1. Mutagenèse chimique Note: Nous avons constaté que la forme de RB réplicative est plus propice à la mutagenèse chimique que le formulaire de EB. Au milieu de cycle (entre 18 à 20 HPI), RBS sont au plus grand nombre avant la transition RB-EB. Parce que Chlamydia trachomatis est un pathogène intracellulaire obligatoire, les effets de l&#39;agent mutagène sur la santé de l&#39;hôte peut limiter la récupération bactérienne. Des cellules Vero ont été trouvés à être plus résistantes aux effets néfastes des niveaux élevés de SME que d&#39;autres lignées cellulaires testées. Séparation des mutations par recombinaison nécessite sélection pour antibiotique descendance recombinante résistant. Nous vous recommandons d&#39;utiliser des souches résistantes aux médicaments (par exemple rifampicine, la spectinomycine, ou triméthoprime) pour générer des mutants de la capacité d&#39;effectuer des analyses recombinant et d&#39;isoler des souches isogéniques. Souches résistantes aux antibiotiques ont été générés par un processus de sélection par étapes (15, 16). None: Chlamydia trachomatis (souche L2 / 434/Bu / ATCC VR902B) est BSL2 pathogène. Reportez-vous aux procédures d&#39;utilisation normalisées (SOP institutionnels) pour le traitement de ces agents pathogènes. <ol><li> Préparation des cellules en culture et de l&#39;infection: <ol><li> Seed environ 1 x 10 6 cellules Vero (ATCC CCL-81) par 25 cm 2 (T25) flacon dans 3 ml de Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS). Incuber à 37 ° C, 5% de CO 2. Les cellules doivent former une monocouche confluentes dans les 24 h. </li><li> Aspirer moyenne. Infect confluentes flacons T25 de cellules Vero avec Chlamydia à une multiplicité d&#39;infection (MOI) de 5 (~ 14 x 10 6) dans un volume total de 3 ml de milieu (DMEM, 200 ng / ml cyclohexamide, 10% de FBS). </li></ol></li><li> Commencez mutagenèse à 18 heures après l&#39;infection (HPI): <ol><li> Préparer 20 mg / ml EMS (Ethyl methanesulfonate) en phosphate salin (PBS) tamponnée avec 0,9 mM de calciumchlorure et chlorure de magnésium 0,49 mM dans une hotte de sécurité chimique EMS est un liquide volatil. Note: EMS est un mutagène puissant et cancérigène. Neutraliser EMS déchets et décontamination des déversements, plastique, papier, et la verrerie avec 1 M d&#39;hydroxyde de sodium. </li><li> Aspirer à moyen et laver les cellules une fois avec 3 ml de PBS / MgCl 2 / CaCl 2. Incuber les cellules avec 3 ml de 20 mg / ml dans le SME PBS / MgCl 2 / CaCl 2 pendant une heure dans la hotte à température ambiante. Les cellules Vero sont capables de survivre à cette concentration de SME et conditions en dehors de l&#39;incubateur pour de courtes périodes. N&#39;oubliez pas d&#39;inclure un échantillon de contrôle qui n&#39;a pas été mutagenèse. </li><li> Retirer milieu contenant SME et le placer dans un récipient de 1 M NaOH pour inactiver le mutagène. Laver les cellules infectées par 3 fois dans 3 ml de PBS + MgCl 2 / CaCl2 pour enlever mutagène résiduelle. Ajouter 6 ml de DMEM/10% FBS avec 200 ng / ml cyclohexamide et 25 pg / ml de gentamicine, et incuber à 5% de CO <sub&gt; 2, 37 ° C pendant 48 à 72 h. Inclusions semblent dépourvues de bactéries environ 36 heures après la mutagenèse. À 72 h environ 10% des inclusions sont remplis de bactéries tandis que les autres restent vides. </li><li> Extrait EBs par lyse hypotonique: Aspirer entièrement le support. Ajouter 1,0 ml H 2 O et le rock pour déloger les cellules pendant 10 min. Lyse des cellules par pipetage de haut en bas pendant au moins 10 fois. Recueillir lysat dans une micro et ajouter 0,250 ml de tampon 5x en saccharose glutamate de phosphate (SPG) pour l&#39;amener à une concentration finale 1x. Conserver à -80 ° C. Note: Le niveau de mutagenèse peut être évaluée par l&#39;induction de la résistance à la rifampicine. Pour doser la fréquence de la résistance à la rifampicine, la plaque 1 x 10 8 et 7 x dilutions en série de 10 fois des bactéries en présence de 200 ng / ml de rifampicine. La fréquence de la résistance à la rifampicine est défini comme le nombre de plaques résistantes à la rifampicine divisé par