Une application réussie de ces techniques permettra l’évaluation cinétique des essais pharmacologiques ou le passage des contaminants xénobiotiques par un placenta morphologiquement intact. La technique de perfusion du placenta des rongeurs permet un débit plus élevé d’études pharmacologiques ou toxicologiques, car plusieurs composés peuvent être évalués à l’aide du tissu d’un seul barrage. Jeanine D’Errico, étudiante de deuxième cycle de mon laboratoire, démontrera cette technique.
Avant de commencer l’intervention, remplissez doucement toutes les chambres, aiguilles, micropipettes en verre, tubes et réservoirs avec solution physiologique de sel réchauffée ou PSS, en enlevant soigneusement toutes les bulles d’air avec une pipette de transfert fine à pointes si nécessaire. Tournez tous les robinets d’arrêt à trois sens à la position hors tension pour fixer le fluide à l’intérieur des pipettes. Placez une seule cravate sur chacune des deux micropipettes en verre préparées pour la cannulation utérine et sur les deux aiguilles à pointe émoussée désignées pour la cannulation ombilicale.
Ensuite, sécurisez les liens pour éviter la perte pendant les mouvements de chambre. Après avoir confirmé un manque de réponse à la pincée d’orteil dans un jour gestationnel anesthésié 20 rat enceinte femelle, soulevez une corne utérine de l’abdomen et écartez la corne sur de longues voies, externe à l’animal. Utilisez des sutures de soie tressées pour attacher l’artère utérine aux extrémités vaginales et ovariennes de la corne, y compris l’ovaire à l’intérieur de la suture avec la corne utérine.
À l’aide de ciseaux chirurgicaux, faire des incisions sur le côté proximal de la cravate de l’ovaire et le côté distal de la cravate vaginale. Transférer la corne utérine dans un plat disséquant tapissé de caoutchouc silicone et rempli de PSS froid. Avec le côté ovaire vers la gauche et le côté vaginal vers la droite, poussez doucement une goupille disséquante à travers la corne utérine dans le caoutchouc de silicone pour stabiliser l’utérus.
Choisissez une unité fœtale de placenta maternel centrale à la corne. À l’aide de forceps fins et de ciseaux, retirer la membrane amniotique de la surface fœtale du placenta en prenant soin d’éviter le cordon ombilical. Démêler et ligate le cordon ombilical pour séparer le chiot fœtal.
Après avoir identifié l’artère et la veine ombilicales, séparez doucement et ligatez les vaisseaux ombilicaux. Puis couper la veine ombilicale légèrement plus courte que l’artère ombilicale pour faciliter l’identification. Et ligate l’artère utérine et la veine avec des ciseaux chirurgicaux.
En maintenant l’orientation correcte du flux sanguin anatomique de l’artère utérine, placez l’unité placentaire dans la chambre de récipient isolée modifiée remplie de PSS oxygéné chaud sous un microscope disséquant. À l’aide d’une paire de forceps fins dans chaque main, cannulate les extrémités proximales et distales de l’artère utérine sur les micropipettes en verre. Bien fixer l’artère avec la suture de nylon stérile précédemment placée.
Cannuler et fixer l’artère ombilicale sur l’aiguille émoussée de calibre 23. Puis cannuler et fixer la veine ombilicale sur l’aiguille émoussée de calibre 25 et remplir tous les robinets d’arrêt et les tubes pour empêcher les bulles d’air. N’oubliez pas de vérifier tous les robinets d’arrêt, canules, et tubes pour les bulles d’air, comme un bolus d’air dans le système conduira à la détresse cellulaire et d’éliminer le flux de contre-courant dans le placenta.
Connectez tous les tuyaux en fonction de la figure. Placez de petits bateaux de peseur sous la cannulation distale de l’artère utérine maternelle et sous la cannulation d’aiguille de la veine ombilicale foetale pour attraper les effluents qui émergeront au cours de la procédure. Préparer la plaque de collecte pour les effluents pour une analyse ultérieure.
Ouvrez le robinet d’arrêt pour permettre le flux de liquide à travers le tube vers le placenta et allumez la pompe périssaltique, le contrôle de la pression et le moniteur de pression. Augmentez lentement la pression à 80 millimètres de mercure lu sur le moniteur de pression. Ouvrez lentement le robinet d’arrêt pour permettre le flux de liquide vers l’artère utérine.
Remplissez tous les réservoirs pour maintenir le volume de fluide tout au long de l’expérience. Une fois que les tissus se sont équilibrés pendant 30 minutes pour permettre à la vascularisation de s’adapter au nouveau flux de liquide, établissez la perfusion de base en recueillant les effluents pendant 10 minutes à partir des deux bateaux de pesage. Mesurer le volume de liquide qui émerge à travers l’artère utérine et la veine ombilicale.
À la fin de la période de collecte de base, administrer le traitement expérimental dans l’artère utérine. Puis prélever des échantillons de l’artère utérine distale et des effluents ombilicaux fœtaux toutes les 10 minutes pendant un total de 180 minutes après l’infusion. Mesurer les contaminants dans les échantillons de liquide.
Perfusion avec colorant bleu Evans pour tester le système et visualiser la fonction appropriée de barrière liquide et placentaire pour empêcher le transfert de contaminants dans le compartiment fœtal révèle que le colorant atteint et perfusé le tissu placentaire dans ce système. Après une enquête plus approfondie, il est clair que le colorant bleu Evans n’est pas entré dans la veine ombilicale fœtale, ce qui est prévu, comme le colorant bleu Evans est lié à l’albumine. Dans cette expérience représentative, un transfert réduit de fluide au compartiment foetal dans les 10 minutes de l’infusion de polystyrène a été identifié.
Le transfert en polystyrène dans le compartiment fœtal a ensuite culminé à 20 minutes et s’est poursuivi pendant 90 minutes. La chose la plus importante à retenir pendant la cannulation est d’aller lentement. Les pipettes et les tissus sont très délicats et peuvent facilement devenir cassés ou déchirés.
En pesant l’effluence, cette méthodologie pourrait être utilisée pour étudier la physiologie placentaire ainsi que la translocation matérielle.
