The authors thank Bryan T. Vinyard of the USDA, Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Biometrical Consulting Service, Beltsville, MD for statistical analyses. This work was supported in part by a grant to J.C.D. from the Deployed War Fighter Protection (DWFP) Research Program funded by the Department of Defense through the Armed Forces Pest Management Board (AFPMB).

1. Elevage Ae. aegypti adultes <ol><li> Les œufs éclosent en environ ¾ pouce d&#39;eau dans le bac peu profond. La surpopulation va réduire la taille des adultes. </li><li> Larves arrière à 25 ° C (12 hl: 12-HD) et nourrir avec de la nourriture du poisson de fond. NOTE: La suralimentation peut réduire les taux de survie. </li><li> Retirer pupes individuellement par pipette Pasteur quotidienne et transfert à des plats en plastique (9 cm x 5,5 cm) à l&#39;intérieur de petits seaux de confinement avec de fines couvercles de maille, établissant ainsi 24 groupes d&#39;âge h. </li><li> moustiques adultes Feed solution à 10% de saccharose par le coton balle placée sur les murs d&#39;écran d&#39;un boîtier de la cage les moustiques dans une chambre de l&#39;environnement à 27 ° C et 70% d&#39;humidité relative dans les mêmes photopériode sous forme de larves. </li><li> Pour électrophysiologie, utiliser 5-10 jours vieux animaux. En général, les grands animaux produisent de meilleurs résultats. Pour l&#39;isolement de l&#39;ARN, utiliser des animaux qui se trouvent dans un seul 24 hr âge regroupement dans l&#39;ancienne gamme de 5-10 jours. </li></ol><ol><li> Déterminer une concentration appropriée de l&#39;électrolyte (par exemple 1-10 mM) qui provoque une activité minimale de neurones sensoriels sélectionnés. 10 mM de NaCl ou 1 mM KCl sont des électrolytes raisonnables pour tester l&#39;activité de base lorsque l&#39;on commence une expérience. </li><li> Dissoudre chaque produit chimique expérimentale dans un solvant approprié (si ce ne est l&#39;eau, utiliser de l&#39;éthanol ou le DMSO) qui a peu ou pas d&#39;effet sur l&#39;activité de pointe par rapport à l&#39;électrolyte seul. Les concentrations finales de 10% d&#39;éthanol ou 1% de DMSO sont les concentrations de départ raisonnables. </li><li> Sélectionnez approprié (par exemple la quinine en amertume ou le saccharose pour Sweet) de contrôle des produits chimiques qui sont bien décrits dissuasion d&#39;alimentation ou de stimulants chez les insectes. </li></ol> 3. électrophysiologie (enregistrement de la pointe 8; Figure 1) <ol><li> électrodes de verre de forme en tirant mécaniquement capillaires en verre. Optimiser la chaleur et tirez réglages pour tirer verre pour former recordi forme appropriéeélectrodes Ng. Rompre avec précaution extrémité de l&#39;électrode de verre en utilisant une pince sous un microscope de dissection pour créer pointe de l&#39;électrode ouverture qui est assez large pour envelopper cible sensille, mais assez petit pour éviter tout contact avec les structures voisines. </li><li> Sous un microscope, identifier visuellement par la morphologie et la position de la cible sensilles / sensille pour assurer la répétabilité de l&#39;enregistrement de la pointe. Prep animaux afin de permettre le libre accès aux sensilles partir de l&#39;angle d&#39;entrée de l&#39;électrode. </li><li> Froids insectes Anesthetize adultes dans le congélateur à -20 ° C. Eviter les dommages aux neurones périphériques par une surexposition à des températures froides. Découper des bandes étroites de ruban adhésif avec une lame de rasoir sur lame de verre. Immobiliser insectes tout sur une lame de verre en utilisant des bandes étroites. </li><li> Insérez un fil de tungstène chimiquement affilée dans le thorax dorsal ou les yeux pour servir les indifférents (sol) électrode. </li><li> Remplissez électrode de verre faite à l&#39;étape 3.1 avec une solution stimulant d&#39;intérêt. Utilisation d&#39;une seringue insérée, le bouchon de remplissageIllary de bout tiré Blunt fin. Flick toutes les bulles d&#39;air, tenant fin tiré vers le bas. Insérez un fil d&#39;argent (chlorurant en option) dans l&#39;électrode de verre faite à l&#39;étape 3.1 pour servir enregistrement et électrode de stimulation. </li><li> Connecter les électrodes à un préamplificateur qui est conçu pour des enregistrements de contacts chimioréceptifs sensilla chez les insectes. Ce préamplificateur (300 Hz-3 kHz filtre passe-bande) permettra de réduire le temps de stabilisation de l&#39;activité neuronale capturer aussi près que possible l&#39;introduction du stimulus. Collecter, stocker et analyser les signaux électriques en utilisant un micro-ordinateur équipé d&#39;un logiciel d&#39;enregistrement de pointe. REMARQUE: la terre la configuration d&#39;enregistrement correctement peut considérablement améliorer le rapport signal-sur-bruit. </li><li> Stimuler sensilles avec une solution de contrôle (électrolyte seulement) pour assurer la fonctionnalité. Comptez pointes à partir de 200 msec suivants l&#39;artefact de stimulation pour toutes les préparations. </li><li> Aléatoire l&#39;ordre de produits chimiques d&#39;essai pour toutes les expériences, à l&#39;exception des études dose-réponse,pour éliminer les préjugés. Pour les études dose-réponse, exposer sensilles à des concentrations de la substance chimique expérimentale croissante. Laisser un minimum de 3 minutes entre les stimulations pour assurer une récupération adéquate. NOTE: Cette exigence peut varier en fonction des insectes et sensilles. Seuil est défini comme étant la concentration pour laquelle l&#39;erreur standard ne chevauche pas l&#39;erreur-type pour la plus faible concentration testée. </li></ol> 4. Isolement et séquençage de l&#39;ARN (figure 2) <ol><li> Préparer les pilons libre de RNAse-étanches en les refroidissant sur de la glace sèche avant tissus disruption.Prepare accompagnant pilons RNase-free qui correspondent à des tubes à bouchon de pression hermétiquement. Garder les tubes de collecte fermés à moins dissection activement pour éviter l&#39;excès de condensation. </li><li> Utilisation de l&#39;aspirateur filtrée, placez 30-40 moustiques froides anesthésiés (15 sec à -20 ° C congélateur) sur scène froide et trier par sexe. La place animaux dorsale vers le bas, saisir ailes pour ne pas endommager les appendices gustatives.