Traditionnellement, les macrophages ont été difficiles à étudier dans les analyses de chimiotaxis en temps réel parce que les cellules se déplacent lentement. Ce protocole fournit un moyen d’image macrophages migrant dans un gradient chemotactic pour un jusqu’à six heures ou plus. Comparée aux essais d’implant tels que des essais de transfert, cette technique a les avantages que la morphologie de macrophage peut être observée, et des paramètres tels que la vitesse cellulaire et l’efficacité chemotactic peuvent être mesurés.
Les macrophages sont impliqués dans de nombreuses maladies inflammatoires, et cette technique peut être utile pour étudier les médicaments conçus pour inhiber la chimiotaxis. Il peut également être appliqué à d’autres types de cellules telles que les monocytes humains. Lorsque vous essayez cette technique pour la première fois, il est préférable de pratiquer le remplissage des chambres de chimiotaxis avant de travailler avec les cellules.
Un des aspects les plus importants de la technique est l’évitement des bulles d’air. Commencez par pré-remplir les canaux de connexion d’une ou deux diapositives de chimiotaxis avec rpmi modifié 1640 HEPES Medium préparé selon les instructions manuscrites. Placez une glissade dans un plat de culture cellulaire et placez le plat sur un bloc d’aluminium chauffé à 37 degrés Celsius.
Puis insérez des bouchons dans les ports 1 et 4. Utilisez une pointe de pipet biseauté de 200 microlitres pour déposer 15 microlitres du RPMI 1640 HEPES Medium modifié dans le port de remplissage trois. Ensuite, insérez la pointe pipet dans le port deux, et aspirez 15 microlitres à un rythme modérément rapide, ce qui pré-remplira le canal de raccordement ainsi que les deux canaux d’approvisionnement flanquants.
Couvrez les ports de remplissage deux et trois avec des bouchons et placez la glissière de chimiotaxis sur un support dans une chambre d’humidité fermée dans un incubateur autrement sec et sans dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Pour isoler les macrophages, insérez un cathéter en plastique de calibre 24 dans la cavité péritonéale d’une souris sacrifiée de trois à quatre mois, et utilisez une seringue en plastique de cinq millilitres pour la lavage de la cavité avec la solution de sel tamponné de Hank sans calcium ni magnésium. Après avoir recueilli le milieu lavaged dans un tube, centrifuger à 300 fois G pendant 6,5 minutes.
Jetez le supernatant, et re-suspendre les cellules dans 200 microlitres de RPMI modifié 1640 milieu. Diluer un aliquot de la suspension des cellules un à 20. Ensuite, utilisez un dispositif de comptage pour compter les cellules.
Diluer les cellules à une concentration finale de 10 fois 10 à six cellules par millilitre, et les maintenir à 37 degrés Celsius dans un bloc d’aluminium chauffé. Pipet la suspension cellulaire de haut en bas cinq fois pour réduire l’agglutination, et déposer doucement 10 microlitres sur le port trois de la chambre de chimiotaxis. Placez la pointe pipet dans le port deux, et tirez lentement la suspension de la cellule dans le canal de raccordement.
Dès que la suspension cellulaire a été introduite, retirez les bouchons aux ports un et quatre pour arrêter le flux et placez des bouchons sur les quatre ports de remplissage. Ensuite, placez les glissières de chimiotaxis dans la chambre d’humidité de 37 degrés Celsius pendant deux à trois heures. Inspecter la zone d’observation à l’aide d’un microscope inversé.
Ensuite, placez les bouchons dans les ports de remplissage un et deux, et vérifiez si le port de remplissage trois est rempli vers le haut avec moyen, et exempt de bulles d’air. Si nécessaire, utilisez une aiguille stérile de seringue de calibre 27 pour déloger les bulles d’air. Ensuite, aspirez 60 microlitres de milieu avec un tuyaut mécanique de 100 microlitres, et placez la pointe dans le port de remplissage trois.
Utilisez l’anneau de réglage du volume pour injecter lentement et régulièrement le milieu dans le réservoir jusqu’à ce qu’il atteigne le sommet du port de remplissage quatre après une à deux minutes. Pour remplir le deuxième réservoir, déplacez le bouchon du port un et insérez-le lentement dans le port trois. Aspirer 50 microlitres de milieu, et placer la pointe pipet dans le port quatre, et injecter lentement le milieu dans le deuxième réservoir de sorte qu’il atteigne le sommet du port de remplissage un après une à deux minutes.
Ajouter 495 microlitres de milieu à un tube de micro-centrifugeuse de deux millilitres et ajouter cinq microlitres de cinq bleu verni. Vortex brièvement le mélange, puis ajouter 5,4 microlitres de Recombinant Mouse Complement C5a et vortex à nouveau pour mélanger. Assurez-vous que la dépression peu profonde au sommet du port 1 est sans moyen, et déposez 15 microlitres du complément bleu C5a contenant du milieu.
Insérez ensuite une pointe de pipet de 200 microlitres dans le port de remplissage quatre, et faites pivoter lentement l’anneau de réglage du volume pour attirer le milieu dans le réservoir opposé. Attirez l’air dans la courte colonne verticale du port de remplissage jusqu’à ce que l’interface fluide-air soit à mi-chemin dans la colonne. Puis branchez le port un avant de soulever doucement la pipet du port quatre, en s’assurant que la glissière reste en place, et branchez lentement le port quatre.
Pour effectuer l’imagerie par laps de temps, placez la diapositive chimiotaxis sur la scène d’un microscope inversé équipé d’un incubateur de scène, et imagez la zone d’observation avec une lentille objective de contraste de phase 10X, en se concentrant sur le macrophage lamellipodia. La diapositive chimiotaxis utilisée pour la microscopie vidéo time lapse des macrophages péritonéaux de souris a trois chambres de chimiotaxis, chacune d’entre eux a quatre ports de remplissage. Des cellules ont été ensemencées dans la zone d’observation de chaque chambre.
Et après une incubation de deux à trois heures, les chambres étaient lentement remplies de médium. Lorsque les cellules de la zone d’observation ont été inspectées, jusqu’aux deux tiers des cellules avaient été emportées. En général, les cellules B-1 faiblement adhérentes ont été lavées, et les cellules restantes étaient principalement des macrophages.
Pour distinguer les macrophages des cellules B, des cellules fraîchement isolées ont été étiquetées avec des anticorps spécifiques. Les macrophages ont été étiquetés avec la fluorescence verte, les cellules B avec le rouge, et les noyaux cellulaires avec le bleu. La migration des macrophages a été étudiée en introduisant le complément C5a, un chimioattractant, dans l’un des deux réservoirs.
Les traces de migration des macrophages migrent dans un gradient complément C5 ont été enregistrées. Le point de départ de chaque piste de migration a été normalisé à X égale zéro et Y égale zéro pour créer une parcelle de migration. Ensuite, la vitesse cellulaire et l’efficacité chemotactique des macrophages individuels ont été calculées.
Cette technique a été utile pour étudier les rôles des sous-unités protéiques G, et rho GTPases, et la motilité macrophage dans la chimiotaxis.