le nombre total de bactéries plaqués. Voir la section ci-dessous pour les instructions de la plaque. </li></ol></li></ol> 2. Isolation clonale de Chlamydia trachomatis souches mutantes par purification sur plaque <ol><li> Définir des monocouches confluentes de cellules Vero en plaques de 6 puits: Seed ~ 0,4 x 10 6 cellules dans 3 ml DMEM/10% FBS par puits. Laisser les cellules forment une monocouche homogène sur les prochaines 24 h. </li><li> Décongeler solution stock de Chlamydia muté sur la glace. Effectuez 6 x dilutions en série de 10 fois dans un volume total de 200 ul par dilution dans DMEM/10% de FBS et les mettre sur la glace. Note: titre bactérienne en unités formant d&#39;inclusion (IFU) est une bonne estimation des unités formant plages (UFP). But de la plaque 10, 100 et 1000 pfu. </li><li> Laver les cellules Vero deux fois avec 3 ml de PBS par puits. </li><li> Ajouter 3 ml de DMEM à chaque puits pour les plaques 6 puits et 100 pi des dilutions bactériennes en double. Swirl la plaque pour assurer une mélange. </li><li> Spin plaques infectées à 2700 g pendant 30 min à 15 ° C puis incuber à 37 ° C dans une atmosphère humide,5% de CO 2 incubateur pendant 1-2 heures. </li><li> Préparez 0,54% d&#39;agarose dans du DMEM (pour 6 puits): <ol><li> Ajouter les ingrédients suivants: 18,9 ml froide 2x DMEM, 4,2 ml de FBS, 0,42 ml 100x NEAA, 0,042 ml 200 ug / ml cyclohexamide, 0,021 ml 50mg/ml gentamicine. Mélangez bien. </li><li> Mélanger dans 18,9 ml d&#39;agarose à 1,2% / H 2 O stérile chaud, en remuant pour éviter les grumeaux. Mélange doit être tiède au toucher. Conserver dans un bain d&#39;eau chaude à 55 ° C avant de l&#39;ajouter aux cellules infectées. </li></ol></li><li> Aspirer suspension bactérienne de plats et appliquer 6 ml 0,54% agarose / DMEM par puits. Laisser agarose se solidifie complètement à la température ambiante à l&#39;extérieur de la hotte pendant 15 min. Sécher les plaques avec les couvercles enlevés, dans la hotte de biosécurité pour 15 min. NB: Les vibrations de la hotte de confinement biologique peut fausser l&#39;agarose se solidifie. </li><li> Incuber à 37 ° C en CO 2 incubateur pendant 7-10 jours. Les plaques doivent être visibles à l&#39;aide d&#39;un microscope à dissection. (Refer à la figure 3 pour une image typique de plaques.) </li><li> Un jour avant l&#39;isolement des mutants, des semences 1 x 10 4 cellules Vero dans 100 ul par puits dans une plaque de 96 puits. Les cellules seront confluentes dans les 24 h. </li><li> En utilisant un microscope de dissection, marque plaques à être cueillies. Collecter des bouchons de plaques en utilisant une pointe ml barrière stérile 1,0 pipette. </li><li> Plaques remettre en suspension dans 100 ul de DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 400 ng / ml cyclohexamide, 50 pg / ml de gentamicine. </li><li> Pour développer des souches mutantes, superposer la suspension sur des monocouches confluentes de cellules Vero. Faites tourner les plaques à 2700 xg, 15 ° C pendant 30 min. </li><li> Incuber à 37 ° C / 5% de CO 2 dans un incubateur humidifié. Récolte EB lorsque&gt; 50% des cellules sont infectées, ce qui peut se produire dès 48 HPI et aussi tard que 14 jours. Cette quantité de cellules infectées permet aux bactéries viables suffisant pour être stockés. Les souches mutantes diffèrent des taux de croissance et l&#39;infectiosité. Laisser ralentir souches à croissance naturaLLY ré-infecter les cellules voisines jusqu&#39;à ce que suffisamment de cellules sont infectées. </li><li> Extrait EBs par lyse hypotonique des cellules infectées: <ol><li> Aspirer entièrement le support. </li><li> Ajouter 160 ul d&#39;eau stérile. Incuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Broyer les cellules par pipetage de haut en bas plusieurs fois pour assurer une lyse complète, utiliser des embouts de barrière pour éviter la contamination croisée. </li><li> Transférer 160 ul de lysats de microtubes. </li><li> Mélanger dans 40 pl de SPG 5x. Conserver à -80 ° C. </li></ol></li><li> mutants d&#39;analyse et d&#39;un écran de phénotype (s) d&#39;intérêt. </li></ol> 3. Séquençage du génome entier de mutants de Chlamydia sélectionnés <ol><li> Extraire l&#39;ADN génomique de gradient purifié EBS, qui sont en grande partie exempte de contamination de l&#39;ADN de l&#39;hôte. Les protocoles de culture à grande échelle de la chlamydia et la purification d&#39;EBS peuvent être trouvés dans ref. (17). Utilisez des kits de purification d&#39;ADN génomique commerciaux (par exemple cat Qiagen. 