</li><li> L&#39;utilisation de deux paires de pinces fines, disséquer labella apparié ou tarses des mâles ou des femelles sous un microscope de dissection et de limiter l&#39;inclusion des tissus adjacents. REMARQUE: 500 labella jumelé donne environ 800-1000 nanogrammes d&#39;ARNm total. 400 tarses individuelle (5 segments chacun) donnent 1,200-1,800 nanogrammes d&#39;ARNm total. </li><li> Avec une paire de halètement-pince, saisir la légère trompe moustiques juste en amont de labella exposer stylets internes. Utiliser autre paire de collecte-pince, retirer et ajouter labella tissu à côté du tube de collecte froid. </li><li> Avec une paire de pinces, saisir légèrement la jambe de moustiques à la jonction du tibia et du premier segment du tarse. Utilisation d&#39;un autre paire de pinces, retirez tarses et ajouter tissu à côté du tube de collecte froid. NOTE: Prendre en compte les types de cellules à l&#39;interface de tissu voulu et non désirées. Se il est important de limiter l&#39;insertion du tissu voisin, il est tout aussi important de ne pas omettre des parties de tissu souhaitée. La fiéchantillon final doit représenter avec précision l&#39;organe entier d&#39;intérêt. Créer une limite précise avec la pince de préhension tels que le forceps de collecte peuvent précisément libérer en grattant ou en saisissant seulement le tissu désiré. </li><li> Périodiquement, spin down tube de collecte brièvement 0 ° C centrifuger à 9000 xg pour maintenir le tissu au fond du tube. Si l&#39;humidité se accumule dans des tubes de collecte lors de la dissection, ajouter 50 pi de réactif Trizol froide pour couvrir des tissus prélevés. </li><li> En utilisant le marqueur de laboratoire anti-maculage, étiqueter clairement une RNase-free 1,5 ml enclenchent tube à bouchon pour chaque type de tissu pour la collecte. Utiliser 1,5 ml rack tube et de l&#39;azote liquide, de geler puis poncer tissus en poudre fine (de belles pièces en cas de Trizol). Répéter une fois. Amener le volume total de 1 ml Trizol et remettre le tissu du sol au vortex. </li><li> Ajouter 200 ul de chloroforme et bien mélanger. Après 5 min à température ambiante, tourner dans la centrifugeuse à 4 ° C et 11 000 g pendant 15 min. Soigneusementajouter couche aqueuse directement sur une colonne de filtration de l&#39;ADN génomique. Isoler à 11 000 x g pendant 5 min. Ajouter volume égal de RNase éthanol à 70% accréditives et mélanger à la pipette. Transfert de liquide à une colonne de collecte de l&#39;ARN et poursuivre l&#39;extraction de l&#39;ARN selon les instructions fournies. </li><li> Quantifier et d&#39;évaluer la pureté de l&#39;ARN total sur un spectrophotomètre de précision et de procéder à toute méthode de séquençage de l&#39;ARN standard. </li></ol> 5. RT-PCR quantitative de l&#39;ARN de validation de séquençage (figure 3) <ol><li> Sélectionnez autant de gènes que possible de comparer les niveaux d&#39;expression des gènes relatifs sur une plage dynamique, à la fois l&#39;abondance de la séquence prédite et la fonction du gène présumé chimiosensorielle. </li><li> Conception des paires d&#39;amorces pour chaque gène cible à amplifier un produit spécifique de 100 à 180 paires de bases par PCR. Exclure gDNA amplification non spécifique en assurant au moins une amorce par ensemble se étend sur une limite intron. Vous pouvez également utiliser le traitement DNase pour réduire la contamination génomique. </li><li> Recueillirtissus insectes comme décrit dans la section précédente. Calculer la quantité de tissu nécessaire pour fournir suffisamment d&#39;ARN pour compléter toutes les réactions qRT-PCR. NOTE: triple biologique et réactions en triple techniques fourniront un maximum de confiance dans les résultats. </li><li> Calculer quantification relative du gène cible que X - (Ct [cible] -Ct [référence]) pour chaque gène cible et moyenne pour chaque répétition, à la fois biologique et technique. Utilisez gène (s) de ménage pour normaliser les valeurs de Ct entre réplicats biologiques et d&#39;enraciner l&#39;échelle de l&#39;axe Y dans les comparaisons d&#39;expression relative. </li><li> Apprécier la similitude de l&#39;ARN-seq et des ensembles de données qRT-PCR en utilisant les fonction de la régression, la procédure d&#39;équivalence bootstrap 9, appliqué de manière itérative, les données de chaque tissu. NOTE: Cette procédure identifie le plus petit «région de similitude&quot; qui peut être construit autour de l&#39;ARN-Seq données et qRT-PCR observée, et permettre l&#39;expression relative de gènes tel que mesuré par qRT-PCR pour être considérée comme statistiquement équivalent à la mesure de l&#39;expression relative des gènes par l&#39;ARN-seq. </li></ol>

