Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH à DJB (AI041930, AI073142, AI075931 et AI091461).

<ol>
	<li>Fox, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+Toxoplasma+gondii+KU80+knockout+strains+enable+functional+analysis+of+genes+required+for+cyst+development+and+latent+infection.">Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection.</a> Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).</li><li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining.">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).</li><li>Fox, B. A., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avirulent+uracil+auxotrophs+based+on+disruption+of+orotidine-5'-monophosphate+decarboxylase+elicit+protective+immunity+to+Toxoplasma+gondii.">Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii.</a> Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).</li><li>Hortua Triana, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+molecular+characterization+of+the+pyrimidine+biosynthetic+enzyme+dihydroorotate+dehydrogenase+from+Toxoplasma+gondii.">Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+the+model+apicomplexan.">Toxoplasma gondii: the model apicomplexan.</a> Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).</li><li>Gajria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToxoDB:+an+integrated+Toxoplasma+gondii+database+resource.">ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource.</a> Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma:+the+next+100+years.">Toxoplasma: the next 100 years.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).</li><li>Butcher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+rhoptry+kinase+ROP16+activates+STAT3+and+STAT6+resulting+in+cytokine+inhibition+and+arginase-1-dependent+growth+control.">Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control.</a> PLoS pathogens. 7, e1002236 (2011).</li><li>Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+Toxoplasma+gondii+formin+3,+an+actin+nucleator+dispensable+for+tachyzoite+growth+and+motility.">Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility.</a> Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).</li><li>Fentress, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence.">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li><li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA.">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li><li>Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moving+junction+protein+RON8+facilitates+firm+attachment+and+host+cell+invasion+in+Toxoplasma+gondii.">The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii.</a> PLos Pathog. 7, e1002007 (2011).</li><li>Szatanek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cactin+is+essential+for+G1+progression+in+Toxoplasma+gondii.">Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).</li><li>Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+tagging,+cloning,+and+expression+of+the+Toxoplasma+gondii+hypoxanthine-xanthine-guanine+phosphoribosyltransferase+gene.+Use+as+a+selectable+marker+for+stable+transformation.">Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation.</a> J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).</li><li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii:+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis.">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+characterization+of+a+mutant+resistant+to+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).</li><li>Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination-mediated+PCR-directed+plasmid+construction+in+vivo+in+yeast.">Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast.</a> Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).</li><li>Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+lacks+the+enzymes+required+for+de+novo+arginine+biosynthesis+and+arginine+starvation+triggers+cyst+formation.">Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation.</a> Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).</li><li>Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+tools+for+the+identification+and+analysis+of+drug+targets+in+Toxoplasma+gondii.">Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).</li><li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).</li><li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction.">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).</li><li>vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+'intracellular'+buffer+increases+cell+survival.">Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2902 (1992).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+mechanism+of+the+parasitostatic+action+of+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).</li><li>Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+expression+of+Toxoplasma+gondii+apical+membrane+antigen-1+(TgAMA1)+demonstrates+that+TgAMA1+plays+a+critical+role+in+host+cell+invasion.">Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Ici nous fournissons un protocole de gène ciblage efficace dans Δ Ku80 souches de parasites afin de permettre la récupération efficace de la descendance génétiquement manipulés qui possèdent des suppressions ciblées de gènes, les remplacements de gènes et / ou de gènes marqués. L&#39;exécution séquentielle de ces méthodes permet une approche fiable pour l&#39;isolement de mutants de parasites qui contiennent des manipulations génétiques ciblées simples ou multiples 3.1. Alors que la génération d&#39;une délétion ciblée dépend de multiples facteurs, l&#39;utilisation de la souche Δ Ku80 avec la stratégie présentée et le protocole augmente considérablement l&#39;efficacité et la facilité de faire des souches mutantes définies précisément de T. gondii pour les études de génomique fonctionnelle. Le génome de T. gondii durant les stades asexués est haploïde. Ainsi, une étude à faire lors de la planification de supprimer un gène est que le gène ne doit pas être indispensable in vitro. Néanmoins, l&#39;efficacité de la targeTing KO gènes dans Ku80 souches Δ est extrêmement élevé, ce qui permet l&#39;isolement de souches mutantes avec des taux de réplication avec facultés affaiblies de manière significative. Si un gène ciblé est essentiel, parasites cessent souvent à reproduire lors de la sélection. Un autre facteur essentiel dans la manipulation génétique ciblée est que l&#39;homologie parfaite avec au moins 620 pb du flanc ciblage génomique est nécessaire pour obtenir des intégrations ciblées détectables 2. Régions plus d&#39;homologie produisent des rendements plus élevés du ciblage et de l&#39;aide ciblant les flancs d&#39;ADN d&#39;environ 1000 paires de bases est une méthode fiable et efficace 1-4. Pour cette raison, il est important que les flancs ciblant génomiques sont générées à partir de la même souche de T. gondii (RH, Pru) que la souche qui est génétiquement manipulée. Le manque d&#39;homologie suffisante peut souvent se traduire par l&#39;intégration ciblée d&#39;un flanc de ciblage génomique, mais pas l&#39;autre. Intégration incomplète ou défaut d&#39;obtenir une maîtrise de finaley soyez aussi en raison de la persistance épisomal. Immédiatement après transfection, toutes les molécules de ciblage sont non intégrés qu&#39;épisomes, et parfois molécules ciblant peut persister tant qu&#39;épisomes pour de nombreuses générations. Utilisation de flancs d&#39;ADN cible d&#39;environ 1 kpb et de continuer à faire passer les parasites sous sélection avant ré-sous-clonage a souvent des problèmes liés à la persistance épisomique. Une fois un coup de grâce est validée et le marqueur HXGPRT est enlevé, la stratégie de ciblage de gène peut être répété sur une deuxième GOI pour générer de multiples suppressions de gènes dans une souche de parasite unique 1-3. La génération des suppressions, des remplacements ou des gènes marqués peut également être réalisé en utilisant différents marqueurs sélectionnables (bléomycine, CAT, pyriméthamine résistant DHFR, etc.) Bien que le CAT marqueur de sélection est actuellement présent dans le type II Δ Ku80 Pru génome 1, ce marqueur peut être enlevé en utilisant le HXGPRT </em&gt; protocole de sélection décrites ici. Dans nos mains, la sélection HXGPRT est le plus sûr et le marqueur le plus efficace avec l&#39;efficacité du ciblage le plus élevé où une seule copie insertion ciblée est suffisante pour la sélection robuste MPA + X moyenne. HXGPRT fournit également la seule approche actuellement utile pour la suppression ciblée d&#39;un marqueur de sélection (figure 3) à l&#39;aide de 6 thioxanthine (6TX) 2,3 sélection. Ainsi, ce protocole constitue la seule approche actuelle pour le développement de souches mutantes définis avec plusieurs manipulations génétiques ciblées. Ce protocole fournit une méthode utile et efficace pour la manipulation génétique ciblée dans Δ Ku80 souches de Toxoplasma gondii et est applicable à l&#39;analyse d&#39;un seul gène, une famille de gènes, ou des études de génomique fonctionnelle du génome entier. Avant la disponibilité de Δ Ku80 souches 1,2, ces approches ne sont pas largement faisable en raison de l&#39;INEFficiency de ces méthodes. Par conséquent, ce protocole est largement applicable pour la manipulation génétique ciblée de Toxoplasma gondii et est accessible à tous les chercheurs intéressés à relever un certain nombre de questions sur la biologie du parasite, la réponse de l&#39;hôte, et la génomique fonctionnelle.