69504) à posteRACT ADN de 2 x 10 9 bactéries en suivant les instructions du fabricant. </li><li> Utilisez un fluorimètre (qubit, Invitrogen cat. Q32866) pour mesurer avec précision la quantité d&#39;ADN. 05.01 pg d&#39;ADN purifié est requis pour la plate-forme de séquençage Illumina. Note: Plusieurs plates-formes peuvent être utilisés pour les génomes bactériens de la séquence, y compris les systèmes Illumina/Solexa- et solide base. Nous avons choisi d&#39;utiliser HiSeq (Illumina) car elle produit une grande densité de court, mais le séquençage de haute qualité lit. Les petits séquenceurs de génome d&#39;envergure, tels que IonTorrent (Life Technologies) et myseq (Illumina) conviennent aussi, et plus que suffisant pour multiplexer ces Quencing jusqu&#39;à 4 génomes de Chlamydia à la fois, ce qui dépasse la couverture minimale de 25X pour l&#39;assemblage du génome adéquate. Préparation des bibliothèques de séquençage d&#39;ADN pour la plateforme Illumina sont décrits ci-dessous. </li><li> ADN Fragment de taille appropriée (300-400 paires de bases pour Illumina séquençage) en utilisant un Adaptive Acoustics ciblées S220 danstrument (Covaris) selon les réglages suggérés par le fabricant. Note: fragmentation de l&#39;ADN par les résultats de nébulisation à une plus grande perte de l&#39;échantillon en raison de nébulisation de l&#39;échantillon. </li><li> Préparer les bibliothèques de séquençage génomique en utilisant des kits de construction commerciale (Illumina FC-102-1001), en suivant les instructions du fabricant. Les bibliothèques peuvent être indexés en utilisant des amorces à code-barres (Illumina FC-121-1003) telles que de multiples échantillons peuvent être mis en commun et séquencés simultanément. </li><li> Exécutez le séquençage d&#39;échantillons. Cette étape est généralement effectuée par les services commerciaux ou d&#39;installations de base exploités par le personnel technique dédié. Suivez leurs procédures et recommandations. </li><li> Illumina lectures (format FASTQ) peuvent être assemblés pour un génome de référence en utilisant le logiciel d&#39;interface utilisateur graphique conviviale, comme Geneious (Biomatters), qui peut également être utilisé pour SNP / identification de la mutation. Pour carte mutations, définir les paramètres à 90% pour la fréquence variant minimum et 50X pour une couverture minimum. Ouvert source du génome monteurs, comme MAQ (18) et BWA (19), peuvent également être utilisés. </li><li> Confirmez mutations par séquençage Sanger: utiliser l&#39;ADN génomique comme matrice pour l&#39;amplification par PCR des régions 300-500 pb flanquant mutations identifiées et la séquence purifiés ou dilué (1:20) Les produits de PCR par séquençage Sanger. </li></ol> 4. Production de recombinants de Chlamydia Note: La chlamydia peut échanger l&#39;ADN au cours de l&#39;infection, ce qui permet la génération de souches recombinantes (12, 13, 20). Après avoir co-infection de cellules par deux souches résistantes aux antibiotiques uniques, &quot;descendance&quot; recombinant peut être sélectionnée pour la résistance aux antibiotiques double (12, 13). Nous avons profité de ce phénomène pour séparer les mutations et pour générer des souches co-isogéniques. Par conséquent, les souches mutantes ont été générés en arrière-plan résistantes aux antibiotiques (par exemple rifampicine résistance (rif R) H471Y dans CTL0567 (rpoB)) de telle sorte qu&#39;ils peuvent être croisées pour souche de type sauvage bearinga allèle de résistance aux antibiotiques différents (par exemple la résistance à la spectinomycine (CPS R), G1197A dans r01/r02 (16SRNA copie 1 et 2)). Pour plus de détails concernant les échanges d&#39;ADN et la recombinaison