1. Modification des polymères surfaces avec recCD47 REMARQUE:. Le protocole est résumé schématiquement à la figure 1 Figure 1A illustre la génération de surfaces polymères réagissant avec un thiol Figure 1B illustre génération de thiol-réactive recCD47.. <ol><li> Jour 1 <ol><li> Préparer une solution de PDT-BzPh (1 mg / ml) et du bicarbonate de potassium (KHCO 3) (0,7 mg / ml) dans de l&#39;eau stérile. Agiter pendant une nuit à 4 ° C (abri de la lumière). </li></ol></li><li> Jour 2 <ol><li> Couper tube polymère en 40 cm de long morceaux (assez longtemps pour s&#39;adapter autour de rotation des roues). </li><li> Faire tremper les tubes dans une solution aqueuse à 0,1% de hexacylpyridinium pendant 90 min à température ambiante sur un agitateur ou en boucle Dispositif Chandler. Rincer les tubes avec 3x d&#39;eau stérile après 90 minutes de trempage. </li><li> Acidifier la solution de la PDT-BzPh du jour 1 en ajoutant 15% de potassium aqueux phosphate monosodique (KH 2 </sub&gt; PO 4). Ajouter 50 ul KH 2 PO 4 par ml de PDT-BzPh, formant une solution micellaire nuageux. </li><li> Faire tremper les tubes dans la solution PDT-BzPh acidifiée pendant 40 min à température ambiante sur un agitateur ou sur un appareil. </li><li> Rincer les tubes avec de l&#39;acide acétique dilué (1: 1000) une fois. </li><li> Exposer les tubes à rayons UV pour une durée totale de 60 minutes. Tournez tubes ¼ de tour toutes les 15 min pour irradier la totalité de la surface. </li><li> Tremper les tubes dans une solution de 20 mg / ml de bicarbonate de potassium (KHCO 3) pendant 20 min à température ambiante sur un agitateur ou sur un appareil. </li><li> Rincer les tubes avec 3x de l&#39;eau stérile et conserver à 4 ° C dans de l&#39;eau stérile. </li></ol></li><li> Jour 3 <ol><li> Dissolvez 5 mg sulfo-SMCC dans 200 ul diméthylformamide (DMF) (Attention: Effectuez en hotte). </li><li> Ajouter 50 ul de la solution de sulfo-SMCC préparée à l&#39;étape 1 à 0,1 mg / ml de solution de poly-lysine recCD47, et remuer pendant 60 min à rotempérature om. </li><li> Pendant 60 min remuer, dégazer stérile saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) et mettre de côté. </li><li> Purifier sulfo-SMCC a réagi recCD47 en utilisant une colonne de dessalage 7K de poids moléculaire de coupure de spin selon les instructions du fabricant. Recueillir finale écoulement (thiol-réactive de grande qualité recCD47) et diluer à un volume nécessaire pour revêtir l&#39;intérieur du tube avec du DPBS. </li><li> Rincer les tubes du jour 2 avec stérile, dégazée DPBS 3x. </li><li> Réagir la surface modifiée des tubes avec une solution de 20 mg / ml de tris (2-carboxyéthyl) phosphine chlorhydrate (TCEP) dans du DPBS dégazés pendant moins de 2 minutes. Rincer les tubes avec stérile dégazé DPBS 4x. </li><li> Ajouter le recCD47 Sulfo-SMCC-réagi dans les tubes et laisser incuber pendant une nuit à 4 ° C sur un agitateur ou sur un appareil. </li></ol></li></ol> 2 immunologique de quantification sur des surfaces modifiées recCD47 <ol><li> Rincer tubes modifiés pour être quantifié à partir de 3 jours d&#39;esprith DPBS 3x. tubes de magasins pas utilisées pour la quantification dans DPBS à 4 ° C. </li><li> Utilisez une biopsie poinçon de 4 mm pour réaliser des échantillons de tubes en double et placer pinces à biopsie dans les puits d&#39;une plaque de 96 puits. </li><li> Préparer un contrôle négatif constitué par un échantillon de tube non modifié n&#39;est pas traité avec l&#39;anticorps de détection. Préparation d&#39;un anticorps de contrôle constitué d&#39;un échantillon de tube non modifié traité avec l&#39;anticorps de détection. Préparation des échantillons d&#39;essai de tubes modifiés traités avec l&#39;anticorps de détection. </li><li> Des échantillons de bloc avec 0,4% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) dans du DPBS pendant 60 minutes à température ambiante sur un agitateur. </li><li> Après blocage, aspirer BSA et rinçage avec une solution saline tamponnée au tris plus 1% (TBST) 3x-Tween 20, 10 minutes à chaque fois sur un agitateur. </li><li> Préparer une dilution de travail de l&#39;anticorps dans 0,4% de BSA selon la dilution recommandée par le fabricant pour les immunoessais. Diluer l&#39;anticorps CD47 humain-FITC B6H12 1: 100 dans 0,4% de BSA. </li><li> Ajouter 200 ul de dilution d&#39;anticorps dans les puits appropriés. Incubatémoins négatifs TE avec 0,4% de BSA seulement. Incuber à température ambiante pendant 60 min sur un agitateur (abri de la lumière). </li><li> Rincer avec du TBST 3x, 10 min chacun sur un agitateur. Aspirer le dernier TBST rinçage et ajouter 200 DPBS ul aux puits d&#39;échantillons de tube. </li><li> Recueillir le dernier flux continu, qui est un thiol réactif de qualité CD47 recombinant et diluer à un volume nécessaire pour revêtir l&#39;intérieur des tubes avec du DPBS. </li><li> Lire FITC intensité de signal en utilisant un lecteur de microplaques avec FITC