Toxoplasma gondii est un parasite obligatoire de protozoaire intracellulaire commun que fréquemment et infecte chroniquement un large éventail d&#39;animaux et les humains 5. On estime que plus de 1 milliard d&#39;êtres humains sont actuellement et chroniquement infectés par ce pathogène. En plus de l&#39;importance de la maladie causée par T. gondii infection, la disponibilité croissante des outils expérimentaux, les ressources génomiques puissantes 6, la facilité de croissance in vitro et d&#39;excellents modèles de souris ont fait T. gondii un système modèle de premier plan pour l&#39;étude plus large de pathogènes eucaryotes intracellulaires et d&#39;autres parasites apicomplexes importants qui causent des maladies dévastatrices comme le paludisme (Plasmodium sp.) et la cryptosporidiose (Cryptosporidium) 5,7. Une limitation importante de Toxoplasma gondii comme un organisme modèle a été la récupération inefficace des descendants qui transportent ciblé manipulations génétiques. Ce problem en ciblage génique est due à une faible fréquence de recombinaison homologue par rapport à la très haute fréquence de recombinaison non homologue dans les souches de type sauvage de T. gondii, même quand une homologie de l&#39;ADN est prévu dans des molécules cibles d&#39;ADN utilisées dans les études génétiques 2. Nous avons récemment génétiquement bloqué la principale voie de recombinaison non homologue de type I et souches de Toxoplasma gondii de type II par la suppression du gène codant pour la protéine de 1,2 Ku80. Le type résultant I et Ku80 souches Δ type II présentent des taux de croissance normale, la taille et le comportement à la fois in vitro et in vivo au cours de tachyzoite et étapes bradyzoïte in vitro et in vivo, cependant, ces souches présentent essentiellement une fréquence de 100% de la recombinaison homologue et cette phénotype augmente la probabilité d&#39;isoler rapidement la progéniture désirée de manipulations génétiques ciblées par plusieurs centaines à plusieurs thoUSand fois 1,2,4. À l&#39;échelle communautaire utilisation récente de type I et de type II souches Δ Ku80 a considérablement intensifié le rythme, la variété, ainsi que le taux de réussite des approches génétiques ciblées dans T. gondii 1-4,8-13. Nous décrivons ici un protocole complet pour la suppression ciblée des gènes, le remplacement d&#39;un gène, et le marquage des gènes dans Δ Ku80 souches de T. gondii. Nous démontrons comment concevoir et cibler de manière fiable les manipulations génétiques à des gènes spécifiques ou loci génétiques dans Δ Ku80 souches de Toxoplasma gondii.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overlap Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4 nmole Ultramer DNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Validation Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>100 nmole DNA Oligo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Strain #90845</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Designation FY834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shuttle Vector pRS416</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>87521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10B E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12033-015</td>
			<td>SOC broth in kit with E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-BG05</td>
			<td>0.5 mm acid-washed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiacube Automated Robotic Work Station</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>2 mm-gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX600 electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12662</td>
			<td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 Canted neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430168</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 cm2 Canted Neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430823</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC1041</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swin-lok Filter Holder</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>420200</td>
			<td>25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110612</td>
			<td>Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycophenolic acid (MPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xanthine (X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Eagle Media</td>
			<td>Lonza Biowhittaker</td>
			<td>12-611F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-111</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Column</td>
			<td>Primm Labs</td>
			<td>PAE-100</td>
			<td>Easy Clean DNA Extraction Spin Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-thioxanthine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue DNA Minikit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Freeze/Recovery Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>126-48-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>minus calcium, minus magensium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation in &delta;ku80 strains for functional genomic analysis of toxoplasma gondii

