Ce travail est soutenu financièrement par la Fondation nationale suisse (PNR 64 programme, accorder aucune 4064-131232).

1. Préparation du système de perfusion <ol><li> Mettre en place le système de perfusion constitué d&#39;un bain d&#39;eau, une chambre de perfusion, deux colonnes pour l&#39;oxygénation, deux pompes péristaltiques, deux pièges à bulles, deux appareils de chauffage de flux et un capteur de pression (figure 1). Connecter ces composants avec des sections des tubes sont constitués de matières de chlorure de polyvinyle et de silicones selon le schéma de la figure 2. Enfin, il ya deux circuits représentant le circuit du fœtus et de la mère, respectivement. </li><li> Allumer le bain d&#39;eau, les chauffe-eau instantané et le chauffage de la chambre de perfusion. La température doit être 37 ° C. </li><li> Chauffer le milieu de perfusion (milieu de culture tissulaire NCTC-135 dilué 1:2 avec du tampon de Earle (6,8 g / chlorure de sodium de L, 0,4 g / l de chlorure de potassium, 0,14 g / L de phosphate monosodique, 0,2 g / l de sulfate de magnésium, 0,2 g / chlorure de calcium de l, 2 g / l de glucose) complété avec du glucose (1 g / L), le dextran 40 (10 g / L), de sérum-albumine bovine (10 g/ L), de l&#39;héparine de sodium (2,500 UI / L), amoxicilline (250 mg / L) et de bicarbonate de sodium (2,2 g / l), pH 7,4) dans le bain d&#39;eau. </li><li> Consécutivement rincer les systèmes artérielle du circuit foetal et maternel avec a) 200 ml d&#39;eau distillée, b) de 50 ml d&#39;hydroxyde de sodium à 1%, c) 1% d&#39;acide phosphorique et d) à nouveau 200 ml d&#39;eau distillée (débit: 15 - 20 ml / min). </li><li> Raccorder la canule foetal (Ø 1,2 mm; aiguille émoussée doit être attachée à un dispositif de perfusion à aiguille à ailettes modifié) au tube artériel foetal. </li><li> Rincer les systèmes artériels du circuit du fœtus et de la mère avec un milieu de perfusion jusqu&#39;à ce que tous les tubes contiennent un milieu (débit: 15-20 ml / min). Au cours de cette étape de remplir les pièges à bulles et supprimer toutes les bulles en aval du piège. Puis arrêter les pompes. Il est vraiment important que les tubes artériels afférents sont toujours libres de bulles, sinon après cathétérisme surtout les vaisseaux fœtaux fines peuvent se rompre. </li><li> Allumer le flux de gaz. Le circuit maternelle est oxygéné wie 5% de dioxyde de carbone et de 95% d&#39;air et le circuit de synthèse foetal avec 5% de dioxyde de carbone et 95% d&#39;azote. </li><li> Démarrer l&#39;enregistrement du capteur de pression. </li></ol> 2. Cannulating le placenta <ol><li> Obtenir placenta intact de grossesses sans complication terme après césarienne primaire. Le consentement écrit doit être donné (a été obtenue dans le cas de nos études) par les mères avant l&#39;accouchement et l&#39;étude doit être approuvé par le comité Éthique local (ce fut le cas dans nos études). Premier contrôle visuel doit être effectué par des sages-femmes pour assurer un placenta sain et intact. </li><li> Cannulation du placenta est une étape cruciale! Au cours de la perfusion toutes les petites perturbations dans les tissus peut conduire à une fuite entre la circulation maternelle et fœtale. Le placenta doit être obtenue dans les 30 minutes après l&#39;accouchement. </li><li> Sélectionner un cotylédons intact dans la zone marginale du placenta sans perturbations visibles du côté maternel. Lors de la plaque chorionique,attacher les deux branches associées de l&#39;artère et de la veine ombilicale en amont sur le côté de canulation tard (vers le cordon ombilical) à l&#39;aide de matériel de suture chirurgicale. Assurez-vous toujours deux noeuds. </li><li> Cathétériser l&#39;artère fœtale premier. Les artères placentaires fœtales sont toujours plus petits et plus minces que les veines. </li><li> Faire une suture autour de l&#39;artère du foetus, mais ne pas l&#39;attacher immédiatement. Tenir le récipient avec une pince, couper le navire soigneusement et mettre la petite canule (Ø 1,2 mm) dans l&#39;artère. Puis attacher le fil de suture (deux nœuds). </li><li> Procéder à la veine du fœtus de la même manière mais utiliser une plus grande canule (Ø 1,5-1,8 mm; aiguille émoussée doit être attaché à un ensemble de perfusion à aiguille à ailettes modifié). </li><li> Mettez la pompe fœtale (2 ml / min). S&#39;il n&#39;y a pas de fuite visible et le sang émane de la canule dans la veine du fœtus, augmenter lentement le débit jusqu&#39;à 4 ml / min. Observez la pression dans l&#39;artère du fœtus, il ne devrait pas dépasser 70 mmHg. Si du liquide s&#39;échappe au fœtus ou de matérne canule fixer avec un autre suture. </li><li> Placer le placenta sur le support de tissu avec la partie foetale et tirer la membrane placentaire et le tissu sur les pointes. A la fin du cotylédon perfusé doit être au milieu du trou dans le support de tissu. </li><li> Stabiliser la partie où seule la membrane détient le placenta avec une membrane de silicone (Ø 1 mm) ou bien deux morceaux de parafilm. </li><li> Assemblez le support de tissu complet, serrer les vis et couper le tissu en surplomb. Veuillez noter que le veineux et artériel canules ne sont pas coincés mais pondent dans les petits canaux du support de tissu. </li><li> Tourner le support de tissu à l&#39;envers, la mettre dans la chambre d&#39;irrigation et d&#39;ajouter le couvercle. Maintenant, du côté maternel devrait être au top. Vérifiez toujours si le circuit du fœtus est encore intact et le milieu coule sur le tuyau de la veine du fœtus. </li><li> Mettez la pompe maternelle (12 ml / min). Présentez les trois émoussé canules (Ø 0,8 mm) à ee extrémité du tube de l&#39;artère maternel dans l&#39;espace intervilleuse en pénétrant dans la plaque déciduale. Pour ramener le liquide de perfusion dans le circuit de la mère mis un tube comme vidange