Les auteurs tiennent à remercier Erin Fennern pour aider expérience. Ce travail a été financé par le Conseil norvégien de la recherche (180504, 185306 et 191699), Pew Charitable Trust, et le National Institute on Aging (NIA P01 AG22500).

Partie 1: ARNi à médiation knockdown double gène 1. ARNds Synthèse <ol><li> amorces de conception d&#39;ARN double brin ciblant vg, USP et un gène codant pour la protéine de fluorescence verte de contrôle (GFP) qui n&#39;est pas à l&#39;abeille génome: amorces ont été conçues en utilisant le logiciel gratuit en ligne Primer3 ( <a href="http://frodo.wi.mit.edu/" target="_blank">http://frodo.wi.mit.edu/</a> ) . </li><li> synthèse ARN double brin pour vg, USP et GFP: utilisation du système de production RiboMax T7 RNA de Promega pour la transcription in vitro. </li><li> ARNds purification: <ol><li> Dénaturation et renaturation: chaleur l&#39;ARNdb à 85 ° C pendant 5 minutes et laisser refroidir à la température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Traitement à la DNase I: ajouter 1 pl DNase I dans chaque réaction ARN double brin et mélangez-les en tapotant les tubes. Incuber pendant 15 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 150 ul d&#39;eau sans nucléase et 750 ul TRIzol - LS dans chaque réaction et mélanger doucement par invErting le tube. Incuber les échantillons pendant 5 min à 30 ° C. </li><li> Ajouter 200 ul de chloroforme dans chaque échantillon. Mélanger vigoureusement pendant 20 secondes. Centrifuger les échantillons pendant 15 min à 12000 g à 4 ° C. </li><li> Transférer le surnageant à chaque nouveau tube et ajouter 500 ul d&#39;alcool isopropylique dans chaque tube. Mélangez-les en inversant le tube. Incuber le mélange pendant 20 min à -20 ° C. Centrifuger pendant 10 min à 12000 g à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant et utiliser 1,000 ul d&#39;éthanol à 75% à laver le culot. Après centrifugation le tube pendant 5 min à 7500 g à 4 ° C, l&#39;air sec l&#39;ARNdb granulés, et utiliser l&#39;eau sans nucléase de dissoudre la pastille. Afin d&#39;assurer l&#39;efficacité de la régulation génique, la concentration ARNds devrait être d&#39;environ 9 -10 pg / pl. </li></ol></li></ol> 2. ARNds injection abdominale Pour un effet à double gène, il ya deux stratégies: 1) injection unique: mélange ARN double brin de deux gènes et Inject le mélange; 2) deux jours injection: injecter le premier ARN double brin ciblant un gène sur le premier jour, et injecter le second ARN double brin dans les mêmes abeilles sur le deuxième jour. <ol><li> Froid nouvellement émergé abeilles dans une ° C réfrigérateur 4 pendant 1-2 min. Quand les abeilles sont immobilisés, monter 3-4 abeilles en parallèle sur des boîtes de Pétri remplies de cire solide avec des épingles insectes croisés entre leurs abdomens et thoraces. </li><li> Refroidir les abeilles à nouveau dans un réfrigérateur ° C 4. S&#39;assurer que les abeilles sont totalement immobile. Il faut environ 1-2 min. Les abeilles doivent regarder lâche. Si les abeilles deviennent courbés ou tordus, cela signifie qu&#39;ils sont refroidis trop longtemps qui devrait être évité. Chilling provoque trop forte mortalité, mais une immobilisation complète est important que tout mouvement augmente la taille de la blessure et de mortalité. </li><li> Mettez une couche jetable aiguille 30 G (BD) sur une micro seringue Hamilton. Prenez 3 ARNds ul et s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y a pas de bulle d&#39;air dans la seringue. L&#39;aiguille est insérée à un côté de l&#39;abdomen pour éviter damaging organes internes. Appuyer lentement le piston de la seringue pour permettre à l&#39;ARN double brin qui doit être absorbée. Etant donné que l&#39;ARN double brin est très visqueux, il faut deux à trois secondes à être complètement expulsé de la seringue. Après avoir complètement poussant sur le piston, laisser l&#39;aiguille dans la plaie pendant 4-5 sec. Observez