excitation (485 nm) et d&#39;émission (538 nm) paramètres. </li><li> Calculer recCD47 lié à surface polymère sur la base de valeurs standards, ce qui représente pour l&#39;auto-fluorescence et de la liaison non spécifique de l&#39;échantillon de contrôle d&#39;anticorps. </li></ol> Protocole de Appareil 3. Chandler boucle Cherchez Institutional Review Board (IRB) l&#39;approbation d&#39;un protocole de collecte de sang et éclairé documents de consentement avant le début de la collecte des échantillons de sang humain. Obtenir infosrmé consentement d&#39;un donneur de sang humain. REMARQUE: Un diagramme représentant le dispositif est représenté sur la figure 2. <ol><li> Remplir un bain d&#39;eau avec de l&#39;eau distillée jusqu&#39;à environ 1/2 du diamètre des roues sont submergés. Ajouter suffisamment d&#39;eau de Javel pour le bain d&#39;eau pour obtenir une solution d&#39;eau de Javel à 10%. Set bain d&#39;eau à 37 ° C et laisser s&#39;équilibrer à la température. </li><li> Rassemblez adaptateurs métalliques (voir figure 1B), des tubes et des tuyaux non modifiée modifié, et assembler autour des roues de l&#39;appareil, comme le montre la figure 1C. Assurez-vous que le tube est bien ajusté autour de la roue avec l&#39;adaptateur métallique en place. </li><li> Obtenir 30 ml d&#39;échantillon de sang en utilisant un protocole approuvé par l&#39;IRB, dans un flacon pré-rempli avec 2 ml de citrate ou un autre anticoagulant, et mélanger par inversion une fois pour empêcher la coagulation de l&#39;échantillon a été collecté. </li><li> Ajouter environ 10 ml de sang de chaque tube en utilisant la soupape de métal et d&#39;une seringue, ce qui laisse un peu d&#39;air dans le tube. Fixer le bouchon de la valve et rOtate pendant 3 heures. </li><li> Drainer le sang dans un bécher de déchets traités avec une solution d&#39;eau de Javel à 10% (ou tel que requis par la politique institutionnelle). </li><li> Rincer délicatement l&#39;intérieur du tube avec du DPBS pour éliminer toute trace de sang. Recueillir accréditives dans le bécher de déchets. Disposer de sang conformément à la politique institutionnelle. </li><li> Désinfecter l&#39;appareil et tout contact avec le sang des surfaces en utilisant une solution d&#39;eau de Javel à 10% ou conformément à la politique institutionnelle. </li><li> Traitement des échantillons pour la microscopie électronique à balayage ou microscopie à fluorescence comme décrit ci-dessous. </li></ol> 4. microscopie à fluorescence et Comptage des cellules <ol><li> Préparer un 4% de paraformaldéhyde (PFA) solution (Attention: Effectuez en hotte). </li><li> Incuber les tubes dans une solution de PFA à 4% pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Après une nuit d&#39;incubation, retirer 4% PFA et rincer films très doucement avec du DPBS. </li><li> Couper le tube en sections pour exposer la surface de lumière de coloration. </li><li> Stainune section de la tubulure avec quelques gouttes de milieu de montage avec 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 30 min à température ambiante (abri de la lumière). Après coloration, rincer la tubulure très doucement avec du DPBS à réduire signal de DAPI de fond. </li><li> L&#39;image en utilisant un microscope à fluorescence équipé d&#39;un filtre DAPI et un appareil photo numérique pour compter le nombre de cellules dans neuf champs de vue sélectionnés en aveugle sous un grossissement de 200X. </li><li> cellule d&#39;enregistrement compte par le champ de vision et d&#39;effectuer des analyses statistiques appropriées pour déterminer la signification statistique des résultats. </li></ol> 5. microscopie électronique à balayage <ol><li> Préparer une solution de glutaraldéhyde à 2% (Attention: Effectuez en hotte). </li><li> Incuber les tubes dans une solution de glutaraldéhyde à 2% pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Après une nuit d&#39;incubation, rincer délicatement le tube 3x avec du DPBS. </li><li> Préparer une solution à 1% de tétroxyde d&#39;osmium (Attention: Grave danger d&#39;inhalation! Utiliser dans une hotte). </li><li> Incuber les tubes dans une solution à 1% de tétroxyde d&#39;osmium pendant 15 minutes à température ambiante. </li><li> Rincer délicatement le tube 3x avec du DPBS. </li><li> Préparer une série de concentrations d&#39;éthanol (25%, 50%, 75%, 95% et 100% d&#39;éthanol). </li><li> Déshydrater la tubulure par une incubation dans la série de concentrations d&#39;éthanol. Incuber à 25%, 50%, 75% et 95% d&#39;éthanol pendant 20 min chacun. Incuber à 100% d&#39;éthanol pendant 30 min. </li><li> Point supercritique sécher le tube avec du CO 2 pendant 45 min pour éliminer toute trace d&#39;humidité. </li><li> Sections de tubes de montage sur un bout de l&#39;échantillon avec de la pâte d&#39;argent ou graphite. </li><li> sections de tubes Coat avec 12,5 nm d&#39;or-palladium. </li><li> Examiner dans un microscope électronique à balayage. </li></ol>