veineuse qui est également connecté à la pompe de la mère à la position la plus basse dans la partie supérieure de la chambre de perfusion. </li><li> Branchez la canule dans la veine du fœtus au tube de veine fœtale. </li></ol> 3. L&#39;exécution de la phase de pré-et expérimentale de perfusion <ol><li> Pour permettre au tissu de se remettre de la période ischémique après l&#39;accouchement et à débusquer le sang dans l&#39;espace intervillous, une pré-phase ouverte de 20 min est nécessaire. Cela signifie que la veine maternelle et fœtale ne sont pas menant vers le réservoir artériel contenant le milieu de perfusion. Recueillir le drainage veineux du fœtus et de la mère dans une bouteille et la jeter après la pré-phase. </li><li> Pour évaluer l&#39;intégrité de la perfusion effectuer un autre pré-phase de 20 min, mais dans un circuit fermé. Utilisez deux réservoirs séparés avec le milieu de perfusionpour le circuit du fœtus et de la mère et de fermer les circuits en menant le drainage veineux du fœtus retour dans le réservoir du fœtus et l&#39;arrière de drainage veineux de la mère dans le réservoir maternelle. </li><li> Pour l&#39;expérience de perfusion principale préparer deux flacons de 120 ml de milieu de perfusion (une pour la mère et l&#39;autre pour le réservoir foetal). Ajouter le radiolabeled 14 C-antipyrine (4 nCi / ml; sert de contrôle positif; ATTENTION: substance radioactive) et le xénobiotiques ou nanoparticules marqué par fluorescence que l&#39;on veut analyser le réservoir maternelle. Mélanger la perfusion maternelle bien. </li><li> Commencez l&#39;expérience en échangeant le milieu de perfusion pur avec les deux flacons préparés (réservoirs du fœtus et de la mère). Fermez les circuits en menant le fœtus dos de drainage veineux dans le réservoir du fœtus et l&#39;arrière de drainage veineux de la mère dans le réservoir maternelle. </li><li> Poursuivre la perfusion de 6 heures et de prendre régulièrement des échantillons. Remettre en suspension toujours le moyen de la maternelle et fœtaleréservoir avant le retrait. </li><li> Contrôler la pression dans l&#39;artère fœtale (ne doit pas dépasser 70 mm Hg), le pH dans les deux circuits (qui devrait être dans une fourchette physiologique 7,2-7,4) et le volume de deux réservoirs (perte de volume du fœtus ne doit pas dépasser 4 ml / h) pendant la perfusion . Si nécessaire, ajuster le pH à l&#39;aide soit de l&#39;acide chlorhydrique ou de l&#39;hydroxyde de sodium. </li><li> Si la perte de volume dans le réservoir du foetus est supérieure à 4 ml / h il ya une fuite dans le tissu et on doit arrêter la perfusion. Le taux de succès d&#39;une perfusion pendant 6 heures sans fuite est d&#39;environ 15-20%. </li><li> Arrêter la perfusion après 6 heures. Démouler les pompes, bain d&#39;eau, chauffe-débit et des flux de gaz. </li><li> Retirer le placenta de son support de tissu, coupez le cotylédon perfusé (plus lumineux que le tissu unperfused) et peser. </li><li> Prélever des échantillons de unperfused (partie du placenta qui a été coupé au début, pourrait être déjà pris au cours de la phase de pré-) tissus et perfusé (chacun d&#39;environ 1 g) et de les stocker à -20 ° Cjusqu&#39;à ce que l&#39;homogénéisation ou dans l&#39;azote liquide pour analyse ultérieure. Fixer un autre échantillon de tissu à 4% de formol pour l&#39;évaluation histopathologique. Les échantillons doivent inclure toutes les couches du placenta. </li><li> Nettoyer les tubes après la perfusion d&#39;un rinçage successif des systèmes artérielle du circuit foetal et maternel avec a) 200 ml d&#39;eau distillée, b) de 50 ml d&#39;hydroxyde de sodium à 1%, c) ml 1% d&#39;acide 50 phosphorique et d) à nouveau 200 ml d&#39;eau distillée (débit: 15-20 ml / min). </li></ol> L&#39;ensemble de la procédure de travail de l&#39;expérience de perfusion placenta est représenté sur la figure 3. 4. L&#39;analyse des échantillons <ol><li> Centrifuger les échantillons perfusât pendant 10 min à 800 xg avant analyse pour éliminer des érythrocytes résiduels. Prenez le surnageant pour l&#39;analyse plus loin. Les échantillons peuvent être laissés toute la nuit à 4 ° C. Pour l&#39;analyse de la production de leptine et l&#39;hCG des échantillons peuvent être conservés à -20 ° C. </li><li> Pour évaluer la perméabilité de laplacenta analyser le C-14 antipyrine par scintillation liquide. Mélanger 300 pi des échantillons fœtaux et maternels avec 3 ml cocktail de scintillation et mesure pendant 5 minutes dans un compteur bêta. </li><li> Pour évaluer le transfert des nanoparticules fluorescentes ou des xénobiotiques d&#39;intérêt lecture de la fluorescence à 485 nm d&#39;excitation et 528 nm en émission d&#39;un lecteur de microplaques (longueurs d&#39;onde indiquées sont pour l&#39;analyse de l&#39;étiquette jaune vert que nous avons utilisé pour les nanoparticules). </li><li> Pour déterminer la viabilité du tissu placentaire pendant la mesure de la perfusion de la consommation du glucose et de la production de lactate dans le circuit foetal et maternel avec un système de gaz de sang automatisé. En outre, évaluer la production des hormones placentaires choriongonadotropin humaine (hCG) et la leptine dans les échantillons de tissus homogénéisés et les perfusats par dosage immuno-enzymatique (ELISA). </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Sous la perfusion double recirculation montré ici, il ya plusieurs autres configurations expérimentales possibles en fonction de la question à laquelle il faut répondre. Perfusions placentaires particulièrement ouverts sont couramment utilisés pour évaluer la clairance du médicament à concentration stationnaire 3. La perfusion de recirculation set-up peut être également appliqué à confirmer transport actif de substances endogènes ou exogènes. Par cette approche, la même concentration de xénob...

