Ce travail a été soutenu par le NIH NIDCD Y1-DC-8002-01. Ce travail a été effectué sous les auspices du ministère de l&#39;Énergie des États-Unis par Lawrence Livermore National Laboratory sous contrat DE-AC52-07NA27344.

Une. Assemblée de la sonde de raidisseur Cette section du protocole décrit la fabrication d&#39;un raidisseur de silicium, et le montage d&#39;une sonde de polymère en couche mince sur le raidisseur. Figure 1 illustre une sonde typique des neurones de polymère en même temps que le raidisseur proposé. Les détails de la conception du raidisseur sont présentés dans la figure 2. L&#39;originalité de cette conception est le faible &quot;mèche&quot; canal le long de sa longueur qui est utilisé pour distribuer la colle liquide lors de l&#39;assemblage. La partie la plus large du raidisseur est une patte de manipulation lors de l&#39;assemblage et de l&#39;insertion chirurgicale. Un réservoir de l&#39;onglet se connecte au canal. Le composant est fabriqué à partir de silicium en utilisant des procédés standards de microfabrication. <ol><li> Le raidisseur de silicium avec un canal à effet de mèche a été fabriqué à partir d&#39;un (SOI) plaquette de silicium-sur-isolant avec une épaisseur de couche de dispositif correspondant à l&#39;épaisseur souhaitée du raidisseur ( <strong&gt; Figure 3A). Une fourchette raisonnable de l&#39;épaisseur du raidisseur est 20-100 um. Il est recommandé que la largeur de l&#39;armature soit de 20 à 30 um inférieure à la largeur de la sonde, ce qui aide à empêcher le débordement de la colle à partir de l&#39;interface de liaison à la pointe de la sonde. D&#39;abord, les canaux sont de mèche sec gravé en utilisant le procédé Bosch standard (figure 3B). Ensuite, la géométrie du raidisseur est définie par une gravure qui s&#39;arrête plus longtemps sur la couche d&#39;oxyde enterrée (Figure 3C). Enfin, les raidisseurs sont libérés par la couche gravure humide d&#39;oxyde enterrée dans 49% d&#39;acide fluorhydrique (figure 3D). Après rinçage à fond les raidisseurs, faites-les tremper dans de l&#39;eau déminéralisée pendant 15 min. </li><li> Placer une pastille de polyéthylène glycol (PEG) de masse moléculaire 10 000 g / mol dans le réservoir (figure 4). Chauffer le raidisseur à 65 ° C de sorte que le PEG fondu et évacue dans le canal par une action capillaire. Puis refroidir à température ambiante pour se solidifier. </li&gt; <li> La figure 5 représente une vue schématique du flip chip colle mis en place. Placez le raidisseur à l&#39;envers sur la scène de base de la colle de flip chip, puis ramasser le raidisseur avec la tête d&#39;outil. Placer la sonde à l&#39;envers sur l&#39;étage de base. Utilisation de la colle de flip chip, aligner le raidisseur et la sonde puis abaissez le raidisseur et le placer sur la sonde. </li><li> L&#39;étape de base du dispositif de liaison flip chip doit avoir un élément chauffant pour appliquer de la chaleur au substrat. Après mise en place du raidisseur, chauffer l&#39;ensemble une fois de plus à 65 ° C. Laisser une minute pour que le PEG de refonte et de commencer à remplir dans l&#39;interface entre la sonde et raidisseur. Refroidir à se solidifier. </li><li> Retourner l&#39;ensemble et inspecter par le haut. Réchauffer comme nécessaire pour permettre la PEG à remplir complètement l&#39;interface entre la sonde et le raidisseur. Ceci peut être évalué visuellement depuis la sonde est transparente. Lorsque l&#39;ensemble est assis sur le chauffe-dessus (sonde) vers le haut, placer manuellement 1-3 epastilles xtra de PEG solide sur la languette afin qu&#39;ils se fondent sur ​​la sonde, en fournissant un renforcement supplémentaire dans cette région (figure 6). Enfin, permettre à l&#39;ensemble de refroidir de façon que le PEG se solidifie. À ce stade, l&#39;ensemble est prêt pour l&#39;insertion chirurgicale. </li></ol> 2. Insertion et Extraction <ol><li> Monter l&#39;ensemble sonde-raidisseur à un micromanipulateur, comme illustré sur la figure 7A en faisant adhérer l&#39;arrière du raidisseur sur le bras de micromanipulateur à la zone d&#39;onglet. Cela peut être fait avec du ruban adhésif double-face ou de ciment, mais prenez soin de ne pas communiquer avec la sonde avec de l&#39;adhésif. Fixer temporairement l&#39;extrémité du connecteur de la sonde à l&#39;micromanipulateur avec un petit morceau de mastic adhésif de telle sorte qu&#39;il peut être facilement enlevé avec une faible force. </li><li> Placez l&#39;ensemble sonde sur la cible et insérer la sonde à la vitesse d&#39;insertion souhaité. vitesse d&#39;insertion de