les abeilles pendant 3-5 sec après les injections. Si un hémolymphe fuites de gouttelettes de la plaie, jeter l&#39;abeille. </li><li> Utilisez des couleurs différentes pour marquer leurs thoraces correspondant aux différents traitements. A ce stade, si la stratégie d&#39;injection unique a été utilisé, les abeilles peuvent être replacés dans une colonie après 1 hr observation. Toutefois, si la stratégie d&#39;injection de deux jours a été utilisé, après l&#39;injection de la première ARN double brin, les abeilles doivent être placés dans une cage grillagée cylindre avec du miel fourni sur le côté et être maintenus dans un incubateur à 34 ° C et 80% d&#39;humidité . </li><li> Le deuxième jour, suivez les étapes 2.2 et 2.3 pour refroidir les abeilles dans les cages en filet et monter sur des plaques de cire. Effectuer injections avec le deuxième ARN double brin comme il est descrilit dans l&#39;étape 2.4. </li><li> Que les abeilles se remettre à la température ambiante pendant 1 heure et les introduire dans une colonie. </li></ol> Remarque: Les effets sacrifiés peuvent être détectés par RT-PCR quantitative (qRT-PCR) et Western blot. En général, l&#39;efficacité du knockdown est variable et dépend de nombreux facteurs. Dans notre étude, la double inactivation génique peut être détecté 7 jours après une seule injection et les injections de deux jours. Partie 2: Extension réponse dosage Proboscide (PER) 1. Collecte des abeilles de la ruche Au jour 6 après les injections, collecter les abeilles traitées de la colonie sans l&#39;aide d&#39;un fumeur. Recueillir les abeilles dans la maille métallique cages de cylindres. Gardez 3 abeilles dans chaque cage. 2. Abeilles de montage pour PER Refroidir les abeilles à 4 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;elles soient complètement immobilisés. Montez chaque abeille verticalement dans un tube en plastique spécialement conçu pour les PER. Gardez l&#39;abdomen à l&#39;intérieur du tube par using deux petits morceaux de ruban, et de garder la tête qui sort du tube. Placer les tubes sur une grille de deux rangées de petites colonnes en plastique, et attribuer à chaque tube (abeille) avec un numéro d&#39;identification. Ensuite, mettre les abeilles traitées sur les étagères dans un incubateur (34 ° C et 80% d&#39;humidité) et les garder dans l&#39;incubateur pendant 2 heures. 3. Préparer une série de saccharose Water Solutions Préparer 0%, 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% et des solutions aqueuses de saccharose de 30% et de charger les solutions dans des seringues ayant des aiguilles de G 15-20. 4. Par essai Touchez l&#39;antenne de l&#39;abeille avec une gouttelette de solution de 0% (eau), suivie par des solutions aqueuses de saccharose 30% à 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% et. Testez toutes les abeilles avec de l&#39;eau en premier et attendre au moins deux minutes que l&#39;intervalle entre chaque solution est utilisée. Par conséquent, nous avons habituellement au moins 20 abeilles pour chaque essai. Si une abeille s&#39;étend pleinement ses trompe, une réponse positive est compté. 5.Gestion des données Résumer le total des réponses positives pour chaque individu pointage de réponse gustative (GRS) pour. Effectuer une analyse statistique appropriée des données. Partie 3. validation des inactivation génique Corps gras sont disséqués par un autre ensemble de 7 jours vieilles abeilles traitées. Une procédure Trizol standard est utilisé pour l&#39;extraction de l&#39;ARN, qui est suivie par la DNase traitement I 24. Vg et l&#39;expression du gène USP est analysé par un à deux étapes qRT-PCR. Actine est utilisé en tant que gène de référence, car il a des expressions stables dans différents tissus des abeilles mellifères. Amorces de PCR en temps réel publiés pour VG et le gène USP sont utilisés dans cette expérience 24. Les données sont analysées à l&#39;aide de Delta-Delta méthode CT 25.