Le placenta est un organe complexe qui est responsable de l&#39;échange de l&#39;oxygène, du dioxyde de carbone, des nutriments et des déchets, et en même temps en mesure de garder les deux circuits sanguins de la mère et le foetus croissant séparées l&#39;une de l&#39;autre. En outre, il évite le rejet de l&#39;enfant par le système immunitaire de la mère et sécrète des hormones pour maintenir la grossesse. La barrière cellulaire est formée par les cellules du cytotrophoblaste qui fusionnent et forment un véritable syncytium sans membranes cellulaires latérales 4,5. L&#39;ensemble du placenta est organisé en plusieurs cotylédons, qui contiennent un arbre villosités fœtales et représentent une unité fonctionnelle du placenta. L&#39;étude de la fonction de barrière placentaire a été intensifiée avec la découverte des malformations induites thalidomide dans les années 1960. Pour des raisons évidentes études de translocation avec les femmes enceintes ne peuvent pas être exécutées. Par conséquent, différents modèles alternatifs ont été développés 6,7 </splace&gt;. Le modèle concerné plus prometteurs et probablement le plus clinique est le modèle ex vivo placenta humain de perfusion développé par Panigel et collègues 2,3. Beaucoup de femmes sont exposées à des xénobiotiques tels que les médicaments ou les polluants de l&#39;environnement au cours de leur grossesse 8. Pour certains médicaments qui ont déjà été administrées régulièrement pendant la grossesse, des études in vivo peut être réalisée par comparaison de la concentration sanguine maternelle avec celle de sang de cordon ombilical. Cependant, il n&#39;y a généralement que des informations limitées sur la pharmacocinétique et-dynamique chez le fœtus et la tératogénicité de ces substances. Par exemple opiacés comme l&#39;héroïne facilement traverser la barrière placentaire et peut conduire à une restriction de croissance intra-utérine, accouchement prématuré ou un avortement spontané 9,10. Ainsi, en cas d&#39;abstinence disparus pendant la grossesse un traitement de substitution à la méthadone est recommandée. L&#39;exmodèle de perfusion placentaire humain in vivo a montré que le transfert de la méthadone dans la circulation foetale est négligeable 11, ce qui correspond bien au-à-maternelle rapport calculé sang de cordon de concentration de sang après l&#39;accouchement 12. La nanotechnologie est un domaine en pleine croissance notamment en médecine. Ainsi, sous le naturel fines (&lt;2,5 m de diamètre) et les particules ultrafines (&lt;0,1 m de diamètre) dans les fumées des feux de forêt, les éruptions volcaniques et dans la poussière du désert, l&#39;exposition aux nanomatériaux manufacturés (au moins une dimension &lt;0,1 um 13 ) est en augmentation. Cela a soulevé des questions sur le potentiel toxicologique des nanomatériaux manufacturés. Bien qu&#39;aucun risque humain pourrait être encore prouvé, il ya des principales études expérimentales indiquent que les nanoparticules manufacturées peuvent provoquer des réactions biologiques néfastes conduisant à des résultats toxicologiques 14. Récemment, certaines études ont montré que l&#39;exposition prénatale à l&#39;la pollution de l&#39;air est liée à un besoin respiratoire supérieur et de l&#39;inflammation des voies respiratoires chez les nouveau-nés et d&#39;enfants 15,16. En outre, les petites nanoparticules pourraient être utilisées comme vecteurs de médicaments pour traiter spécifiquement, soit le fœtus ou la mère. Par conséquent, il devient évident que des études approfondies des xénobiotiques ou des nanomatériaux distinctes et leur capacité à traverser la barrière placentaire sont nécessaires. Un aperçu réel sur les études en cours sur la perméabilité placentaire aux nanomatériaux manufacturés, est résumée dans Menezes et al. 2011 17 et Buerki-Thurnherr et al. 2012 7. Le double ex vivo recirculation modèle de perfusion placentaire humaine fournit un système contrôlé et fiable pour étudier le transport placentaire de divers endogènes et exogènes composés 3,11,12,18,19 et un large éventail d&#39;autres fonctions du placenta comme mécanismes responsables de l&#39; développement d&#39;états pathologiques comme la pré-éclampsie &lt;sup&gt; 20-22. Dans ce protocole, nous nous concentrons principalement sur la mise en place, la manipulation et un procédé qui permet l&#39;étude de l&#39;accumulation, les effets et les taux de translocation d&#39;un large éventail de xénobiotiques ou des nanoparticules.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NCTC-135 medium</td>
 <td>ICN Biomedicals, Inc.</td>
 <td>10-911-22C</td>
 <td>could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium chloride (NaCl)</td>
 <td>Sigma-Aldrich, Fluka</td>
 <td>71381</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium chloride (KCl)</td>
 <td>Hospital pharmacy</td>
 <td></td>
 <td>also possible: Sigma (P9541)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monosodium phosphate (NaH2PO4 &middot; H2O)</td>
 <td>Merck</td>
 <td>106346</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnesium sulfate (MgSO4 &middot; H2O)</td>
 <td>Sigma-Aldrich, Fluka</td>