Manipulation génétique ciblée utilisant la recombinaison homologue est la méthode de choix pour l&#39;analyse génomique fonctionnelle pour obtenir une vue détaillée de la fonction des gènes et le phénotype (s). Le développement de souches mutantes présentant des délétions ciblées de gènes, les mutations ciblées, la fonction des gènes complété et / ou des gènes marqués fournit de puissantes stratégies pour aborder la fonction des gènes, en particulier si ces manipulations génétiques peuvent être ciblées efficacement pour le locus du gène d&#39;intérêt en utilisant la médiation d&#39;intégration en double traverser la recombinaison homologue. En raison des taux très élevés de recombinaison non homologue, l&#39;analyse génomique fonctionnelle de Toxoplasma gondii a été précédemment limitée par l&#39;absence de méthodes efficaces pour cibler la délétion de gènes et les remplacements de gènes de loci génétiques spécifiques. Récemment, nous avons aboli la principale voie de recombinaison non homologue de type I et souches de T. type II gondii en supprimant le gène encoding le 1,2 de protéine Ku80. Les souches Δku80 se comportent normalement pendant tachyzoite (aiguë) et bradyzoïte (chronique) Cycle in vitro et in vivo et présentent essentiellement une fréquence de 100% de la recombinaison homologue. Les souches Ku80 Δ font des études génomiques fonctionnelles faisable sur le gène unique ainsi que sur l&#39;échelle du génome 1-4. Ici, nous rapportons méthodes d&#39;utilisation de type I et de type II souches Δku80Δhxgprt d&#39;avancer méthodes de ciblage de gènes dans T. gondii. Nous présentons des méthodes efficaces pour engendrer des délétions de gènes, les remplacements de gènes, et les gènes marqués par insertion ciblée ou la suppression de la phosphoribosyltransferase (HXGPRT) marqueur de sélection hypoxanthine-xanthine-guanine. Le gène décrit le ciblage protocole peut être utilisé dans une variété de façons Δku80 souches pour faire avancer l&#39;analyse fonctionnelle du génome du parasite et de développer des souches uniques qui portentmultiple ciblé manipulations génétiques. L&#39;application de cette méthode génétique et tests phénotypiques suivantes révélera des aspects fondamentaux et unique de la biologie de T. gondii et des agents pathogènes humains importants liés qui causent le paludisme (Plasmodium sp.) et la cryptosporidiose (Cryptosporidium).