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We have nothing to disclose.

Notre étude est la première tentative de frapper simultanément sur les deux gènes chez les insectes adultes. Nos résultats montrent que les deux stratégies d&#39;ARN double brin injections (une seule injection et l&#39;injection de deux jours) sont efficaces pour la répression du gène double, et gene silencing simultanée de VG et USP peuvent être testés 6 jours après les injections ARN double brin dans les abeilles 8,9. Cependant, le gène knockdown efficacité varie selon les es...

L&#39;interférence ARN (ARNi) est gene silencing post-transcriptionnelle basée sur l&#39;ARN, qui se produit dans une grande variété d&#39;organismes eucaryotes. Le processus de RNAi est déclenchée par l&#39;ARN (ARNdb) précurseurs bicaténaires endogènes ou exogènes. L&#39;ARN double brin active la protéine Dicer de ribonucléase qui lie et clive l&#39;ARN double brin en petits fragments (20-25 pb). Ensuite, les petits fragments d&#39;ARN double brin le guide la reconnaissance et le clivage d&#39;ARNm complémentaires par les protéines Argonaute, un composant catalytique de complexe RNA-induced silencing (RISC) 1. Chez les mammifères, ARNdb plus de 30 nt, activent une réponse antivirale (réponse interféron, IFN), qui conduit à une dégradation non spécifique des ARN transcrits 2. Cependant, à long ARN double brin sont avérées efficaces et spécifiques chez les insectes car il ya un manque de ce IFN 3. Longs ARNdb ont été utilisés pour la régulation négative des gènes cibles de différentes espèces d&#39;insectes. Les abeilles sont l&#39;un des pionorganismes EER d&#39;insectes dans lequel les fonctions de nombreux gènes importants dans le développement et le comportement ont été révélés en utilisant l&#39;ARN double brin 4,5. Plusieurs méthodes de livraison ARNdb ont été réalisées chez les abeilles: ARNds alimentation régule négativement efficacement l&#39;expression du gène cible en larves d&#39;abeilles 6, alors que l&#39;injection ARNdb est une approche efficace pour inactivation génique dans le miel embryons d&#39;abeille 4 et les abeilles adultes 7,8. effets knockdown de gènes exposées en appliquant ARN double brin pour les insectes sont transitoires et localisée. Des études ont montré que les injections d&#39;ARN double brin abdominaux et les injections de ARNds thoraciques réprimer efficacement l&#39;expression du gène cible dans les cellules du corps de graisse abdominale d&#39;insectes 9,10. ARNdb est injecté dans les cavités abdominales et thoraciques et des cellules de graisse corporelle sont en mesure de prendre l&#39;ARNdb de l&#39;hémolymphe où les cellules sont baignées 10. Toutefois, les gènes dans d&#39;autres organes, tels que les ovaires et le cerveau, ne peuvent pas être ciblés par l&#39;une desinjections abdominales ou thoraciques. Afin de cibler des gènes dans le cerveau d&#39;abeille, l&#39;injection du cerveau de l&#39;ARN double brin a également été réalisée, ce qui influence de manière efficace l&#39;expression d&#39;un gène cible dans des zones du cerveau locaux 11. Ici, nous ne documentons injection d&#39;ARN double brin abdominale qui est plus couramment utilisé dans les abeilles adultes. RNAi a été principalement utilisé pour cibler un gène unique et a été un outil puissant pour révéler la fonction des gènes. Cependant, n&#39;importe quel gène n&#39;est pas isolé des autres, c&#39;est dans les réseaux de régulation complexes. Une clé pour comprendre un processus biologique consiste à disséquer la façon dont les gènes interagissent les uns avec les autres, ce qui nécessite des manipulations simultanées de gènes multiples plutôt qu&#39;un seul inactivation génique. Dans les lignées cellulaires de mammifères, les scientifiques ont réussi à inhiber simultanément deux ou trois gènes en utilisant des systèmes de livraison de 12 ou multi-microARN (miARN) conçoit en épingle à cheveux 13. Mais chez les insectes, plusieurs passes rabattues de gènes sont encore testés. Ici, nous présentastratégies