 <td>63139</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calcium chloride (CaCl, anhydrous)</td>
 <td>Merck</td>
 <td>102388</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D(+) Glucose (anhydrous)</td>
 <td>Sigma-Aldrich, Fluka</td>
 <td>49138</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
 <td>Merck</td>
 <td>106329</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran from Leuconostoc spp.</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>31389</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
 <td>Applichem</td>
 <td>A1391</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amoxicilline (Clamoxyl)</td>
 <td>GlaxoSmithKline AG</td>
 <td>2021101A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium heparin</td>
 <td>B. Braun Medical AG</td>
 <td>3511014</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium hydoxide (NaOH) pellets</td>
 <td>Merck</td>
 <td>106498</td>
 <td>CAUTION: corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4)</td>
 <td>Merck</td>
 <td>100573</td>
 <td>CAUTION: corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2</td>
 <td>PanGas AG</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2</td>
 <td>PanGas AG</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antipyrine (N-methyl-14C)</td>
 <td>American Radiolabeled Chemicals, Inc.</td>
 <td>ARC 0108-50 &mu;Ci</td>
 <td>CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus)</td>
 <td>Zinsser Analytic GmbH</td>
 <td>1003100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polystyrene particles 80 nm</td>
 <td>Polyscience, Inc.</td>
 <td>17150</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polystyrene particles 500 nm</td>
 <td>Polyscience, Inc.</td>
 <td>17152</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water bath</td>
 <td>VWR</td>
 <td>462-7001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thermostat</td>
 <td>IKA-Werke GmbH &amp; Co. KG</td>
 <td>3164000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic pumps</td>
 <td>Ismatec</td>
 <td>ISM 833</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bubble traps (glass)</td>
 <td>UNI-GLAS Laborbedarf</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flow heater</td>
 <td>UNI-GLAS Laborbedarf</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pressure sensor + Software for analyses</td>
 <td>MSR Electronics GmbH</td>
 <td>145B5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Notebook</td>
 <td>Hewlett Packard</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Miniature gas exchange oxygenator</td>
 <td>Living Systems Instrumentation</td>
 <td>LSI-OXR</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm)</td>
 <td>Ismatec</td>
 <td>MF0028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm)</td>
 <td>Ismatec</td>
 <td>SC0744</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Blunt cannulae (&Oslash; 0.8 mm)</td>
 <td>Polymed Medical Center</td>
 <td>03.592.81</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Blunt cannulae (&Oslash; 1.2 mm)</td>
 <td>Polymed Medical Center</td>
 <td>03.592.90</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Blunt cannulae (&Oslash; 1.5 mm)</td>
 <td>Polymed Medical Center</td>
 <td>03.592.94</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Blunt cannulae (&Oslash; 1.8 mm)</td>
 <td>Polymed Medical Center</td>
 <td>03.952.82</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Parafilm</td>
 <td>VWR</td>
 <td>291-1212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass)</td>
 <td>Internal technical department</td>
 <td></td>
 <td>Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Surgical suture material (PremiCron)</td>
 <td>B. Braun Medical AG</td>
 <td>C0026005</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly)</td>
 <td>Hospira, Inc.</td>
 <td>ASN 2102</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multidirectional stopcock (Discofix C-3)</td>
 <td>B. Braun Medical AG</td>
 <td>16494C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Surgical scissors</td>
 <td>B. Braun Medical AG</td>
 <td>BC304R</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting scissors</td>
 <td>B. Braun Medical AG</td>
 <td>BC162R</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle holder</td>
 <td>B. Braun Medical AG</td>
 <td>BM200R</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting forceps</td>
 <td>B. Braun Medical AG </td>
 <td>BD215R</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Automated blood gas system </td>
 <td>Radiometer Medical ApS</td>
 <td>ABL800 FLEX</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multi-mode microplate reader</td>
 <td>BioTek</td>
 <td>Synergy HT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liquid scintillation analyzer</td>
 <td>GMI, Inc.</td>
 <td>Packard Tri-Carb 2200</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scintillation tubes 5.5 ml</td>
 <td>Zinsser Analytic GmbH</td>
 <td>3020001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue Homogenizer</td>
 <td>OMNI, Inc.</td>
 <td>TH-220</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH meter + electrode</td>
 <td>VWR</td>
 <td>662-2779 </td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