Un modèle détaillé est prévu pour la construction d&#39;un plasmide de criblage pour supprimer un gène, comprenant la mise en place des sites d&#39;enzymes de restriction et de la génération des amorces qui facilitent le ciblage génétique et la validation de ciblage de gène, ainsi que la construction plasmidique de la suppression subséquente de HXGPRT dans un processus en une seule étape (Figures 1A-C, Figure 2A, figure 3A). Un schéma général est présenté pour faire une délétion du gène ciblé (figure 2A), les paires d&#39;amorces utilisées pour valider la suppression d&#39;un coup de grâce, par exemple, de type I rop18 (figure 2B), et des résultats représentatifs de la validation PCR sont représentées (figure 2C). Ce résultat représentatif est présenté pour illustrer l&#39;éventail des résultats qui peuvent être obtenus à des loci génétiques qui sont relativement difficiles à cibler. Une délétion de gène ciblé avec succès se traduira par l&#39;absence du gène de l&#39;enintérêt produit PCR (PCR 1), la présence de l&#39;extrémité 3 &#39;flanc ciblage génomique (PCR2), et la présence du marqueur sélectionnable HXGPRT correctement intégrée entre l&#39;extrémité 5&#39; et les flancs de ciblage génomique 3 &#39;qui définissent la suppression (PCR3 et PCR4) . Clones 3, 4, 5, 6, 8, 9, et 11 sont validés délétion de gènes ciblés (KO) où HXGPRT a remplacé le GOI (figure 2C). Un clone qui ne contient pas une délétion du gène peut être représentée par une série de profils de bandes. Typiquement, un clone sans délétion du gène reflétera la souche parentale (modèle parental) avec des bandes observées pour PCR1 et PCR2, mais pas pour PCR3 ou PCR4 comme on le voit pour les clones 1 et 2 (figure 2C). Ce &quot;modèle parental&quot; se pose de quelques mécanismes potentiels. De temps en temps, MPA parasites résistants sélectionnés portent qu&#39;épisomes persistant non intégrés de la pΔGOI ciblant plasmide, et nous notons que la sélection continue oblige souvent ces qu&#39;épisomesà intégrer. On observe également un certain arrière-plan rare dans le type I Δ Ku80 déformation en raison de l&#39;intégration involontaire du pΔGOI ciblage plasmide, qui contient un ADNc HXGPRT exprimée par DHFR 5 &#39;et 3&#39; des éléments promoteurs, soit dans le locus DHFR ou dans l&#39;HXGPRT partiellement délété locus 14. Bien que cet événement rare est une intégration ciblée, ce n&#39;était pas l&#39;intégration prévue et sert de point clé à retenir dans la conception de toute stratégie de remplacement de gènes. ADN homologie supérieure à 120 pb effectuées sur votre pΔGOI ciblage plasmide peut fournir un site alternatif pour la recombinaison dans Ku80 souches Δ 2 qui pourrait redonner un fond indésirable. En Pru souche de type II Δ Ku80 ce contexte est réduit ou inexistant par rapport au type I parce que le marqueur de sélection HXGPRT est basée sur le type I séquences qui ont polymorphismes d&#39;un nucléotide par rapport à l&#39;ADN de type II quidiminue fortement ce fond rare dans les expériences utilisant le type II Pru Δ Ku80 souche 1. Si un locus du gène est essentiel (ne peut pas être supprimé), ou a un gène extrêmement faible ciblage fréquence au niveau du locus, ou s&#39;il persiste [non intégrés] qu&#39;épisomes ne sont pas facilement éliminés par la croissance et de la sélection, ce modèle parental va dominer la tendance observée dans le MPA clones résistants. Sinon, la molécule d&#39;ADN de ciblage est parfois observée à intégrer à seulement 5 &#39;ou 3&#39; flanc ciblage génomique et une bande est observée pour les deux PCR3 ou PCR4 (mais pas les deux) avec