à Chlamydia, reportez-vous aux références (12, 13). <ol><li> Co-infecter type sauvage et des souches mutantes clonales par centrifuging6 x 10 5 bactéries de chaque souche sur des monocouches confluentes de cellules Vero cultivées sur une plaque de 24 puits. En parallèle, infecter des monocouches avec chaque souche seul. </li><li> À 44 HPI, la récolte EBs par lyse hypotonique des cellules infectées: <ol><li> Aspirer entièrement le support. </li><li> Ajouter 0,4 ml d&#39;eau stérile et laisser reposer pendant 10 min. </li><li> Lyse des cellules par vigoureuse pipetage de haut en bas pendant au moins 10 fois. Transfert lysats dans un tube à centrifuger. </li><li> Mélanger dans 0,1 ml de SPG 5x pour une concentration finale de 1x SPG. </li><li> Lysats peuvent être utilisées immédiatement ou conservés à -80 ° C. </li></ol></li><li> Plaque 50 pi de l&#39;EB brut preps uned 5 x 1h10 dilutions en série dans agarose / DMEM supplémenté avec des antibiotiques appropriés pour sélectionner des recombinants. (Voir le tableau des concentrations d&#39;antibiotiques classiques pour la sélection des recombinants.) </li><li> Plaque purifier et d&#39;enrichir souches recombinantes comme ci-dessus. recombinants de marque pour la présence ou l&#39;absence du phénotype souhaité. Extraire l&#39;ADN des souches recombinantes par traitement DNAzol (section suivante) dans le but de génotypage pour la présence ou l&#39;absence de mutations. </li><li> Crosses peuvent être répétées avec des souches portant d&#39;autres marqueurs de résistance aux antibiotiques de séparer davantage les mutations et générer des souches isogéniques. Co-infecter recombinants sélectionnés pour une autre souche de type sauvage porteur d&#39;un marqueur antibiotique différent. </li></ol> Tableau 1: concentrations d&#39;antibiotiques pour la sélection des recombinants: <table border="1"><tbody><tr><th> Concentration finale </th><th> Conseils de préparation </th></tr><tr><td> 200 ng / ml de rifampicine </td&gt; <td> Faire 25 mg / stock de stockage ml dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Maquillage 200 pg / ml solution de travail en diluant le stock de stockage avec H 2 O. Conserver à -20 ° C dans l&#39;obscurité. </td></tr><tr><td> 200 pg / ml de triméthoprime </td><td> Faire un mg / ml de bouillon 100 dans le DMSO. Conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> 200 pg / ml de spectinomycine </td><td> Faire un mg / ml de bouillon 100 dans l&#39;eau dans 100 aliquotes. Conserver à -20 ° C. Évitez gel-dégel répété. </td></tr></tbody></table> 5. Extraction d&#39;ADN génomique de souches recombinantes pour le génotypage Remarque: des kits de purification basée sur les colonnes peuvent aussi être utilisés. Un avantage de l&#39;extraction de l&#39;ADN par traitement DNAzol est le coût. <ol><li> Infect 1,2 x 10 5 chlamydiae sur des monocouches de cellules Vero cultivées sur des plaques à 12 puits. </li><li> À 36-48 HPI, aspirer moyen et ajouter 0,375 ml de DNAzol (Invitrogen 10503-027). Agitez doucement les cellules et les pipettes l&#39;lysates dans un tube à centrifuger de 1,5 ml. </li><li> précipiter l&#39;ADN par addition de 0,188 ml d&#39;éthanol à 100%. Mélanger par inversion. </li><li> Extraire l&#39;ADN par bobinage avec une pipette et le placer dans un tube propre. Alternativement, un culot d&#39;ADN par centrifugation à vitesse maximale pendant 2 min à température ambiante ou à 4 ° C, et le surnageant décanter. </li><li> Lavez ADN précipiter deux fois avec 1,0 ml d&#39;éthanol à 75%. </li><li> ADN air sec après élimination de l&#39;éthanol pendant 15 sec. </li><li> Solubiliser ADN avec 0,2 ml 8 mM NaOH puis neutraliser à pH 8,0 avec 20,2 ul de 0,1 M HEPES. Apportez jusqu&#39;à un volume final de 0,5 ml d&#39;eau ou de TE. Alternativement, l&#39;ADN remettre en suspension dans un tampon TE (culot d&#39;ADN ne sera pas complètement solubilisé.). </li><li> Utilisez ADN DNAzol-extrait de matrice pour l&#39;amplification par PCR des régions 300-500 pb flanquant mutations identifiées. Séquence purifié ou dilué (1:20) Les produits de PCR par séquençage Sanger. </li></ol>