<ol>
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F., de Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+modified+chandler,+roller+pump,+and+ball+valve+circulation+models+for+in+vitro+testing+in+high+blood+flow+conditions:+application+in+thrombogenicity+testing+of+different+materials+for+vascular+applications.">Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications.</a> Int J Biomater. 2012, (2012).</li></ol>

Recherche présentée dans cette publication a été soutenue par l&#39;Institut national d&#39;imagerie biomédicale et bio-ingénierie, sous le numéro d&#39;attribution R21 EB015612 (SJS) et le National Heart, Lung, and Blood Institute, sous le numéro d&#39;attribution T32 HL007915 (JBS et RJL), de la National Institut de la santé.

La chimie de photoactivation (résumé à la figure 1) permet la modification de pratiquement n&#39;importe quelle surface du polymère qui a des hydrocarbures suffisantes pour faciliter PDT-BzPh fixation et l&#39;irradiation UV subséquente de photo-activer la PDT-BzPh. La fonctionnalisation de la surface polymère avec des groupes thiol réactifs permet la fixation ultérieure de toute une série de molécules d&#39;intérêt testables. Dans nos études particulières, nous avons choisi recombinant CD...

De nombreuses procédures cliniques, tels que la circulation extracorporelle et de dialyse rénale, nécessitent l&#39;utilisation de conduits sanguins polymères et sont souvent associés à des complications post-procédure 1. Lorsque perfusé avec du sang, ces polymères illicite la réaction de corps étranger (FBR), résultant en adsorption des protéines et des plaquettes sanguines, des monocytes / macrophages adhérence, et la libération de cytokines pro-inflammatoires, qui contribuent tous complications post-procédure et / ou défaillance de l&#39;appareil 2,3. Ainsi, les stratégies pour résoudre ce problème restent un domaine important et continu de recherche sur les biomatériaux. Les enquêteurs ont tenté de résoudre ce problème en modifiant les surfaces en contact avec le sang ou bioactifs bioinertes molécules 4-6. Recherche dans notre laboratoire a mis l&#39;accent sur l&#39;ajout de CD47 recombinant (recCD47) de biomatériaux polymères comme une stratégie pour atténuer la FBR et augmenter l&#39;efficacité de ces matériaux. CD47 est un transmembr exprimée de manière ubiquitaireprotéine ane avec un rôle connu dans l&#39;évasion immunitaire, conférant le statut de «soi» sur des cellules exprimant 7-10 et présente des résultats prometteurs à conférer biocompatibilité lorsqu&#39;elle se rapporte à des surfaces polymères 11-13. Signal alpha-protéine de régulation (SIRPα), le récepteur apparenté pour le CD47, et un élément de motif d&#39;inhibition à base de tyrosine d&#39;immunorécepteur (ITIM) contenant famille de protéines transmembranaires, est exprimé sur les cellules d&#39;origine myéloïde 14. Nous avons précédemment démontré que CD47, par l&#39;intermédiaire de la signalisation cellulaire médiée par SIRPα, régule à la baisse les réponses immunitaires à de polyuréthane (PU) et le chlorure de polyvinyle (PVC) dans in vitro, ex vivo et in vivo dans des modèles de 11 à 13. Au cœur de nos enquêtes est relativement nouveau en chimie des photoactivation, décrit ici, dans lequel les groupes thiol chimiquement réactifs sont ajoutés de manière covalente à un tube polymère en faisant réagir le tube avec un polymère multifonctionnel (PDT-BzPh), composée de 2-pyridyldithio (PDT), la benzophénone photo-réactif (BzPh) et une polyallylamine carboxy modifié 11-13. La réduction des groupes PDT annexés covalente avec le tris (2-carboxyéthyl) phosphine chlorhydrate (TCEP) 11 donne une surface thiolé qui peut être ensuite mis à réagir avec des fragments thérapeutiques. Détaillées ici précédemment et 12,13, recCD47, en outre modifié par l&#39;addition d&#39;une queue poly-lysine C-terminal 12,13, est mis à réagir avec le sulfosuccinimidyl-4-[N -maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) pendant 1 heure pour produire des groupes thiol réactifs, ce qui permet une formation d&#39;une liaison entre le tube monosulfure et recCD47 11. La capacité anti-inflammatoire des surfaces CD47 fonctionnalisés a été testé, ex viv o, en utilisant l&#39;appareil Chandler boucle avec du sang humain total, qui a été décrite à l&#39;origine en 1958 comme un modèle