PCR1 et PCR2 comme on le voit pour le clone 10 (5 &#39;intégration) et clone 7 (3&#39; intégration) (figure 2C). Ces modèles suggèrent l&#39;apparition fréquente d&#39;une seule croix sur l&#39;intégration de la cible plasmide au niveau du locus qui intègre HXGPRT mais cette intégration ciblée ne supprime pas le gène d&#39;intérêt. Ce modèle (lignes 7 et 10 de la figure 2C) emphasizes la nécessité de communiquer des données de PCR pour vérifier que l&#39;intégration ciblée s&#39;est produite au lieu d&#39;un seul croisement homologue dessus et une seconde intégration non homologue de la molécule de ciblage. Rarement, on observe un mélange génétique représentée par le clone 12 (figure 2C) qui représente à la fois un modèle parental et un motif de suppression ciblée. Cette tendance résulte probablement à l&#39;occasion de deux génotypes parasitaires qui sont présents au même endroit dans un clonage bien. Un schéma général pour la suppression des HXGPRT de Δ ku80Δgoi :: HXGPRT supprimer HXGPRT de la souche est affichée (figure 3A). La paire d&#39;amorces utilisé pour valider la suppression de HXGPRT de Δ Δ Ku80 GRA2 :: HXGPRT (figure 3B) amplifie une bande de Kbp unique de ~ 1,2 à PCR5 comme on le voit dans les clones 4, 7, 9, 11 et 12 (figure 3C). Si HXGPRT n&#39;est pas retiré de l&#39;locus, a ~ 3.4 bandes Kbp est observée (clones 1, 2, 3, 6, 8, 10, et le contrôle parental). Plusieurs mécanismes agissent pour rendre le retrait de HXGPRT (6TX sélection) plus difficile et moins efficace que l&#39;intégration des HXGPRT (MPA + X sélection). Sélection MPA est tout simplement plus efficace que 6TX sélection 14,16. En outre, la hausse des niveaux d&#39;expression HXGPRT sont nécessaires pour la sélection 6TX que pour les AMP sélections 16,24. En conséquence, les mutations qui peuvent réduire l&#39;activité enzymatique HXGPRT ou mutations ou les changements épigénétiques qui réduisent le niveau d&#39;expression de HXGPRT au locus d&#39;un gène peuvent potentiellement abolir l&#39;efficacité de la sélection 6TX. Même avec ces problèmes de sélection 6TX, le taux de réussite de la sélection des souches 6TX Ku80 Δ est supérieur à 90% à la première tentative 1-3. Un schéma général pour le marquage C-terminal direct de gènes codant pour des protéines est affichée (Figure 4). Cettesystème utilise une intégration directe via un double croix sur la recombinaison homologue de HXGPRT 3 &#39;du gène marqués et emploie également des stratégies de validation similaires à celles décrites ci-dessus. Quand un gène est soupçonné d&#39;être un gène essentiel ceci peut être vérifié à l&#39;aide d&#39;une deuxième transfection avec un ciblage de l&#39;ADN isolé indépendamment plasmide. D&#39;autres méthodes, comme les systèmes d&#39;expression de gène régulé, sont disponibles pour vérifier davantage si un gène est essentiel 25. <img alt="Figure 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1.jpg" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble de la conception d&#39;un ciblage de l&#39;ADN plasmidique. Une. Schématique de la conception chevauchent amorces utilisées pour amplifier par PCR la région 5 &#39;et 3&#39; des flancs de cibles avec 33 pb pour chevauche le vecteur pRS416 de navette et HXGPRT cassette minigène. Amorces décrites dans le schéma ont étéutilisé pour générer en 5 &#39;et 3&#39; des flancs de cibles de pΔROP18 10. B. stratégie globale pour la conception d&#39;une molécule d&#39;ADN de ciblage. L&#39;épine dorsale de pΔGOI est le vecteur pRS416 navette contenant de l&#39;uracile (URA) et l&#39;ampicilline (AMP) marqueurs