determination of the transport rate of xenobiotics and nanomaterials across the placenta using the ex vivo human placental perfusion model

Il ya le placenta humain décennies a été pensé pour être une barrière infranchissable entre la mère et l&#39;enfant à naître. Cependant, la découverte d&#39;anomalies congénitales induite par la thalidomide et de nombreuses études ultérieures ensuite prouvé le contraire. Aujourd&#39;hui, plusieurs xénobiotiques nocifs comme la nicotine, l&#39;héroïne, la méthadone ou de la drogue ainsi que des polluants environnementaux ont été décrits à surmonter cet obstacle. Avec l&#39;utilisation croissante de la nanotechnologie, le placenta est susceptible d&#39;entrer en contact avec de nouvelles nanoparticules soit accidentellement ou intentionnellement par l&#39;exposition dans le cas des applications en nanomédecine potentiels. Les données de l&#39;expérimentation animale ne peuvent être extrapolés à l&#39;homme parce que le placenta est l&#39;organe de mammifère spécifique à l&#39;espèce la plus 1. Par conséquent, l&#39;ex vivo double recirculation de perfusion placentaire humaine, développé par Panigel et al. 2 en 1967 et continuellement modifiée par Schneider et al., En 1972 3, peut servir comme un excellent modèle to étudier le transfert des xénobiotiques ou de particules. Ici, nous nous concentrons sur la double ex vivo recirculation protocole de perfusion placentaire humaine et son développement ultérieur d&#39;acquérir des résultats reproductibles. Le placenta a été obtenu après consentement éclairé des mères issus de grossesses simples terme subissant une césarienne. Les vaisseaux du fœtus et de la mère d&#39;un cotylédon intact ont été canules et perfusés au moins pendant cinq heures. En tant que particule de modèle de particules de polystyrène marquées par fluorescence avec des tailles de 80 et 500 nm de diamètre, ont été ajoutés au circuit maternelle. Les particules de 80 nm ont été capables de traverser la barrière placentaire et fournir un exemple parfait d&#39;une substance qui est transférée à travers le placenta vers le foetus tandis que les particules de 500 nm ont été retenus dans le tissu placentaire ou circuit maternelle. Le modèle de la perfusion placentaire humain ex vivo est l&#39;un des rares modèles fournissent des informations fiables surle comportement de transport des xénobiotiques à une barrière tissulaire importante qui fournit des données pertinentes prédictifs et clinique.