t d&#39;injection différents, qui peuvent atteindre un effet de choc à double gène. Nous ciblons deux gènes: vitellogénine (VG) qui code pour une protéine précurseur jaune et ultraspiracle (USP) qui code pour un récepteur putatif de l&#39;hormone juvénile (JH) et peut servir comme un facteur de transcription médiation des réponses à JH 14 chez les abeilles. Vg et JH régulent mutuellement dans une boucle de rétroaction 15 et sont impliqués dans la régulation du comportement abeille 9. En utilisant la double inactivation génique, nous perturbent à la fois Vg et les voies JH, et découvrez comment ils affectent conjointement le comportement des abeilles et de la physiologie et comment vg, USP et JH interagissent 9. Perception gustative est un facteur prédictif du comportement des abeilles mellifères comportement social 16. En termes de développement, de comportement des abeilles nid avec grande perception gustative comportemental rapides maturité, et généralement fourragères tôt dans la vie et préfèrent recueillir le pollen 16,17. Bien que la réglementation mECANISMES qui sous-tendent la perception gustative sont encore peu claires, des études ont montré que la perception gustative est liée à métabolismes internes d&#39;énergie 9, la sécrétion hormonale 18,19 et biogénétique amine voies 20. Les deux Vg et JH sont des régulateurs hormonaux importants moduler la perception gustative 7,21. En laboratoire, une variation de la perception gustative chez les abeilles peut être évaluée en testant la réponse extension du proboscis (PER) de différentes solutions de saccharose. Chaque abeille est testé par toucher son deux antennes avec une goutte d&#39;eau suivie d&#39;une série ascendante de concentration de 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% de saccharose. Une réponse positive est à noter si une abeille s&#39;étend pleinement ses trompe quand une goutte d&#39;eau ou saccharose est touché à chaque antenne. Basé sur le nombre de réponses positives aux solutions, le niveau de perception gustative de chaque individu peut être déterminé 16. Toutefois, l&#39;application de la PER ne se limite pas à la mesure de gperception ustatory. Le PER est aussi une méthode efficace pour tester l&#39;état métabolique des abeilles tels que la satiété contre la faim. Les abeilles avec des réponses plus au saccharose ont plus faim en général (Wang et Amdam, données non publiées). Par ailleurs, le paradigme PER peut également être utilisé dans l&#39;apprentissage associatif et de la mémoire chez les abeilles. Dans ce cas, les abeilles seront formés à associer la présence d&#39;eau de saccharose avec une odeur. Quand les abeilles apprennent l&#39;association, seule la présence de l&#39;odeur peut susciter une réaction de trompe positif sans les récompenser avec le saccharose 22,23. Dans cette vidéo, nous montrons comment réaliser PER d&#39;évaluer la perception gustative qui a été connecté avec vg et usp à double effet de choc dans une étude précédente 9.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GE Healthcare PCR beads in 96 well plate</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27-9557-01</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>RiboMax T7 RNA production system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trizol LS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hamilton micro syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80301</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>30G BD disposable needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1 ml Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>30960</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereo dissection microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>S6D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26000-25</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Wax plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

rnai-mediated double gene knockdown and gustatory perception measurement in honey bees (apis mellifera)