sélectionnables. Placée dans pRS416 est une ~ 1 kpb 5 &#39;ADN flanc cible amplifié à partir d&#39;ADN génomique avec chevauchement pour la cassette de minigène HXGPRT et pRS416 utilisant les amorces F1 et R1, a ~ 1 kpb 3&#39; ADN flanc cible est amplifiée à partir d&#39;ADN génomique avec chevauchement pour la cassette de minigène HXGPRT pRS416 et en utilisant les amorces F2 et R2 et la cassette d&#39;minigène HXGPRT. Les sites de digestion par des enzymes de restriction uniques suivants sont ajoutés aux amorces: RE.X (l&#39;enzyme de restriction site de coupure X) dans l&#39;amorce F1 à couper le plasmide à l&#39;extrémité 5 &#39;de l&#39;extrémité 5&#39; ADN flanc cible, dans le R2 RE.Y amorce à couper le plasmide à «la fin de la 3 &#39;du 3 ADN flanc cible et RE.Z dans les amorces R1 et F2 pour exciser le HXGPRT minLes séquences des amorces de cassettes de igene. C. utilisées pour générer la construction de ciblage pour la suppression de rop18. Les régions gras correspondent à T. la séquence génomique de Toxoplasma, et les régions non gras correspondent aux sites d&#39;enzymes de restriction et des séquences qui se chevauchent avec pRS416 et la cassette de minigène HXGPRT. La paire d&#39;amorces HX_F et HX_R amplifie le HXGPRT cassettes mini-gène 14. Primaires lus de 5 &#39;à 3&#39;. Tableau adapté de Fentress et al 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 2" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2.jpg" /> Figure 2. Présentation du protocole pour la suppression d&#39;un gène à l&#39;aide HXGPRT. Une. Disruption d&#39;un GOI dans la souche Δ ku80Δhxgprt par un double croisement homologue d&#39;événement de recombinaison avec une ~ 1 kpb 5 &#39;ADN flanc de la cible et une ~ 1 kpb 3&#39; ADN cible sur le flanc pΔGOI plasmide. Une stratégie PCR en utilisant PCR1, PCR2, PCR3 et PCR4 (pas à l&#39;échelle) est démontré que permet la vérification du génotype de valider clones avec l&#39;intégration ciblée de HXGPRT et la suppression du locus GOI. B. paires d&#39;amorces de représentation destiné à valider la suppression de rop18 . ROP18_DF et ROP18_DR amplifient PCR1, ROP18_ExF et ROP18_CxR amplifient PCR2, ROP18_CxF et DHFR_CxR amplifient PCR3 et DHFR_CxF et ROP18_CxR amplifier PCR4 (voir figure 2A). Primaires lus de 5 &#39;à 3&#39;. Tableau adapté de Fentress et al 10. C. Les résultats représentatifs de la validation d&#39;une délétion du gène ciblé (rop18) en utilisant HXGPRT. Après la transfection d&#39;un plasmide pΔROP18 dans Δ ku80Δhxgprt et la sélection dans MPA +X, MPA + X clones résistants ont été testés pour la suppression de rop18. Le contrôle de la souche parentale est positif pour PCR 1 (~ 400 pb) et PCR 2 (~ 650 pb) produit et négatifs pour PCR 3 (~ 1200 pb) et PCR 4 (~ 1300 pb) produit. Un knock-out GOI ciblée est positif pour les produits PCR2, pCR3 et PCR4 et est négatif pour le 1er produit de PCR (voir figure 2A). Indiqués sont des panneaux représentatifs des résultats de PCR1 et PCR2 (panneau supérieur), pCR3 (panneau du milieu), et PCR4 (panneau du bas). Les clones 3, 4, 5, 6, 8, 9 et 11 présentent le profil de bandes correcte de PCR 1, PCR2, et PCR3 PCR4 qui définit un événement de suppression d&#39;un gène ciblé dans le clone. Les clones 1, 2, 7, 10 et 12 ne sont pas la délétion de gènes, et correspondent à d&#39;autres résultats représentatifs potentiels. (C = souche de contrôle parental Δ ku80Δhxgprt, M = marqueurs de taille). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3.jpg" /> Figure 3. Présentation du protocole de re-ciblage du gène d&#39;intérêt à supprimer HXGPRT. A. La stratégie pour l&#39;élimination du marqueur sélectionnable HXGPRT par un double croisement homologue d&#39;événements de recombinaison dans la souche Δ ku80Δgoi :: HXGPRT utilisant une ~ 1 kpb 5 &#39;ADN flanc de la cible et une ~ 1 kpb 3&#39; ADN flanc cible sur pΔGOIc plasmide. La stratégie PCR pour la vérification du génotype est représenté en utilisant une paire d&#39;amorces pour doser un produit de PCR (PCR5) qui s&#39;étend sur la suppression (et non à l&#39;échelle). B. Une paire d&#39;amorces représentant conçu pour valider l&#39;élimination du marqueur sélectionnable HXGPRT du GRA2 lieu dans la souche Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. Primaires GRA2 _CLF et GRA2_CxR amplifient PCR5. Primaires<html> lire à partir de 5 &#39;à 3&#39; panneau C. représentatif. des clones 6TX résistants qui peuvent être obtenus suite à la transfection de plasmide dans pΔGOIc Δ ku80Δgoi :: HXGPRT et la sélection dans 6TX. Les clones 4, 7, 9, 11 et 12 présentent le profil de bandes de PCR5 correcte qui correspond à la délétion ciblée du marqueur HXGPRT (~ 1,2 kpb produit qui s&#39;étend sur «flanc avec léger recouvrement avec l&#39;extrémité 5 &#39;du flanc 3 et l&#39;extérieur de l&#39;extrémité 3&#39; flanc). Les clones 1, 2, 3, 6, 8 et 10 (cette bande est la lumière) représentent le motif de bandes attendue de l&#39;ordre de ~ 3,4 kbp qui correspond au génotype de clone parental, même si ces clones présentaient un degré de résistance au 6TX qui ont permis leur choix (ce phénotype peut parfois survenir spontanément par l&#39;arrêt de l&#39;expression HXGPRT (voir la note dans le protocole 2.1 (étape 8) et l&#39;article Résultats de représentant). (c = contrainte de contrôle parental Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = marqueurs de taille).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir la figure. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4.jpg" /> Figure 4. Conception d&#39;une molécule d&#39;ADN de ciblage pour marquer l&#39;extrémité C-terminale d&#39;une protéine. Cette stratégie repose sur la capacité du marqueur HXGPRT à fonctionner aussi comme région de régulation en aval 3 &#39;. L&#39;épine dorsale de pΔGOItag est le vecteur pRS416 navette contenant l&#39;uracile (URA) et l&#39;ampicilline (AMP) marqueurs sélectionnables. Placée dans pRS416 est une ~ 1 kpb 5 &#39;ADN flanc cible amplifié à partir d&#39;ADN génomique avec chevauchement pour la cassette de minigène HXGPRT et pRS416 utilisant le FGOI et rtag amorces, une ~ 1 kpb 3&#39; ADN flanc cible est amplifiée à partir d&#39;ADN génomique avec chevauchement pour la cassette mini-gène HXGPRT et pRS416 utilisant le F2 et R2amorces et la cassette mini-gène HXGPRT. L&#39;ADN 5 &#39;flanc cible remplace le codon de terminaison de l&#39;étiquette (HA, Myc, His, etc), suivi par un codon de terminaison de remplacement. AMP + X sélection intègre le tag C-terminal et un HXGPRT aval, et déplace la 3 &#39;UTR d&#39;une position à la suite du marqueur HXGPRT. Les sites de digestion par des enzymes de restriction uniques suivants sont ajoutés aux amorces: RE.X (l&#39;enzyme de restriction site de coupure X) dans la couche de fond FGOI pour couper le plasmide à l&#39;extrémité 5 &#39;de l&#39;extrémité 5&#39; ADN flanc cible, et dans le RE.Y R2 apprêt à couper le plasmide à «la fin de la 3 &#39;du 3 ADN flanc cible, et RE.Z dans le rtag et amorces F2 pour exciser la cassette mini-gène HXGPRT pour une utilisation pour la construction du plasmide de re-cibler le locus du gène marqués à supprimer le marqueur HXGPRT qui rétablira le placement de la 3 &#39;UTR.