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	<li>Haggerty, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+of+sequelae+after+Chlamydia+trachomatis+genital+infection+in+women.">Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women.</a> J Infect Dis. 201, S134-S155 (2010).</li><li>Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+insights+into+the+mechanisms+of+Chlamydia+entry.">Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry.</a> Cell Microbiol. 7 (12), 1714-1722 (2005).</li><li>Hybiske, K., Stephens, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Chlamydia+trachomatis+entry+into+nonphagocytic+cells.">Mechanisms of Chlamydia trachomatis entry into nonphagocytic cells.</a> Infect Immun. 75 (8), 3925-3934 (2007).</li><li>Heuer, D., Kneip, C., Maurer, A. P., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+the+intractable+-+approaching+the+genetics+of+Chlamydiales.">Tackling the intractable - approaching the genetics of Chlamydiales.</a> Int J Med Microbiol. 297 (7-8), 569-576 (2007).</li><li>Stephens, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+an+obligate+intracellular+pathogen+of+humans,+Chlamydia+trachomatis.">Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans, Chlamydia trachomatis.</a> Science. 282 (5389), 754-759 (1998).</li><li>Thomson, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia+trachomatis,+genome+sequence+analysis+of+lymphogranuloma+venereum+isolates.">Chlamydia trachomatis, genome sequence analysis of lymphogranuloma venereum isolates.</a> Genome Res. 18 (1), 161-171 (2008).</li><li>Harris, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+analysis+of+diverse+Chlamydia+trachomatis+strains+identifies+phylogenetic+relationships+masked+by+current+clinical+typing.">Whole-genome analysis of diverse Chlamydia trachomatis strains identifies phylogenetic relationships masked by current clinical typing.</a> Nat Genet. 44 (4), 413-419 (2012).</li><li>Somboonna, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypervirulent+Chlamydia+trachomatis+clinical+strain+is+a+recombinant+between+lymphogranuloma+venereum+(L(2))+and+D+lineages.">Hypervirulent Chlamydia trachomatis clinical strain is a recombinant between lymphogranuloma venereum (L(2)) and D lineages.</a> MBio. 2 (3), e00045-00011 (2011).</li><li>Voigt, A., Schofl, G., Saluz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chlamydia+psittaci+genome,+a+comparative+analysis+of+intracellular+pathogens.">The Chlamydia psittaci genome, a comparative analysis of intracellular pathogens.</a> PLoS One. 7 (4), e35097 (2012).</li><li>Jeffrey, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+of+recent+clinical+Chlamydia+trachomatis+strains+identifies+loci+associated+with+tissue+tropism+and+regions+of+apparent+recombination.">Genome sequencing of recent clinical Chlamydia trachomatis strains identifies loci associated with tissue tropism and regions of apparent recombination.</a> Infect Immun. 78 (6), 2544-2553 (2010).</li><li>Gomes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Chlamydia+trachomatis+diversity+occurs+by+widespread+interstrain+recombination+involving+hotspots.">Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots.</a> Genome Res. 17 (1), 50-60 (2007).</li><li>DeMars, R., Weinfurter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstrain+gene+transfer+in+Chlamydia+trachomatis+in+vitro,+mechanism+and+significance.">Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro, mechanism and significance.</a> J Bacteriol. 190 (5), 1605-1614 (2008).</li><li>Demars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., Potucek, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+gene+transfer+in+vitro+in+the+intracellular+pathogen+Chlamydia+trachomatis.">Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis.</a> J Bacteriol. 189 (3), 991-1003 (2007).</li><li>Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+determinants+in+the+obligate+intracellular+pathogen+Chlamydia+trachomatis+revealed+by+forward+genetic+approaches.">Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1263-1268 (2012).</li><li>Tipples, G., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+initial+characterization+of+a+series+of+Chlamydia+trachomatis+isolates+selected+for+hydroxyurea+resistance+by+a+stepwise+procedure.">Isolation and initial characterization of a series of Chlamydia trachomatis isolates selected for hydroxyurea resistance by a stepwise procedure.</a> J Bacteriol. 173 (16), 4932-4940 (1991).</li><li>Wang, L. L., Henson, E., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+trimethoprim-+and+sulphisoxazole-resistant+Chlamydia+trachomatis.">Characterization of trimethoprim- and sulphisoxazole-resistant Chlamydia trachomatis.</a> Mol Microbiol. 14 (2), 271-281 (1994).</li><li>Scidmore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+Laboratory+Maintenance+of+Chlamydia+trachomatis.">Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 11, Unit 11A 11 (2005).</li><li>Li, H., Ruan, J., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+short+DNA+sequencing+reads+and+calling+variants+using+mapping+quality+scores.">Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores.</a> Genome Res. 18 (11), 1851-1858 (2008).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).</li><li>Suchland, R. J., Sandoz, K. M., Jeffrey, B. M., Stamm, W. E., Rockey, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+transfer+of+tetracycline+resistance+among+Chlamydia+spp.+in+vitro.">Horizontal transfer of tetracycline resistance among Chlamydia spp. in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 53 (11), 4604-4611 (2009).</li><li>Sladek, F. M., Melian, A., Howard-Flanders, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incision+by+UvrABC+excinuclease+is+a+step+in+the+path+to+mutagenesis+by+psoralen+crosslinks+in+Escherichia+coli.">Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+transformation+system+for+Chlamydia+trachomatis,+restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector.">Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector.</a> PLoS Pathog. 7 (9), e1002258 (2011).</li></ol>