Cette vidéo montre les nouvelles techniques de l&#39;interférence ARN (ARNi), qui régulent à la baisse deux gènes simultanément dans les abeilles en utilisant l&#39;ARN (l&#39;ARN double brin) injections double brin. Il présente également un protocole de réponse d&#39;extension du proboscis (PER) d&#39;essai pour mesurer la perception gustative. Inactivation génique médiée par ARNi est une technique efficace la régulation négative de l&#39;expression du gène cible. Cette technique est généralement utilisée pour la manipulation d&#39;un seul gène, mais il a ses limites pour détecter les interactions et les effets conjoints entre les gènes. Dans la première partie de cette vidéo, nous vous présentons deux stratégies pour frapper simultanément sur les deux gènes (appelées knockdown double gène). Nous montrons les deux stratégies sont en mesure de réprimer efficacement deux gènes, vitellogénine (VG) et ultraspiracle (USP), qui sont dans une boucle de rétroaction réglementaire. Cette approche knockdown double gène peut être utilisé pour disséquer les interrelations entre les gènes et peut être facilement appliqué dansdifférentes espèces d&#39;insectes. La deuxième partie de cette vidéo est une démonstration de l&#39;extension réponse dosage trompe (PER) chez les abeilles après le traitement de knockdown double gène. Le test PER est un test standard pour mesurer la perception gustative chez les abeilles, qui est un indicateur clé de la rapidité de maturation sur le comportement des abeilles est. Grand perception gustative des abeilles nid indique le développement comportemental augmenté, ce qui est souvent associée à un plus jeune âge au début de la recherche de nourriture et d&#39;alimentation spécialisation dans le pollen. En outre, par essai peut être appliqué à identifier les états métaboliques de satiété ou de faim chez les abeilles. Enfin, par dosage combiné avec appariement différents stimuli odorants pour le conditionnement des abeilles est également largement utilisé pour les études de l&#39;apprentissage et la mémoire chez les abeilles.

Tant les deux jours de l&#39;injection stratégies mono-injection et réduit de façon significative vg (One-way ANOVA, p &lt;0,001) (figure 2A) et l&#39;USP (One-way ANOVA, p &lt;0,001) (figure 2B) les niveaux de transcription chez les abeilles six jours après l&#39;ARNdb a été injecté. La suppression de l&#39;USP transcription en utilisant l&#39;injection unique avec un mélange ARN double brin et l&#39;injection de deux jours avec vg premier et...

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RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

Dans ce protocole, nous décrivons deux stratégies qui suppriment simultanément deux gènes (knockdown double gène) chez les abeilles. Ensuite, nous présentons comment utiliser la réponse d&#39;extension trompe (PER) d&#39;analyse pour étudier l&#39;effet de knockdown double gène sur Honey Bee perception gustative.

ARNi médiée double inactivation génique et de mesure de la perception gustative chez les abeilles (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

rnai-mediated-double-gene-knockdown-gustatory-perception-measurement

Research

JoVE Journal

Neuroscience

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

14.8K vues.  Arizona State University. Dans ce protocole, nous décrivons deux stratégies qui suppriment simultanément deux gènes (knockdown double gène) chez les abeilles. Ensuite, nous présentons comment utiliser la réponse d'extension trompe (PER) d'analyse pour étudier l'effet de knockdown double gène sur Honey Bee perception gustative.

Vidéo: RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Double fluorescence In situ</emHybridation> dans des coupes de cerveau frais

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Recherche

Neurosciences

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the survival of a honeybee colony depends on the exploitation of food sources, forager bees learn and memorize variable flower sites as well as their profitability. Forager bees can be easily trained in natural settings where they forage at a feeding site and learn the related signals such as odor or color. Appetitive associative learning can also be studied under controlled conditions in the laboratory by conditioning the proboscis extension response (PER) of individually harnessed honeybees3,4. This learning paradigm enables the study of the neuronal and molecular mechanisms that underlie learning and memory formation in a simple and highly reliable way5-12. A behavioral pharmacology approach is used to study molecular mechanisms. Drugs are injected systemically to interfere with the function of specific molecules during or after learning and memory formation13-16.
Here we demonstrate how to train harnessed honeybees in PER conditioning and how to apply drugs systemically by injection into the bee flight muscle.