<ol>
	<li>Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repellent+and+deterrent+effects+of+SS220,+picaridin,+and+DEET+suppress+human+blood+feeding+by+Aedes+aegypti,+Anopheles+stephensi,+and+Phlebotomus+papatasi.">Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi.</a> J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).</li><li>Dickens, J. C., Bohbot, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini+review:+Mode+of+action+of+mosquito+repellents.Pestic.">Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic.</a> Biochem. Physiol. 106 (3), 149-155 (2013).</li><li>Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gustatory+receptor+neuron+responds+to+DEET+and+other+insect+repellents+in+the+yellow-fever+mosquito,+Aedes+aegypti.">Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Naturwiss. 100 (3), 269-273 (2013).</li><li>Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gustatory+receptor+expression+in+the+labella+and+tarsi+of+Aedes+aegypti.">Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 43 (12), 1161-1171 (2013).</li><li>Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+based+criterion+for+gene+expression+calls+using+RNA-seq+data.">A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data.</a> Theory Biosci. 132 (3), 159-164 (2013).</li><li>Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. 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The authors have nothing to disclose.

L&#39;aspect le plus difficile de potentiels d&#39;action d&#39;enregistrement de sensilles gustative est de décider lequel des réponses sont «normal». Lorsque l&#39;on utilise seule pointe de sensille gustative l&#39;enregistrement de la première fois pour une espèce d&#39;insectes donnés, le nombre et la sensibilité des neurones récepteurs gustatifs totale (GRNS) sont probablement inconnu. De nombreux enregistrements préliminaires doivent d&#39;abord décider de la gamme et les concentrations de produits chi...

Il a été démontré composés comme DEET, Picaridin, Citronellal et IR3535 pour repousser efficacement les moustiques, y compris les vecteurs de maladies importantes Aedes aegypti 1,2. Nous enregistrons des potentiels d&#39;action des neurones sensoriels associés à gustative sensilles spécifique pour déterminer les cellules impliquées avec moustiquaire répulsion. Couplé avec le séquençage aval des gènes exprimés dans ces tissus, nous pouvons identifier les gènes les plus susceptibles médiation des réponses de ces cellules afin de dépister de nouveaux composés pour l&#39;amélioration des capacités de répulsion. ARN-Seq est un outil puissant, devient rapidement la norme pour le suivi des changements temporels et spatiaux de l&#39;expression génique. Analyse de l&#39;ARN-seq appendices chimiosensoriels insectes et les organes ont été utilisées pour découvrir des récepteurs moléculaires dans plusieurs espèces d&#39;insectes 5.3, ce qui améliore grandement le gène par PCR conventionnelle basée recherches par le gène 6. Les insectes représentent la classe des animaux les plus divers, présentant de nombreuses occasions d&#39;étudier le lien entre les gènes et les phénotypes uniques. la technologie de l&#39;ARN-seq peut être utilisé sur ne importe quel tissu insecte vivant. De même, l&#39;enregistrement électrophysiologique à l&#39;intérieur de cellules sensorielles sensilla uniporous gustative peut être réalisée dans de nombreuses espèces d&#39;insectes. Le couplage de ces deux techniques permet aux chercheurs de réduire l&#39;ensemble des gènes impliqués dans le phénotype observé chimiosensorielle. Différentes espèces présenter des défis spécifiques, mais peuvent informer la connexion entre les gènes des récepteurs chimiosensoriels et une adaptation chimiosensorielle. La taille et la morphologie des chimiosensorielle sensilles est variable et peut exiger énormément de dépannage lors de l&#39;enregistrement des potentiels d&#39;action pour réduire le bruit et d&#39;identifier les signaux reproductibles. Les dissections des organes chimiosensoriels peuvent être trivial ou délicate et longue, en fonction de la morphologie et la taille de l&#39;insecte. Récupération de l&#39;ARN de haute qualité peut exiger un peu de dépannage ainsi, comme éviter certains pigments courscollecte de tissu. Tout en montrant les effets de composés répulsifs par des essais de comportement est directe et informative, cette approche exige beaucoup de temps et de large par rapport au mécanisme d&#39;action. Électrophysiologie