in vitro de la coagulation thrombotique 15. L&#39;appareil repose sur unSystème de tube fermé partiellement rempli d&#39;air et un moteur rotatif pour faire circuler le sang à travers la tubulure 15. Ce modèle expérimental offre la possibilité d&#39;étudier l&#39;effet de l&#39;exposition du sang à des surfaces modifiés et non modifiés, ainsi que l&#39;effet de ces modifications de surface sur la physiologie des cellules du sang. recCD47 peut être ajouté à une variété de surfaces de polymères à l&#39;aide de cette chimie de photoactivation, et sa capacité anti-inflammatoire peut être évaluée en utilisant un modèle ex vivo cliniquement pertinente imitant la perfusion sanguine sur des surfaces polymériques 11,12. Grade clinique conduits sanguins modifiés avec recCD47 montrent nettement moins plaquettaire et la fixation des cellules inflammatoires par comparaison à des polymères non modifiés lors d&#39;une exposition à du sang humain dans le dispositif. Une description étape par étape de ce processus de modification est détaillée ci-dessous.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:107px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:251px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">16% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:107px;">58906</td>
			<td>Caution! Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">25% Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">AAA17876-AP&#160;</td>
			<td>Caution! Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH)</td>
			<td style="width:175px;">Synthesized in lab</td>
			<td style="width:107px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Citrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">S5770-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Digital Camera</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:107px;">DC500</td>
			<td>Out of production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dimethylformamide (DMF)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">270547-100ML</td>
			<td>Caution! Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:175px;">Gibco/Life Technologies</td>
			<td style="width:107px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fluorescent Microscope</td>
			<td style="width:175px;">Nikon</td>
			<td style="width:107px;">TE300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;">A38-212</td>
			<td>Caution! Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Human CD47 (B6H12) &#8211; FITC Antibody</td>
			<td style="width:175px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:107px;">SC-12730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Osmium Tetroxide</td>
			<td style="width:175px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:107px;">197450050</td>
			<td>Caution! Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Potassium Bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">237205-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit)</td>
			<td style="width:175px;">Terumo Cardiovascular Systems</td>
			<td style="width:107px;">60050</td>
			<td>Most clinical-grade tubing will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JSM-T330A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:269px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:269px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:175px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:107px;">Spectramax Gemini EM&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sulfo-SMCC</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M6035-10MG</td>
			<td>Moisture Sensitive!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:107px;">20491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:269px;">Tris Base</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td>T1503-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:269px;">Tween-20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Vectashield with DAPI</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;">H-1200</td>
			<td>Light sensitive!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Zeba Spin Desalt Columns &#8211; 7K MWCO</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:107px;">89891</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of the ex vivo chandler loop apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits