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees Apis mellifera

We demonstrate how to implement a behavioral pharmacology method in an appetitive olfactory conditioning paradigm in honeybees (Apis mellifera) by systemic application of drugs. This method allows investigation of the mechanisms underlying learning and memory formation in a simple and reliable way.

Pharmacologie comportementale dans le conditionnement classique de la réponse Extension Proboscis chez les abeilles ( Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the ...

Creating Objects and Object Categories for Studying Perception and Perceptual Learning

In order to quantitatively study object perception, be it perception by biological systems or by machines, one needs to create objects and object categories with precisely definable, preferably naturalistic, properties1. Furthermore, for studies on perceptual learning, it is useful to create novel objects and object categories (or object classes) with such properties2.
Many innovative and useful methods currently exist for creating novel objects and object categories3-6 (also see refs. 7,8). However, generally speaking, the existing methods have three broad types of shortcomings.
First, shape variations are generally imposed by the experimenter5,9,10, and may therefore be different from the variability in natural categories, and optimized for a particular recognition algorithm. It would be desirable to have the variations arise independently of the externally imposed constraints.
Second, the existing methods have difficulty capturing the shape complexity of natural objects11-13. If the goal is to study natural object perception, it is desirable for objects and object categories to be naturalistic, so as to avoid possible confounds and special cases.
Third, it is generally hard to quantitatively measure the available information in the stimuli created by conventional methods. It would be desirable to create objects and object categories where the available information can be precisely measured and, where necessary, systematically manipulated (or 'tuned'). This allows one to formulate the underlying object recognition tasks in quantitative terms.
Here we describe a set of algorithms, or methods, that meet all three of the above criteria. Virtual morphogenesis (VM) creates novel, naturalistic virtual 3-D objects called 'digital embryos' by simulating the biological process of embryogenesis14. Virtual phylogenesis (VP) creates novel, naturalistic object categories by simulating the evolutionary process of natural selection9,12,13. Objects and object categories created by these simulations can be further manipulated by various morphing methods to generate systematic variations of shape characteristics15,16. The VP and morphing methods can also be applied, in principle, to novel virtual objects other than digital embryos, or to virtual versions of real-world objects9,13. Virtual objects created in this fashion can be rendered as visual images using a conventional graphical toolkit, with desired manipulations of surface texture, illumination, size, viewpoint and background. The virtual objects can also be 'printed' as haptic objects using a conventional 3-D prototyper.
We also describe some implementations of these computational algorithms to help illustrate the potential utility of the algorithms. It is important to distinguish the algorithms from their implementations. The implementations are demonstrations offered solely as a 'proof of principle' of the underlying algorithms. It is important to note that, in general, an implementation of a computational algorithm often has limitations that the algorithm itself does not have.
Together, these methods represent a set of powerful and flexible tools for studying object recognition and perceptual learning by biological and computational systems alike. With appropriate extensions, these methods may also prove useful in the study of morphogenesis and phylogenesis.

We describe a novel methodology for creating naturalistic 3-D objects and object categories with precisely defined feature variations. We use simulations of the biological processes of morphogenesis and phylogenesis to create novel, naturalistic virtual 3-D objects and object categories that can then be rendered as visual images or haptic objects.

Création d&#39;objets et catégories d&#39;objets pour l&#39;étude de la perception et de l&#39;apprentissage perceptif

In order to quantitatively study object perception, be it perception by biological systems or by machines, one needs to create objects and object ...