couplé avec l&#39;ARN-seq permet des analyses plus spécifiques de ce qui motive les comportements d&#39;évitement chez les insectes. Une fois que la &quot;boîte à outils&quot; de la discrimination chimique a été identifiée dans une espèce d&#39;insecte, des tentatives plus spécifiques visant à améliorer le répulsifs connus sont possibles. Récepteurs et des protéines associées dans les cellules sensorielles responsables de ces comportements peuvent être exprimées de manière hétérologue pour le dépistage chimique directe. En outre, la modélisation moléculaire peut prédire quels produits chimiques seront obtenir de fortes réponses de ces récepteurs 7. L&#39;instantané de tous les gènes actifs dans un ensemble restreint de tissus chimiosensoriels peut également être utile dans l&#39;identification des gènes similaires dans d&#39;autres espèces. Utilisation homologie de séquence et d&#39;expression similarities, les chercheurs peuvent former des ensembles de récepteurs moléculaires les plus susceptibles de médiation réponses aux répulsifs qui sont largement efficaces sur les insectes. Nous présentons le protocole suivant pour aider les chercheurs à déconstruire voies chimiosensoriels insectes et de convaincre plus de se plonger dans l&#39;neuroéthologie de non-modèle et les insectes économiquement importants.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1272">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:367px;">Company</td>
			<td style="width:189px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:467px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Glass capillary</td>
			<td style="width:367px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:189px;">628000</td>
			<td>Standard, 1.5mm X 0.86mm, 4&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Silver wire</td>
			<td style="width:367px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:189px;">7875</td>
			<td>.015&#34; bare</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tungsten wire</td>
			<td style="width:367px;">Alfa Products</td>
			<td style="width:189px;">369</td>
			<td>0.127mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Fine forceps</td>
			<td style="width:367px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:189px;">11252</td>
			<td>#5SF Inox</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Refridgerated stage</td>
			<td style="width:367px;">BioQuip Products</td>
			<td style="width:189px;">1429</td>
			<td>Chill Table</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Preamplifier</td>
			<td style="width:367px;">Syntech</td>
			<td style="width:189px;">Taste Probe</td>
			<td style="width:467px;">preamplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Software for electrophysiology</td>
			<td style="width:367px;">Syntech</td>
			<td style="width:189px;">Autospike</td>
			<td style="width:467px;">software for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">TetraMin fish food</td>
			<td style="width:367px;">Tetra</td>
			<td style="width:189px;">Tropical fish food granules</td>
			<td>fish food ground to fine powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRIzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596-026</td>
			<td>RNA isolation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:189px;">74136</td>
			<td style="width:467px;">includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Nano Drop Products</td>
			<td style="width:189px;">ND-1000</td>
			<td>tabletop spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:251px;">R statistics</td>
			<td style="width:367px;">freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)</td>
			<td>www.r-project.org</td>
			<td>Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">1.5ml tube rack</td>
			<td style="width:367px;">Evergreen</td>
			<td style="width:189px;">240-6388-030</td>
			<td>Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">1.5mL collection tubes with pestle</td>
			<td style="width:367px;">Grainger</td>
			<td style="width:189px;">6HAX6</td>
			<td>RNase free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:367px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:189px;">11178160</td>
			<td>Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 mL tube.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primer-BLAST Primer Designing tool</td>
			<td style="width:367px;">NCBI</td>
			<td style="width:189px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