Il n&#39;y a rien à révéler.

Cette méthodologie répond aux exigences de base pour l&#39;analyse génétique, car elle établit lien entre les génotypes et les phénotypes. Surtout, ce résultat est obtenu sans l&#39;aide d&#39;outils moléculaires classiques pour la transformation de l&#39;ADN recombinant et inactivation par insertion de gènes dans des bactéries, ce qui est souvent une étape limitante dans l&#39;analyse de la fonction des gènes dans les microbes non-modèles. Une étape essentielle est d&#39;assu...

Les intracellulaire obligatoire bactérie Chlamydia comptes trachomatis pour environ 2,8 millions d&#39;infections génitales des voies par an aux Etats-Unis (Center for Disease Control) avec associé séquelles telles que la maladie inflammatoire pelvienne, des grossesses ectopiques et l&#39;infertilité (1). Chlamydia spp ont une occasion unique physiologie d&#39;un cycle de développement biphasique consistant en deux formes: le corps élémentaire infectieux mais non répliquant (EB) et le corps réticulé non infectieux mais réplicatif (RB). L&#39;infection commence par la fixation d&#39;EBS aux cellules épithéliales suivies endoctyotosis (2). Au sein d&#39;une vacuole membranaire appelé une inclusion, EBS se différencier en forme RB, qui reproduit ensuite par scissiparité. Au milieu de cycle, les transitions RBS retour dans EBS, qui sont ensuite expulsés dans l&#39;espace extracellulaire pour initier de nouveaux cycles d&#39;infection lors de la lyse de la cellule hôte (3). C. trachomatis estréfractaires à une manipulation de routine avec des outils de génétique moléculaire standard, telles que le remplacement ciblé de gènes, transposons, et les phages transducteurs, qui ont été au centre de la plupart des études en génétique bactérienne, on ne sait dans quelle mesure les gènes de Chlamydia individuels contribuent à l&#39;évasion de l&#39;immunité innée , l&#39;acquisition des éléments nutritifs, transitions développementales, ou d&#39;autres processus importants pour la survie de l&#39;agent pathogène dans un hôte eucaryote (4). Par conséquent, cet agent pathogène reste mal caractérisée, malgré son importance clinique. Les génomes de Chlamydia spp. sont relativement faibles (~ 1 Mb) (5) avec de multiples espèces et biovars séquencés en utilisant des technologies de séquençage de prochaine génération. Analyse comparative du génome par WGS a fourni un aperçu unique dans l&#39;évolution des espèces Chlamydia et leur adaptation à l&#39;homme (6-8) et dans une certaine mesure, a fourni quelques informations sur la fonction potentielle de facteurs de virulence (9, 10). TIl diversité génétique affichée par les isolats cliniques ne fournit pas la résolution requise pour cartographier systématiquement la fonction de la plupart des facteurs de virulence, sans doute parce que des mutations dans ces gènes auraient été facilement sélectionné contre. Sans effets confondants de la sélection naturelle, la variation du gène mutagène induit, couplée à des tests définis qui permettent de mesurer les défauts de virulence, peuvent étendre le spectre des mutations qui peuvent être interrogés. Mutagènes chimiques, en particulier, sont utiles car ils peuvent générer nulle conditionnelle hypomorphic (fonction réduite), et hypermorphic (gain de fonction) allèles. Avec l&#39;arrivée des technologies de séquençage des génomes robustes de la prochaine génération, telles mutations peuvent être facilement identifiés et cartographiés. De cette manière, les associations fortes peuvent être faites entre des mutations dans un gène ou voie génétique et le phénotype commun, permettant l&#39;application d&#39;approches avant génétiques. Les séquences du génome des souches cliniques ont révélé mosaïque bntre les sérotypes et les lieux de recombinaison fréquente (11). Les données empiriques de recombinaison a été démontré par la co-infection de deux souches résistantes aux antibiotiques différents et le choix de la double descendance recombinante résistant, qui a été révélé à avoir des contributions génétiques de deux souches (12, 13). Ainsi, l&#39;échange génétique entre les souches de type sauvage et mutants dans un milieu de co-infection permet la séparation des mutations induites chimiquement de localiser le gène concerné qui conduit au phénotype observé. Nous décrivons ici une méthode pour effectuer l&#39;analyse génétique dans Chlamydia basé sur la mutagenèse chimique, WGS, et un système d&#39;échange de l&#39;ADN dans les cellules infectées (14) (figure 1).