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single cells in response to electrical or pharmacological manipulations1,2. With the invention of methods to optically control genetically targeted neurons (optogenetics), researchers now have an unprecedented level of control over specific groups of neurons in the standard slice preparation. In particular, photosensitive channelrhodopsin-2 (ChR2) allows researchers to activate neurons with light3,4. By combining careful calibration of LED-based photostimulation of ChR2 with standard slice electrophysiology, we are able to probe with greater detail the role of adult-born interneurons in the olfactory bulb, the first central relay of the olfactory system. Using viral expression of ChR2-YFP specifically in adult-born neurons, we can selectively control young adult-born neurons in a milieu of older and mature neurons. Our optical control uses a simple and inexpensive LED system, and we show how this system can be calibrated to understand how much light is needed to evoke spiking activity in single neurons. Hence, brief flashes of blue light can remotely control the firing pattern of ChR2-transduced newborn cells.

Adult-born neurons expressing ChR2 can be manipulated in slice electrophysiological preparations in order to examine their contribution towards the function of olfactory neural circuits.

L&#39;utilisation abordable tableaux LED pour photo-stimulation des neurones

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Sélective transduction virale des adultes-né pour les neurones olfactifs chronique In vivo Stimulation optogénétique

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

MPI CyberMotion Simulator: Implementation of a Novel Motion Simulator to Investigate Multisensory Path Integration in Three Dimensions

Path integration is a process in which self-motion is integrated over time to obtain an estimate of one's current position relative to a starting point 1. Humans can do path integration based exclusively on visual 2-3, auditory 4, or inertial cues 5. However, with multiple cues present, inertial cues - particularly kinaesthetic - seem to dominate 6-7. In the absence of vision, humans tend to overestimate short distances (&lt;5 m) and turning angles (&lt;30&deg;), but underestimate longer ones 5. Movement through physical space therefore does not seem to be accurately represented by the brain.
Extensive work has been done on evaluating path integration in the horizontal plane, but little is known about vertical movement (see 3 for virtual movement from vision alone). One reason for this is that traditional motion simulators have a small range of motion restricted mainly to the horizontal plane. Here we take advantage of a motion simulator 8-9 with a large range of motion to assess whether path integration is similar between horizontal and vertical planes. The relative contributions of inertial and visual cues for path navigation were also assessed.
16 observers sat upright in a seat mounted to the flange of a modified KUKA anthropomorphic robot arm. Sensory information was manipulated by providing visual (optic flow, limited lifetime star field), vestibular-kinaesthetic (passive self motion with eyes closed), or visual and vestibular-kinaesthetic motion cues. Movement trajectories in the horizontal, sagittal and frontal planes consisted of two segment lengths (1st: 0.4 m, 2nd: 1 m; &plusmn;0.24 m/s2 peak acceleration). The angle of the two segments was either 45&deg; or 90&deg;. Observers pointed back to their origin by moving an arrow that was superimposed on an avatar presented on the screen.
Observers were more likely to underestimate angle size for movement in the horizontal plane compared to the vertical planes. In the frontal plane observers were more likely to overestimate angle size while there was no such bias in the sagittal plane. Finally, observers responded slower when answering based on vestibular-kinaesthetic information alone. Human path integration based on vestibular-kinaesthetic information alone thus takes longer than when visual information is present. That pointing is consistent with underestimating and overestimating the angle one has moved through in the horizontal and vertical planes respectively, suggests that the neural representation of self-motion through space is non-symmetrical which may relate to the fact that humans experience movement mostly within the horizontal plane.

An efficient way to gain insight into how humans navigate themselves in three dimensions is described. The method takes advantage of a motion simulator capable of moving observers in ways unattainable by traditional simulators. Results confirm that movement in the horizontal plane is underestimated, while vertical movement is overestimated.