physiological recordings and rna sequencing of the gustatory appendages of the yellow-fever mosquito aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Les enregistrements des traces de potentiels d&#39;action Ae. aegypti sensilles gustatives (Figure 1) démontrer l&#39;efficacité de la stimulation directe avec une gamme de produits chimiques. Cette technique peut être utilisée pour quantifier les réponses à tout produit chimique stimulant en comptant les pointes d&#39;une amplitude et la durée donnée sur une plage de temps raisonnable (généralement moins de 500 ms). enregistrements de trace doivent être facilement reproductibles dan...

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Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

L&#39;utilisation de deux méthodes pour estimer l&#39;expression des gènes dans les grands appendices gustatives de Aedes aegypti, nous avons identifié l&#39;ensemble des gènes sous-jacents supposément les réponses neuronales à des composés amers et de répulsion, comme déterminé par l&#39;examen électrophysiologique.

Physiologiques Recordings et ARN séquençage des annexes gustatives du Mosquito fièvre jaune<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

8.0K vues.  United States Department of Agriculture.  L'utilisation de deux méthodes pour estimer l'expression des gènes dans les grands appendices gustatives de Aedes aegypti, nous avons identifié l'ensemble des gènes sous-jacents supposément les réponses neuronales à des composés amers et de répulsion, comme déterminé par l'examen électrophysiologique. 

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Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections.   Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections. Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

Bâtir un meilleur moustique: l&#39;identification des gènes de résistance Activation fièvre malaria et la dengue chez A. gambiae et A. aegypti

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

Recherche

Biologie

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion rate. This method can be used to obtain a better understanding of the process of diuresis in insects and is especially useful in the study of diuresis in blood-feeding arthropods that are able to take up huge amounts of liquid in a single blood meal. 
This RNAi-mediated gene knockdown combined with an in vivo diuresis assay was developed by the Hansen lab to study the effects of RNAi-mediated knockdown of aquaporin genes on Aedes aegypti mosquito diuresis1. 
The protocol is setup in two parts: the first demonstration illustrates how to construct a simple mosquito injection device and how to prepare and inject dsRNA into the thorax of mosquitoes for RNAi-mediated gene knockdown. The second demonstration illustrates how to determine excretion rates in mosquitoes using an in vivo bioassay.

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

In this protocol we combine RNAi-mediated gene silencing with an in vivo diuresis assay to study the effects knockdown of genes of interest has on mosquito fluid excretion.