La réaction de corps étranger se produit lorsqu&#39;une surface synthétique est introduit dans le corps. Il est caractérisé par l&#39;adsorption de protéines du sang et la fixation subséquente et l&#39;activation des plaquettes, des monocytes / macrophages adhérence, et les événements de signalisation des cellules inflammatoires, ce qui conduit à des complications post-procédure. L&#39;Appareil Chandler Loop est un système expérimental qui permet aux chercheurs d&#39;étudier les interactions moléculaires et cellulaires qui se produisent lorsque de grandes quantités de sang sont perfusés sur des conduites polymériques. A cet effet, ce dispositif a été utilisé comme un modèle ex vivo permettant d&#39;évaluer les propriétés anti-inflammatoires des différentes modifications de surface polymère. Notre laboratoire a montré que les conduits sanguins, modifiées de façon covalente par photoactivation chimie avec CD47 recombinant, peuvent conférer à la biocompatibilité des surfaces polymères. L&#39;ajout de CD47 sur des surfaces polymères pourrait être un moyen efficace de promouvoir l&#39;efficacité de conduits sanguins polymères. Sonein est la méthodologie en détail la chimie de photoactivation utilisé pour ajouter CD47 recombinant à des conduits sanguins cliniquement pertinentes polymères et l&#39;utilisation de la boucle de Chandler comme un modèle expérimental ex vivo pour étudier les interactions de sang avec le CD47 modifiée et de contrôle des conduits.

Génération de surfaces polymères réagissant avec un thiol par l&#39;utilisation de la PDT et TCEP-BzPh avec un groupe thiol réactif recCD47 poly-lysine en utilisant SMCC permet la fixation de recCD47 à des surfaces polymères. Le processus de modification est résumé schématiquement sur ​​la figure 1. L&#39;avantage de ce procédé de modification est qu&#39;elle peut être appliquée à de nombreuses protéines différentes et de nombreuses surfaces polymères différents, en supposant que ...

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The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

L&#39;utilisation de l&#39;<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Chandler boucle Appareil pour évaluer la biocompatibilité des conduits de sang polymères modifiés

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

11.5K vues.  The Children's Hospital of Philadelphia. Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits. 

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Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Conception d&#39;un bioréacteur pour la pression cyclique Ex Vivo Étude des valves cardiaques aortiques

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Recherche

Bio-ingénierie

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Détermination de la vitesse de transport des xénobiotiques et des nanomatériaux à travers le placenta en utilisant l&#39;<em&gt; Ex vivo</em&gt; Human perfusion placentaire modèle

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Amélioration de la méthode pour la préparation d&#39;une base de cellules humaines, Contactez modèle de la barrière hémato-encéphalique

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

Transfection génique vers les cellules Spheroid sur microélectrodes plaques de culture destinés à la transplantation de cellules génétiquement modifiées

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

A New Ex Vivo Model for the Evaluation of Endoscopic Submucosal Injection Material Performance

Increasing the performance of submucosal injection materials (SIMs) is important for endoscopic therapy of early gastrointestinal cancer. It is essential to establish an ex vivo model that can evaluate SIM performance accurately, for developing high-performance SIMs. In our previous study, we developed a new ex vivo model that can be used to evaluate the performance of various SIMs in detail by applying constant tension to the specimen&#39;s ends. We also confirmed that the proposed new ex vivo model allows accurate submucosal elevation height (SEH) measurement under uniform conditions and detailed comparisons of the performances of various types of SIMs. Here, we describe the new ex vivo model and explain the detailed setup methodology of this model. Since all parts of the new model were easy to obtain, the setup of the new model could be completed quickly. SEH of various SIMs could be measured more accurately by using the new model. The critical factor that determines SIM performance can be identified using the new model. SIM development speed will drastically increase after the factor has been identified.

A New Ex Vivo Model for the Evaluation of Endoscopic Submucosal Injection Material Performance

We developed a new ex vivo model that applies constant tension to the porcine gastric specimen. This development made it possible to evaluate the performance (the height and duration of the submucosal elevation) of various SIMs accurately.&#160; The detailed setup methodology of this new model is explained.