MPI CyberMotion Simulator: la mise en œuvre d&#39;un simulateur de mouvement Novel pour étudier l&#39;intégration multisensorielle chemin en trois dimensions

Path integration is a process in which self-motion is integrated over time to obtain an estimate of one's current position relative to a starting point 1. ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker bees spend the first half of their life inside the dark hive, where they are nursing the larvae or building the regular hexagonal combs for food (e.g. pollen or nectar) and brood3. The antennae are extraordinary multisensory feelers and play a pivotal role in various tactile mediated tasks4, including hive building5 and pattern recognition6. Later in life, each single bee leaves the hive to forage for food. Then a bee has to learn to discriminate profitable food sources, memorize their location, and communicate it to its nest mates7. Bees use different floral signals like colors or odors7, 8, but also tactile cues from the petal surface9 to form multisensory memories of the food source. Under laboratory conditions, bees can be trained in an appetitive learning paradigm to discriminate tactile object features, such as edges or grooves with their antennae10, 11, 12, 13. This learning paradigm is closely related to the classical olfactory conditioning of the proboscis extension response (PER) in harnessed bees14. The advantage of the tactile learning paradigm in the laboratory is the possibility of combining behavioral experiments on learning with various physiological measurements, including the analysis of the antennal movement pattern.

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

In this protocol we show how to condition harnessed honey bees to tactile stimuli and introduce a 2D motion capture technique for analyzing the kinematics of fine-scale antennal sampling pattern.

Conditionnement tactile et d&#39;analyse des mouvements des stratégies d&#39;échantillonnage antennaires chez les abeilles (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

Microélectrodes à double canon et concentrique pour la mesure de signaux extracellulaires Ion dans le tissu cérébral

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from flowering plants. Only a few studies have described the gustatory responses of bees toward toxins in food, and these experiments have mainly used the proboscis extension response on restrained honey bees. Here, a new behavioral assay is presented for measuring the feeding responses of freely-moving, individual worker bumble bees to nutrients and toxins. This assay measures the amount of solution ingested by each bumble bee and identifies how tastants in food influence the microstructure of the feeding behavior.
The solutions are presented in a microcapillary tube to individual bumble bees that have been previously starved for 2-4 hr. The behavior is captured on digital video. The fine structure of the feeding behavior is analyzed by continuously scoring the position of the proboscis (mouthparts) from video recordings using event logging software. The position of the proboscis is defined by three different behavioral categories: (1) proboscis is extended and in contact with the solution, (2) proboscis is extended but not in contact with the solution and (3) proboscis is stowed under the head. Furthermore the speed of the proboscis retracting away from the solution is also estimated.
In the present assay the volume of solution consumed, the number of feeding bouts, the duration of the feeding bouts and the speed of the proboscis retraction after the first contact is used to evaluate the phagostimulatory or the deterrent activity of the compounds tested.
This new taste assay will allow researchers to measure how compounds found in nectar influence the feeding behavior of bees and will also be useful to pollination biologists, toxicologists and neuroethologists studying the bumble bee&#39;s taste system.

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees Bombus terrestris

A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.

A Novel Behavioral Assay d&#39;enquêter sur les réponses gustatifs de l&#39;individu, Librement-mobiles Bumble Bees (<em&gt; Bombus terrestris</em&gt;)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize and to study. Therefore, bees have long been a favored model amongst neurobiologists and neuroethologists for studying the neural basis of social and natural behavior. It is important, however, that the experimental techniques used to study bees do not interfere with the behaviors being studied. Because of this, it has been necessary to develop a range of techniques for pharmacological manipulation of honey bees. In this paper we demonstrate methods for treating restrained or free-flying honey bees with a wide range of pharmacological agents. These include both noninvasive methods such as oral and topical treatments, as well as more invasive methods that allow for precise drug delivery in either systemic or localized fashion. Finally, we discuss the advantages and disadvantages of each method and&#160;describe common hurdles and how to best overcome them. We conclude with a discussion on the importance of adapting the experimental method to the biological questions rather than the other way around.

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

This manuscript describes several protocols for administering pharmacological agents to honey bees, including simple noninvasive methods for free-flying bees, as well as more invasive variants that allow precise localized treatment of restrained bees.

Manipulation neuropharmacologiques de Restrained et vol libre abeilles,<em&gt; Apis mellifera</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...