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Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Nous rapportons ici une méthode d&#39;utilisation de type I et de type II<em&gt; Δku80</em&gt; Souches de<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Pour générer efficacement des suppressions de gènes ciblés et les remplacements de gènes pour l&#39;analyse génomique fonctionnelle.

Manipulation génétique<em&gt; Δku80</em&gt; Les souches pour l&#39;analyse génomique fonctionnelle de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

genetic-manipulation-ku80-strains-for-functional-genomic-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

16.9K vues.  The Geisel School of Medicine at Dartmouth. Nous rapportons ici une méthode d'utilisation de type I et de type II Δku80 Souches de Toxoplasma gondii Pour générer efficacement des suppressions de gènes ciblés et les remplacements de gènes pour l'analyse génomique fonctionnelle.

Vidéo: Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with causing food- and water-borne disease outbreaks. The definitive host is the feline species where sexual replication occurs resulting in the development of the highly infectious and environmentally resistant oocyst. Infection occurs via ingestion of tissue cysts from contaminated meat or oocysts from soil or water. Infection is typically asymptomatic in healthy individuals, but results in a life-long latent infection that can reactivate causing toxoplasmic encephalitis and death if the individual becomes immunocompromised. Meat contaminated with T. gondii cysts have been the primary source of infection in Europe and the United States, but recent changes in animal management and husbandry practices and improved food handling and processing procedures have significantly reduced the prevalence of T. gondii cysts in meat1, 2. Nonetheless, seroprevalence in humans remains relatively high suggesting that exposure from oocyst contaminated soil or water is likely. Indeed, waterborne outbreaks of toxoplasmosis have been reported worldwide supporting the theory exposure to the environmental oocyst form poses a significant health risk3-5. To date, research on understanding the prevalence of T. gondii oocysts in the water and environment are limited due to the lack of tools to detect oocysts in the environment 5, 6. This is primarily due to the lack of efficient purification protocols for obtaining large numbers of highly purified T gondii oocysts from infected cats for research purposes. This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation7.

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation

Obtention hautement purifiée Toxoplasma gondii Les oocystes par un gradient de chlorure de césium discontinu

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Recherche

Immunologie et infection

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Toxoplasma gondii Formation paroi du kyste dans la moelle osseuse Activé macrophages dérivés et Conditions Bradyzoite

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

Souris Transnuclear avec des spécificités T pré-définis Cell Receptor contre Toxoplasma gondii Obtenues par TNCS

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Un crible génétique pour isoler Toxoplasma gondii Mutants Egress de la cellule hôte

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its intractability to experimental transformation with recombinant DNA. We developed an approach to perform genetic analysis in C. trachomatis&#160;despite the lack of molecular genetic tools. Our method involves: i.) chemical mutagenesis to rapidly generate comprehensive libraries of genetically-defined mutants with distinct phenotypes; ii.) whole-genome sequencing (WGS) to map the underlying genetic lesions and to find associations between mutated gene(s) and a common phenotype; iii.) generation of recombinant strains through co-infection of mammalian cells with mutant and wild type bacteria. Accordingly, we were able to establish causal relationships between genotypes and phenotypes. The coupling of chemically-induced gene variation and WGS to establish correlative genotype&#8211;phenotype associations should be broadly applicable to the large list of medically and environmentally important microorganisms currently intractable to genetic analysis.

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

We describe a methodology to perform genetic analysis in Chlamydia based on chemical mutagenesis and whole genome sequencing. In addition, a system for DNA exchange within infected cells is described that can be used for genetic mapping. This method may be broadly applicable to microbial systems lacking transformation systems and molecular genetic tools.

Approches avant génétiques dans<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

Après en temps réel l&#39;impact des facteurs de virulence contre le pneumocoque dans une souris modèle pneumonie aiguë avec bactéries bioluminescentes

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Imagerie en temps réel des cellules myéloïdes Dynamique<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinale tumeurs par Spinning Disk microscopie confocale

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

Détection glycogène dans les cellules mononucléaires du sang périphérique avec l&#39;acide périodique Schiff coloration

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&amp;#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Forward Génétique écrans à l&#39;aide pour identifier les macrophages<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; gènes importants pour la résistance à l&#39;IFN-γ-cellulaire dépendant immunité autonome

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Dosage d’adhérence dynamiques pour l’analyse fonctionnelle des thérapies contre les adhérences dans la maladie intestinale inflammatoire

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...