La figure 4A montre les profils de perfusion de petites particules de polystyrène (80 nm) qui ont été transportés à travers le placenta par rapport aux particules de polystyrène plus grand (500 nm) qui n&#39;ont pas été transférés au compartiment fœtal. Chaque point de données représente la concentration moyenne des particules à l&#39;instant donné d&#39;au moins trois expériences indépendantes. Pour polystyrène nanoparticules le transfert placentaire est dépendant de la taille 1...

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Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Le<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modèle dual de la perfusion placentaire humaine recirculation peut être utilisée pour étudier le transfert des xénobiotiques et des nanoparticules à travers le placenta humain. Dans ce protocole vidéo, nous décrivons le matériel et les techniques nécessaires pour une exécution réussie d&#39;une perfusion placentaire.

Détermination de la vitesse de transport des xénobiotiques et des nanomatériaux à travers le placenta en utilisant l&#39;<em&gt; Ex vivo</em&gt; Human perfusion placentaire modèle

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

17.2K vues.  University Hospital Zurich. Le Ex vivo Modèle dual de la perfusion placentaire humaine recirculation peut être utilisée pour étudier le transfert des xénobiotiques et des nanoparticules à travers le placenta humain. Dans ce protocole vidéo, nous décrivons le matériel et les techniques nécessaires pour une exécution réussie d'une perfusion placentaire.

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Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Conception d&#39;un bioréacteur pour la pression cyclique Ex Vivo Étude des valves cardiaques aortiques

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Recherche

Bio-ingénierie

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional (3D) tissue wherein hematopoiesis is regulated by spatially organized cellular microenvironments termed niches2-4. The organization of the BM niches is critical for the function or dysfunction of normal or malignant BM5. Therefore a better understanding of the in vivo microenvironment using an ex vivo mimicry would help us elucidate the molecular, cellular and microenvironmental determinants of leukemogenesis6.
Currently, hematopoietic cells are cultured in vitro in two-dimensional (2D) tissue culture flasks/well-plates7 requiring either co-culture with allogenic or xenogenic stromal cells or addition of exogenous cytokines8. These conditions are artificial and differ from the in vivo microenvironment in that they lack the 3D cellular niches and expose the cells to abnormally high cytokine concentrations which can result in differentiation and loss of pluripotency9,10.
Herein, we present a novel 3D bone marrow culture system that simulates the in vivo 3D growth environment and supports multilineage hematopoiesis in the absence of exogenous growth factors. The highly porous scaffold used in this system made of polyurethane (PU), facilitates high-density cell growth across a higher specific surface area than the conventional monolayer culture in 2D11. Our work has indicated that this model supported the growth of human cord blood (CB) mononuclear cells (MNC)12 and primary leukemic cells in the absence of exogenous cytokines. This novel 3D mimicry provides a viable platform for the development of a human experimental model to study hematopoiesis and to explore novel treatments for leukemia.

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

A 3D culture system for hematopoiesis is described using human cord blood and leukemic bone marrow cells. The method is based on the use of a porous synthetic polyurethane scaffold coated with extracellular matrix proteins. This scaffold is adaptable to accommodate a wide range of cells.

Ex vivo Mimétisme de l&#39;hématopoïèse humaine normale et pathologique

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

A detailed understanding of the complexity and relative variability within the human cardiac venous system is crucial for the development of cardiac devices that require access to these vessels. For example, cardiac venous anatomy is known to be one of the key limitations for the proper delivery of cardiac resynchronization therapy (CRT)1 Therefore, the development of a database of anatomical parameters for human cardiac venous systems can aid in the design of CRT delivery devices to overcome such a limitation. In this research project, the anatomical parameters were obtained from 3D reconstructions of the venous system using contrast-computed tomography (CT) imaging and modeling software (Materialise, Leuven, Belgium). The following parameters were assessed for each vein: arc length, tortuousity, branching angle, distance to the coronary sinus ostium, and vessel diameter.
	CRT is a potential treatment for patients with electromechanical dyssynchrony. Approximately 10-20% of heart failure patients may benefit from CRT2. Electromechanical dyssynchrony implies that parts of the myocardium activate and contract earlier or later than the normal conduction pathway of the heart. In CRT, dyssynchronous areas of the myocardium are treated with electrical stimulation. CRT pacing typically involves pacing leads that stimulate the right atrium (RA), right ventricle (RV), and left ventricle (LV) to produce more resynchronized rhythms. The LV lead is typically implanted within a cardiac vein, with the aim to overlay it within the site of latest myocardial activation. 
	We believe that the models obtained and the analyses thereof will promote the anatomical education for patients, students, clinicians, and medical device designers. The methodologies employed here can also be utilized to study other anatomical features of our human heart specimens, such as the coronary arteries. To further encourage the educational value of this research, we have shared the venous models on our free access website: <a href="http://www.vhlab.umn.edu/atlas" target="_blank">www.vhlab.umn.edu/atlas</a>.