Un nouveau modèle Ex Vivo pour l’évaluation des performances matérielles Injection sous-muqueuse endoscopique

Increasing the performance of submucosal injection materials (SIMs) is important for endoscopic therapy of early gastrointestinal cancer. It is essential ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

Cathéter de lumière à tir latéral intra-cardiaque pour la surveillance du métabolisme cellulaire à l'aide de la spectroscopie d'absorption transmurale des cœurs de mammifères perfusés

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

Imagerie du flux sanguin avec Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

&quot;Avatar&quot;- Optimized Ex Vivo Work Loop Experiment to Emulate In Vivo Muscle Force

"Avatar", a Modified Ex vivo Work Loop Experiments Using In vivo Strain and Activation

Movement behaviors are emergent features of dynamic systems that result from muscle force production and work output. The interplay between neural and mechanical systems occurs at all levels of biological organization concurrently, from the tuning of leg muscle properties while running to the dynamics of the limbs interacting with the ground. Understanding the conditions under which animals shift their neural control strategies toward intrinsic muscle mechanics (&#39;preflexes&#39;) in the control hierarchy would allow muscle models to predict in vivo muscle force and work more accurately. To understand in vivo muscle mechanics, ex vivo investigation of muscle force and work under dynamically varying strain and loading conditions similar to in vivo locomotion is required. In vivo strain trajectories typically exhibit abrupt changes (i.e., strain and velocity transients) that arise from interactions among neural activation, musculoskeletal kinematics, and loads applied by the environment. The principal goal of our &#34;avatar&#34; technique is to investigate how muscles function during abrupt changes in strain rate and loading when the contribution of intrinsic mechanical properties to muscle force production may be highest. In the &#34;avatar&#34; technique, the traditional work-loop approach is modified using measured in vivo strain trajectories and electromyographic (EMG) signals from animals during dynamic movements to drive ex vivo muscles through multiple stretch-shortening cycles. This approach is similar to the work-loop technique, except that in vivo strain trajectories are scaled appropriately and imposed on ex vivo mouse muscles attached to a servo motor. This technique allows one to: (1) emulate in vivo strain, activation, stride frequency, and work-loop patterns; (2) vary these patterns to match in vivo force responses most accurately; and (3) vary specific features of strain and/or activation in controlled combinations to test mechanistic hypotheses.

Author Spotlight: Bridging the Gap Between In Vivo and Ex Vivo Studies with the &quot;Avatar&quot; Technique to Advance Muscle Mechanics Research 

This article details the methodology for emulating in vivo muscle force production during ex vivo work loop experiments using an "avatar" muscle from a laboratory rodent to assess the contributions of strain transients and activation to the muscle force response.

Movement behaviors are emergent features of dynamic systems that result from muscle force production and work output. The interplay between neural and ...

Preparation of Cardiomyocytes and Setting-Up the Apparatus for the Slow Injection Method

Prepare the 10%gelatin stock solution by weighing and dissolving the gelatin in the ADS buffer, and autoclaving the solution. Rewarm the 10%gelatin stock at 37 degrees Celsius, until it becomes liquid. Then dilute the gelatin stock, using a prewarmed ADS buffer, to obtain the final injectable 5%gelatin solution.Suspend 96 cardiomyocyte balls in 100 microliters of prewarmed injection solution. Load the cardiomyocyte ball suspension into the cell injection syringe without aspirating the excess air. Next, hold the syringe vertically, with the needle facing upward, and tap the syringe to collect the bubbles at the upper ridge of the syringe.Also, observe the cardiomyocyte balls gradually settling onto the rubber seal of the plunger. Maintain the vertical position of the syringe, and slowly push the plunger to discard the bubbles and excess cell suspension solution, until 20 microliters of the cell suspension remain in the syringe, and the cardiomyocyte ball remains resting on the rubber seal of the plunger. Once done, immerse the capped syringe in an ice bath for five minutes, and fix the injection syringe apparatus on the animal stage before activating the main syringe pump during percutaneous cell transplantation in an anesthetized rat.

Préparation des cardiomyocytes et mise en place de l’appareil pour la méthode d’injection lente

Analyse de modèles de barrière hémato-encéphalique par coloration par immunofluorescence

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser l’utilisation de la technologie des puces tissulaires pour l’étude des tissus humains 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

Utilisation de la plateforme tissulaire barrière MicroSiM (μSiM) pour la modélisation de la barrière hémato-encéphalique

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...