Inactivation génique médiée par ARNi et<em&gt; In Vivo</emEssai diurèse&gt; Femmes adultes<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Les moustiques

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity and functionality of the gut community will provide insight into the effects of gut microbiota on mosquito life traits. Metagenomic RNA-Seq has become an important tool to analyze transcriptomes from various microbes present in a microbial community. Messenger RNA usually comprises only 1-3% of total RNA, while rRNA constitutes approximately 90%. It is challenging to enrich messenger RNA from a metagenomic microbial RNA sample because most prokaryotic mRNA species lack stable poly(A) tails. This prevents oligo d(T) mediated mRNA isolation. Here, we describe a protocol that employs sample derived rRNA capture probes to remove rRNA from a metagenomic total RNA sample. To begin, both mosquito and microbial small and large subunit rRNA fragments are amplified from a metagenomic community DNA sample. Then, the community specific biotinylated antisense ribosomal RNA probes are synthesized in vitro using T7 RNA polymerase. The biotinylated rRNA probes are hybridized to the total RNA. The hybrids are captured by streptavidin-coated beads and removed from the total RNA. This subtraction-based protocol efficiently removes both mosquito and microbial rRNA from the total RNA sample. The mRNA enriched sample is further processed for RNA amplification and RNA-Seq.

A ribosomal RNA (rRNA) depletion protocol was developed to enrich messenger RNA (mRNA) for RNA-seq of the mosquito gut metatranscriptome. Sample specific rRNA probes, which were used to remove rRNA via subtraction, were created from the mosquito and its gut microbes. Performance of the protocol can result in the removal of approximately 90-99% of rRNA.

L&#39;appauvrissement de l&#39;ARN ribosomique pour métagénomique Gut Mosquito ARN-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

La nouvelle génération de séquençage de l&#39;ARN ribosomal 16S gènes amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Un protocole expérimental et de la bioinformatique pour les analyses d&#39;ARN-Seq de la photopériode diapause dans le Asian Tiger Mosquito,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

Identification des facteurs clés de régulation auto-renouvellement et de différenciation dans les cellules hématopoïétiques précurseurs EML par l&#39;analyse de l&#39;ARN-séquençage

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Ciblées ARN Séquençage Assay pour caractériser l&#39;expression génique et génomique Transformations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect fat body tissue is usually distributed throughout the insect body. However, it is often concentrated in the abdomen and attached to the abdominal body wall.
The mosquito fat body is the sole source of yolk proteins, which are critical for egg production. Therefore, the in vitro culture of mosquito fat body tissues represents an important system for the study of mosquito physiology, metabolism, and, ultimately, egg production. The fat body culture process begins with the preparation of solutions and reagents, including amino acid stock solutions, Aedes physiological saline salt stock solution (APS), calcium stock solution, and fat body culture medium. The process continues with fat body dissection, followed by an experimental treatment. After treatment, a variety of different analyses can be performed, including RNA sequencing (RNA-Seq), qPCR, Western blots, proteomics, and metabolomics.
In our example experiment, we demonstrate the protocol through the excision and culture of fat bodies from the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, a principal vector of arboviruses including dengue, chikungunya, and Zika. RNA from fat bodies cultured under a physiological condition known to upregulate yolk proteins versus the control were subject to RNA-Seq analysis to demonstrate the potential utility of this procedure for investigations of gene expression.

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The fat body is the central metabolic organ in insects. We present a live organ culture system that enables the user to study the responses of isolated fat body tissue to various stimuli.

Système de Culture ou organe de corps gras chez Aedes Aegypti, vecteur de Virus Zika

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

Maintenir les moustiques Aedes aegypti infectés par Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness parameters, in particular egg production and hatch rates at the individual level, conventional methods have put a substantial burden on investigators due to high labor intensity and laboratory space requirements. Described is a simple method using 24 well tissue culture plate with agarose in each well and digital imaging of each well to determine egg numbers and hatch rates at an individual level with substantially reduced time and space requirements.

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Described is a time and space-saving method to count eggs and determine hatch rates of individual mosquitoes using 24 well tissue culture plates, which can substantially increase the scale and speed of fecundity and fertility assays.

Amélioration de la fécondité et de la fertilité pour Aedes aegypti à l’aide de 24 plaques de culture tissulaire de puits (plaques EAgaL)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...