN et l&#39;ARN exosomales analyse </td></tr><tr><td> miRCURY RNA Kit </td><td> Exiqon A / S </td><td> 300110 </td><td></td></tr><tr><td> Agilent 2100 bioanalyseur </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2939A </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of rna-containing exosomes

Le domaine de la recherche exosomes est en pleine expansion, avec une augmentation spectaculaire dans les publications de ces dernières années. Ces petites vésicules (30-100 nm) d&#39;origine endocytique ont d&#39;abord été proposé à fonctionner comme un moyen pour les réticulocytes pour éradiquer le récepteur de la transferrine alors maturation dans les érythrocytes 1, et ont plus tard été nommé exosomes. Les exosomes sont formées par bourgeonnement vers l&#39;intérieur des endosomes, la production de corps multivésiculaires (MVBs), et sont libérés dans l&#39;environnement par la fusion des MVBs avec la membrane plasmique 2. Depuis la première découverte d&#39;exosomes, une large gamme de cellules a été démontré que la libération de ces vésicules. Les exosomes ont également été détectés dans plusieurs fluides biologiques, y compris le plasma, liquide de lavage nasal, la salive et 3-6 le lait maternel. Par ailleurs, il a été démontré que le contenu et la fonction des exosomes dépend de la cellule d&#39;origine et les conditions dans lesquelles ils sont produits. Une variété de fonctions ont été démonsconcentré pour les exosomes, telles que l&#39;induction de la tolérance contre l&#39;allergène 7,8, l&#39;éradication des tumeurs établies chez la souris 9, l&#39;inhibition et l&#39;activation des cellules tueuses naturelles 10-12, promotion de la différenciation en cellules régulatrices T 13, la stimulation de la prolifération des cellules T 14 et l&#39;induction de l&#39;apoptose des cellules T 15. Année 2007, nous avons démontré que les exosomes libérés par les mastocytes contiennent de l&#39;ARN messager (ARNm) et microARN (miARN), et que l&#39;ARN peut être la navette d&#39;une cellule à l&#39;autre via des exosomes. Dans les cellules du destinataire, l&#39;ARNm par les exosomes navette a été montré pour être traduit en protéine, ce qui suggère une fonction de régulation de l&#39;ARN transfert 16. En outre, nous avons aussi montré que les exosomes dérivés de cellules cultivées sous stress oxydatif peut induire une tolérance contre le stress supplémentaires dans les cellules receveuses et suggèrent donc une fonction biologique de la navette exosomales ARN 17. Milieux de culture cellulaire et biologique co fluidesntain un mélange de vésicules et de jeter des fragments. Une méthode de haute qualité d&#39;isolement pour les exosomes, suivie par la caractérisation et l&#39;identification des exosomes et leur contenu, est donc crucial de distinguer les exosomes d&#39;autres vésicules et des particules. Ici, nous présentons une méthode pour l&#39;isolement des exosomes de deux milieu de culture cellulaire et des fluides corporels. Cette méthode d&#39;isolement est basé sur la centrifugation répétée et étapes de filtration, suivie d&#39;une étape d&#39;ultracentrifugation finale dans laquelle les exosomes sont culottées. Important d&#39;identifier les méthodes les exosomes et de caractériser la morphologie et la teneur en protéines exosomales sont mis en évidence, y compris la microscopie électronique, cytométrie en flux et Western blot. La purification de l&#39;ARN total exosomales est basée sur la chromatographie colonne de centrifugation et le rendement exosomales ARN et la distribution de taille est analysé en utilisant un bioanalyseur.

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Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Ce document démontre des méthodes pour l&#39;isolement, la purification et la détection des exosomes, ainsi que des techniques d&#39;analyse de leur contenu moléculaire. Ces méthodes sont adaptables pour l&#39;isolement des deux exosomes milieux de culture cellulaire et les fluides biologiques, et peut-delà de l&#39;analyse de contenu moléculaire également être utile dans les études fonctionnelles.

Isolement et caractérisation de l&#39;ARN-Contenant exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

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99.1K vues.  University of Gothenburg. Ce document démontre des méthodes pour l'isolement, la purification et la détection des exosomes, ainsi que des techniques d'analyse de leur contenu moléculaire. Ces méthodes sont adaptables pour l'isolement des deux exosomes milieux de culture cellulaire et les fluides biologiques, et peut-delà de l'analyse de contenu moléculaire également être utile dans les études fonctionnelles.