The objective of this research is to recreate and then access the anatomy of the human cardiac venous system using 3D reconstructions generated from contrast-computed tomography scans.

Reconstructions anatomiques du système veineux cardiaque humaine à l&#39;aide de contraste tomodensitométrie des échantillons Perfusion-fixes

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the subsequent attachment and activation of platelets, monocyte/macrophage adhesion, and inflammatory cell signaling events, leading to post-procedural complications. The Chandler Loop Apparatus is an experimental system that allows researchers to study the molecular and cellular interactions that occur when large volumes of blood are perfused over polymeric conduits. To that end, this apparatus has been used as an ex vivo model allowing the assessment of the anti-inflammatory properties of various polymer surface modifications. Our laboratory has shown that blood conduits, covalently modified via photoactivation chemistry with recombinant CD47, can confer biocompatibility to polymeric surfaces. Appending CD47 to polymeric surfaces could be an effective means to promote the efficacy of polymeric blood conduits. Herein is the methodology detailing the photoactivation chemistry used to append recombinant CD47 to clinically relevant polymeric blood conduits and the use of the Chandler Loop as an ex vivo experimental model to examine blood interactions with the CD47 modified and control conduits.

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

L&#39;utilisation de l&#39;<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Chandler boucle Appareil pour évaluer la biocompatibilité des conduits de sang polymères modifiés

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the ...

Determination of Zeta Potential via Nanoparticle Translocation Velocities through a Tunable Nanopore: Using DNA-modified Particles as an Example

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and nanoparticles. Tunable resistive pulse sensing (TRPS) is a relatively recent adaptation to RPS that incorporates a tunable pore that can be altered in real time. Here, we use TRPS to monitor the translocation times of DNA-modified nanoparticles as they traverse the tunable pore membrane as a function of DNA concentration and structure (i.e., single-stranded to double-stranded DNA).
TRPS is based on two Ag/AgCl electrodes, separated by an elastomeric pore membrane that establishes a stable ionic current upon an applied electric field. Unlike various optical-based particle characterization technologies, TRPS can characterize individual particles amongst a sample population, allowing for multimodal samples to be analyzed with ease. Here, we demonstrate zeta potential measurements via particle translocation velocities of known standards and apply these to sample analyte translocation times, thus resulting in measuring the zeta potential of those analytes.
As well as acquiring mean zeta potential values, the samples are all measured using a particle-by-particle perspective exhibiting more information on a given sample through sample population distributions, for example. Of such, this method demonstrates potential within sensing applications for both medical and environmental fields.

Here we use a polyurethane tunable nanopore integrated into a resistive pulse sensing technique to characterize nanoparticles surface chemistry via the measurement of particle translocation velocities, which can be used to determine the zeta potential of individual nanoparticles.

Détermination du potentiel Zeta via nanoparticulaires translocation Velocities à travers un accordable Nanopore: Utilisation de particules d&#39;ADN modifié comme un exemple

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular cartilage impairs its load-bearing function substantially as it experiences tremendous chemical degradation, i.e. proteoglycan loss and collagen fibril disruption. One promising way to investigate chemical damage mechanisms during OA is to expose the cartilage specimens to an external solute and monitor the diffusion of the molecules. The degree of cartilage damage (i.e. concentration and configuration of essential macromolecules) is associated with collisional energy loss of external solutes while moving across articular cartilage creates different diffusion characteristics compared to healthy cartilage. In this study, we introduce a protocol, which consists of several steps and is based on previously developed experimental micro-Computed Tomography (micro-CT) and finite element modeling. The transport of charged and uncharged iodinated molecules is first recorded using micro-CT, which is followed by applying biphasic-solute and multiphasic finite element models to obtain diffusion coefficients and fixed charge densities across cartilage zones.

We propose a protocol to investigate the transport of charged and uncharged molecules across articular cartilage with the aid of recently developed experimental and numerical methods.