<table border="0" cellspacing="0" cols="4">
	<colgroup width="291">
	</colgroup>
	<colgroup width="123">
	</colgroup>
	<colgroup width="144">
	</colgroup>
	<colgroup width="84">
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl methanesulfonate (EMS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4859-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (sterile, tissue culture grade)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2% GTG Agarose , autoclaved</td>
			<td>Lonzo</td>
			<td>50070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA purification kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10503-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (molecular biology grade)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mM NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical safety hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Dissection microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer (Qubit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adaptive Focused Acoustics S220 instrument</td>
			<td>Covaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

forward genetic approaches in chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, l&#39;agent étiologique des maladies sexuellement transmissibles et les infections oculaires, reste mal caractérisée par son indocilité à la transformation expérimentale avec de l&#39;ADN recombinant. Nous avons développé une approche pour effectuer l&#39;analyse génétique de C. trachomatis malgré l&#39;absence d&#39;outils de génétique moléculaire. Notre méthode consiste à: i) la mutagenèse chimique pour générer rapidement des bibliothèques complètes de mutants génétiquement définis avec des phénotypes distincts; ii) séquençage du génome entier (WGS) pour cartographier les lésions génétiques sous-jacents et de trouver des associations entre gène muté (s) et.. un phénotype commun;. iii) la production de souches recombinantes à travers la co-infection de cellules de mammifères par des bactéries de type mutant et sauvage. En conséquence, nous avons pu établir des relations causales entre les génotypes et les phénotypes. Le couplage de variation génique induite chimiquement et WGS de créer des associations génotype-phénotype corrélatives should être largement applicable à la grande liste des micro-organismes médicalement et écologiquement importantes actuellement insolubles à l&#39;analyse génétique.

L&#39;exposition aux substances mutagènes conduit à inclusions qui semblent dépourvues de bactéries, probablement en raison de la mort de la cellule bactérienne. Typiquement, le sérotype LGV-L2 sera complètement lyse des cellules infectées dans les 48 heures après l&#39;infection, mais le traitement avec mutagènes peut prolonger ce cycle&gt; 90 h. Environ 10% des inclusions devraient se redresser. Dans nos expériences, les cellules Vero infectées traitées avec 20 mg / ml EMS a entraîné une diminution de 9...

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Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Nous décrivons une méthode pour effectuer l&#39;analyse génétique dans Chlamydia basé sur la mutagenèse chimique et le séquençage complet du génome. En outre, un système d&#39;échange de l&#39;ADN dans les cellules infectées est décrite qui peut être utilisé pour la cartographie génétique. Cette méthode peut être largement applicable à des systèmes microbiens manquant des systèmes de transformation et des outils de génétique moléculaire.

Approches avant génétiques dans<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

forward-genetic-approaches-in-chlamydia-trachomatis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

12.8K vues.  Duke University Medical Center.  Nous décrivons une méthode pour effectuer l'analyse génétique dans Chlamydia basé sur la mutagenèse chimique et le séquençage complet du génome. En outre, un système d'échange de l'ADN dans les cellules infectées est décrite qui peut être utilisé pour la cartographie génétique. Cette méthode peut être largement applicable à des systèmes microbiens manquant des systèmes de transformation et des outils de génétique moléculaire....