Vidéo: Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Génération d&#39;ADN / ARN hybrides d&#39;ADN génomique par la transformation en utilisant l&#39;ARN contenant Oligonucléotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Recherche

Biologie

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation &amp; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

Isolement et caractérisation de Hoechst Faible CD45 Négatifs Souris Cellules souches mésenchymateuses du poumon

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolement, culture et caractérisation fonctionnelle des adultes Cardiomyoctyes souris

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Isolement et caractérisation de microvésicules dans le sang périphérique

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Isolement et caractérisation des fibroblastes cardiaques adultes et des myofibroblastes

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

Isolement et caractérisation d’exosomes à partir de fibroblastes musculaires squelettiques

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Isolement et caractérisation des cellules endothéliales sinusoïdales primaires du foie de souris

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. Studying the structure and composition of phycobilisome is of great interest to scientists because it reveals the evolution and divergence of photosynthesis in cyanobacteria. This protocol provides a detailed and optimized method to break cyanobacterial cells at low cost by a bead-beater efficiently. The intact phycobilisome can then be isolated from the cell extract by sucrose gradient ultracentrifugation. This method has demonstrated being suitable for both model and non-model cyanobacteria with different cell types. A step-by-step procedure is also provided to confirm the integrity and property of phycobiliproteins by 77K fluorescence spectroscopy and SDS-PAGE stained by zinc sulfate and Coomassie Blue. The isolated phycobilisome can also be subjected to further structural and compositional analyses. Overall, this protocol provides a helpful starting guide that allows researchers unfamiliar with cyanobacteria to quickly isolate and characterize intact phycobilisome.

The current protocol details the isolation of phycobilisomes from cyanobacteria by centrifugation through a discontinuous sucrose density gradient. The fractions of intact phycobilisomes are confirmed by 77K fluorescent emission spectrum and SDS-PAGE analysis. The resulting phycobilisome fractions are suitable for negative staining of TEM and mass spectrometry analysis.

Isolement et caractérisation du phycobilisome intact chez les cyanobactéries

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential biotechnology models. Recent work has demonstrated that both marine and freshwater cyanobacteria produce extracellular vesicles -&#160;small membrane-bound structures released from the outer surface of the microbes. While vesicles likely contribute to diverse biological processes, their specific functional roles in cyanobacterial biology remain largely unknown. To encourage and advance research in this area, a detailed protocol is presented for isolating, concentrating, and purifying cyanobacterial extracellular vesicles. The current work discusses methodologies that have successfully isolated vesicles from large cultures of Prochlorococcus, Synechococcus, and Synechocystis. Methods for quantifying and characterizing vesicle samples from these strains are presented. Approaches for isolating vesicles from aquatic field samples are also described. Finally, typical challenges encountered with cyanobacterial vesicle purification, methodological considerations for different downstream applications, and the trade-offs between approaches are also discussed.

The present protocol providesdetailed descriptions for isolation, concentration,and characterization of extracellular vesicles from cyanobacterial cultures. Approaches for purifying vesicles from cultures at different scales, trade-offs among methodologies, and considerations for working with field samples are also discussed.

Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires cyanobactériennes

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation and Characterization of the Immune Cells from Micro-dissected Mouse Choroid Plexuses

The brain is no longer considered as an organ functioning in isolation; accumulating evidence suggests that changes in the peripheral immune system can indirectly shape brain function. At the interface between the brain and the systemic circulation, the choroid plexuses (CP), which constitute the blood-cerebrospinal fluid barrier, have been highlighted as a key site of periphery-to-brain communication. CP produce the cerebrospinal fluid, neurotrophic factors, and signaling molecules that can shape brain homeostasis. CP are also an active immunological niche. In contrast to the brain parenchyma, which is populated mainly by microglia under physiological conditions, the heterogeneity of CP immune cells recapitulates the diversity found in other peripheral organs. The CP immune cell diversity and activity change with aging, stress, and disease and modulate the activity of the CP epithelium, thereby indirectly shaping brain function. The goal of this protocol is to isolate murine CP and identify about 90% of the main immune subsets that populate them. This method is a tool to characterize CP immune cells and understand their function in orchestrating periphery-to-brain communication. The proposed protocol may help decipher how CP immune cells indirectly modulate brain function in health and across various disease conditions.

This study uses flow cytometry and two different gating strategies on isolated perfused mice brain choroid plexuses; this protocol identifies the main immune cell subsets that populate this brain structure.

Isolement et caractérisation des cellules immunitaires des plexus choroïdes de souris micro-disséqués

The brain is no longer considered as an organ functioning in isolation; accumulating evidence suggests that changes in the peripheral immune system can ...