Un expérimental et Finite Element Protocole pour Enquêter sur la transport des solutés neutres et chargés dans Cartilage Articulaire

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

A New Ex Vivo Model for the Evaluation of Endoscopic Submucosal Injection Material Performance

Increasing the performance of submucosal injection materials (SIMs) is important for endoscopic therapy of early gastrointestinal cancer. It is essential to establish an ex vivo model that can evaluate SIM performance accurately, for developing high-performance SIMs. In our previous study, we developed a new ex vivo model that can be used to evaluate the performance of various SIMs in detail by applying constant tension to the specimen&#39;s ends. We also confirmed that the proposed new ex vivo model allows accurate submucosal elevation height (SEH) measurement under uniform conditions and detailed comparisons of the performances of various types of SIMs. Here, we describe the new ex vivo model and explain the detailed setup methodology of this model. Since all parts of the new model were easy to obtain, the setup of the new model could be completed quickly. SEH of various SIMs could be measured more accurately by using the new model. The critical factor that determines SIM performance can be identified using the new model. SIM development speed will drastically increase after the factor has been identified.

A New Ex Vivo Model for the Evaluation of Endoscopic Submucosal Injection Material Performance

We developed a new ex vivo model that applies constant tension to the porcine gastric specimen. This development made it possible to evaluate the performance (the height and duration of the submucosal elevation) of various SIMs accurately.&#160; The detailed setup methodology of this new model is explained.

Un nouveau modèle Ex Vivo pour l’évaluation des performances matérielles Injection sous-muqueuse endoscopique

Increasing the performance of submucosal injection materials (SIMs) is important for endoscopic therapy of early gastrointestinal cancer. It is essential ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

Évaluation globale de l’efficacité et l’innocuité de la délivrance de médicaments ciblés Placenta en utilisant trois méthodes complémentaires

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically been studied in vivo in animal models showing characteristic patterns of cell migration. However, in vivo models have several limitations, including intercellular mediators that are difficult to access and analyze, as well as the inability to directly analyze human neutrophils. Because of these limitations, there is a need for an in vitro platform that studies swarming with human neutrophils and provides easy access to the molecular signals generated during swarming. Here, a multistep microstamping process is used to generate a bioparticle microarray that stimulates swarming by mimicking an in vivo infection. The bioparticle microarray induces neutrophils to swarm in a controlled and stable manner. On the microarray, neutrophils increase in speed and form stable swarms around bioparticle clusters. Additionally, supernatant generated by the neutrophils was analyzed and 16 proteins were discovered to have been differentially expressed over the course of swarming. This in vitro swarming platform facilitates direct analysis of neutrophil migration and protein release in a reproducible, spatially controlled manner.

This protocol generates bioparticle microarrays that provide spatially controlled neutrophil swarming. It provides easy access to the mediators that neutrophils release during migration and allows for quantitative imaging analysis.

Microarrays de bioparticules pour l’analyse chimiotaxique et moléculaire de l’ésaimage humaine de neutrophile in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Biofunctionalization of Magnetic Nanomaterials

Magnetic nanomaterials have received great attention in different biomedical applications. Biofunctionalizing these nanomaterials with specific targeting agents is a crucial aspect to enhance their efficacy in diagnostics and treatments while minimizing the side effects. The benefit of magnetic nanomaterials compared to non-magnetic ones is their ability to respond to magnetic fields in a contact-free manner and over large distances. This allows to guide or accumulate them, while they can also be monitored. Recently, magnetic nanowires (NWs) with unique features were developed for biomedical applications. The large magnetic moment of these NWs enables a more efficient remote control of their movement by a magnetic field. This has been utilized with great success in cancer treatment, drug delivery, cell tracing, stem cell differentiation or magnetic resonance imaging. In addition, the NW fabrication by template-assisted electrochemical deposition provides a versatile method with tight control over the NW properties. Especially iron NWs and iron-iron oxide (core-shell) NWs are suitable for biomedical applications, due to their high magnetization and low toxicity.
In this work, we provide a method to biofunctionalize iron/iron oxide NWs with specific antibodies directed against a specific cell surface marker that is overexpressed in a large number of cancer cells. Since the method utilizes the properties of the iron oxide surface, it is also applicable to superparamagnetic iron oxide nanoparticles. The NWs are first coated with 3-aminopropyl-tri-ethoxy-silane (APTES) acting as a linker, which the antibodies are covalently attached to. The APTES coating and the antibody biofunctionalization are proven by electron energy loss spectroscopy (EELS) and zeta potential measurements. In addition, the antigenicity of the antibodies on the NWs is tested by using immunoprecipitation and western blot. The specific targeting of the biofunctionalized NWs and their biocompatibility are studied by confocal microscopy and a cell viability assay.

In this work, we provide a protocol to biofunctionalize magnetic nanomaterials with antibodies for specific cell targeting. As examples, we utilize iron nanowires to target cancer cells.

Biofonctionnalisation des nanomatériaux magnétiques

Magnetic nanomaterials have received great attention in different biomedical applications. Biofunctionalizing these nanomaterials with specific targeting ...