Vidéo: Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Un crible génétique pour isoler Toxoplasma gondii Mutants Egress de la cellule hôte

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Recherche

Immunologie et infection

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

Manipulation génétique<em&gt; Δku80</em&gt; Les souches pour l&#39;analyse génomique fonctionnelle de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important for developing durable disease-resistant plants against wide range of pathogens. Virus-induced gene silencing (VIGS)-based forward genetics screening is a useful approach for identification of plant defense genes imparting nonhost resistance. Tobacco rattle virus (TRV)-based VIGS vector is the most efficient VIGS vector to date and has been efficiently used to silence endogenous target genes in Nicotiana benthamiana.

	In this manuscript, we demonstrate a forward genetics screening approach for silencing of individual clones from a cDNA library in N. benthamiana and assessing the response of gene silenced plants for compromised nonhost resistance against nonhost pathogens, Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea, and X. campestris pv. vesicatoria. These bacterial pathogens are engineered to express GFPuv protein and their green fluorescing colonies can be seen by naked eye under UV light in the nonhost pathogen inoculated plants if the silenced target gene is involved in imparting nonhost resistance. This facilitates reliable and faster identification of gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. Further, promising candidate gene information can be known by sequencing the plant gene insert in TRV vector. Here we demonstrate the high throughput capability of VIGS-mediated forward genetics to identify genes involved in nonhost resistance. Approximately, 100 cDNAs can be individually silenced in about two to three weeks and their relevance in nonhost resistance against several nonhost bacterial pathogens can be studied in a week thereafter. In this manuscript, we enumerate the detailed steps involved in this screening. VIGS-mediated forward genetics screening approach can be extended not only to identifying genes involved in nonhost resistance but also to studying genes imparting several biotic and abiotic stress tolerances in various plant species.

Virus-induced gene silencing is an useful tool for identifying genes involved in nonhost resistance of plants. We demonstrate the use of bacterial pathogens expressing GFPuv in identifying gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. This approach is easy, fast and facilitates large scale screening and similar protocol can be applied to studying various other plant-microbe interactions.

VIGS-Mediated dépistage génétique avant pour l&#39;identification des gènes impliqués dans la résistance non hôte


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

Découverte de nouveaux agents pathogènes intracellulaires par amibienne Coculture et approches amibienne enrichissement

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Utilisation de protéines fluorescentes de visualiser et de quantifier<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuole la dynamique de croissance dans les cellules vivantes

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&amp;#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Forward Génétique écrans à l&#39;aide pour identifier les macrophages<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; gènes importants pour la résistance à l&#39;IFN-γ-cellulaire dépendant immunité autonome

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phenomics de phages: approches physiologiques à caractériser de nouvelles protéines virales

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

Une cellule de Blood Red Simple Lysis Méthode pour la création de B lymphoblastoïdes lignées cellulaires

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed feeder cells, purified NK or T cells with as much as 10 mL of blood, or a high-dose of IL-2. This study presents a new method with a powerful and simple strategy to establish NK and T cell lines by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the addition of recombinant human IL-2 (rhIL-2), and uses as little as 2 mL of whole blood. The cells can proliferate quickly in two weeks and be maintained for more than 3 months. With this method, 7 NK or T cell lines have been established with a high success rate. This method is simple, reliable, and applicable to establishing cell lines from more cases of CAEBV or NK/T cell lymphoma.

A simple method for obtaining NK and T cell clones from CAEBV patients was developed with high efficiency, a small amount of peripheral blood, and a low-dose of IL-2.

Une méthode Simple et efficace pour établir les NK et les lymphocytes T lignes provenant de Patients avec une Infection chronique Active Virus Epstein - Barr

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in elucidating the mechanisms that C. trachomatis use to create and maintain a privileged intracellular niche has been limited due to a lack of genetic tools. Fortunately, there have recently been several new advances in genetic manipulation techniques. Among these is the development of fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis (FRAEM). This method allows targeted gene deletion coupled with insertion of a selection cassette encoding antibiotic resistance and green fluorescent protein (GFP). Reliance on this strategy can be complicated when targeting genes within polycistronic operons due to the potential of polar effects on downstream genes. Floxed cassette allelic exchange mutagenesis (FLAEM), the protocol for which is described here, was developed to alleviate cassette-induced polar effects. FLAEM utilizes Cre-loxP genome editing to remove the selection cassette after targeted deletion by allelic exchange. The resulting strains contain markerless gene deletions of one or more coding sequences. This technique facilitates direct assessment of gene function and expands the repertoire of tools for genetic manipulation in C. trachomatis.

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Described here is a method for targeted, markerless gene deletion in Chlamydia trachomatis using floxed cassette allelic exchange mutagenesis, FLAEM.