de 0,13 à 0,5 mm / s ont été utilisés lors de l&#39;élaboration de ce protocole. &lt;/ Li&gt; <li> Enlever immédiatement l&#39;extrémité du connecteur de la sonde de la micromanipulateur doucement et posez-le sur une surface à proximité, comme un second bras de manutention (figure 7B). Ceci doit être fait avant le PEG commence à se dissoudre pour éviter le déplacement de la sonde. </li><li> Prévoyez du temps pour PEG à dissoudre. Ce laps de temps dépend de la masse moléculaire du PEG et de la zone de contact entre la sonde et le raidisseur. Par exemple, avec du PEG de poids moléculaire de 10 000 g / mol, une sonde de micro-électrodes de 6 mm environ et un raidisseur d&#39;appariement qui est 306 um de large, 15 min a été trouvée être une quantité suffisante de temps. Section 3 du protocole présente une méthode pour tester le temps de dissolution requise. Pendant ce temps, appliquer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en utilisant un compte-gouttes autour du point d&#39;insertion et languette pour dissoudre tout le PEG qui est au-dessus de la cible (figure 7C). </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un micropositionneur motorisé, commencer l&#39;extraction de l&#39;armature par application d&#39;un déplacement d&#39;100 um à une vitesse de 5 mm / sec. Cette motion initiale rapide aide à surmonter toute friction statique et minimiser sonde déplacement. Ensuite, compléter l&#39;extraction de raidissement à une vitesse inférieure d&#39;environ 0,1 mm / seconde (figure 7D). </li><li> Dans le cas d&#39;une chirurgie réelle, continuer avec les procédures normales s&#39;appliquent en gel de silicone, et / ou acrylique dentaire sur le site d&#39;insertion pour sécuriser et protéger la sonde, comme démontré dans 21. </li></ol> 3. Agarose Gel Tester Cette section du protocole décrit une procédure mise en place et d&#39;examiner l&#39;extraction du raidisseur dans un gel d&#39;agarose à 0,6% qui se rapproche des propriétés mécaniques en vrac, le pH et la salinité de tissu cérébral 17,22. Étant donné que le gel est à peu près transparent à travers de courtes distances, la séparation de raidisseur et de la sonde de déplacement peuvent être observées. <ol><li> Préparer une solution de 0,6% d&#39;agarose dans du tampon phosphate salin (PBS). Mélanger dans un élémenttempérature vée pour dissoudre complètement la poudre d&#39;agarose. Versez la solution dans une boîte en acrylique peu profonde; gel doit être 3/4- 1 en profondeur. Laisser le gel reposer à température ambiante pendant une heure. </li><li> Assurez-vous que le gel durci est saturé avec du PBS de sorte qu&#39;il ne se dessèche pas, et chauffer le gel à 37 ° C. </li><li> Mettre en place le micromanipulateur, boîte de gel d&#39;agarose, et le système de caméra microscopique, comme indiqué à la figure 8. </li><li> Insérer un repère de référence du verre dans la zone de gel en le faisant glisser entre le gel et le côté de la boîte (Figure 8). Utilisez un cure-dent à la case les caractéristiques sur le repère de référence pour le champ de vision du microscope numérique. </li><li> Monter la sonde à l&#39;micromanipulateur comme décrit dans l&#39;étape 2.1. </li><li> Placez l&#39;ensemble sonde sur le gel d&#39;environ 1 mm derrière le repère de référence. </li><li> Insérer la sonde dans le gel, en utilisant la caméra pour le guider jusqu&#39;à une profondeur désirée dans le champ de vision. &lt;/ Li&gt; <li> Passer immédiatement l&#39;extrémité du connecteur de la sonde à reposer sur une surface à proximité. </li><li> Faire les ajustements nécessaires à l&#39;image de la caméra de se concentrer sur la sonde (les caractéristiques repères de référence peuvent être légèrement hors-sujet). Prendre un instantané de l&#39;emplacement de la sonde. </li><li> Laisser PEG à dissoudre (le délai peut varier, et en fait peut être un paramètre à tester). Appliquer PBS près de la languette pour dissoudre le PEG qui est au-dessus du gel. </li><li> Lancer la capture vidéo si on le désire, et pour commencer l&#39;extraction du raidisseur tel que décrit à l&#39;étape 2.5. Lorsque l&#39;extraction est terminée, prendre un instantané finale de l&#39;emplacement de la sonde. </li><li> Utiliser des outils de traitement d&#39;image pour comparer les images avant et après extraction de renfort. Utilisez les fonctions sur le repère de référence qui sont visibles dans le champ de vision pour vous inscrire (aligner) les images. Étalonner l&#39;échelle de l&#39;image en fonction de la taille de caractéristiques connues sur la sonde. Mesurer la distance de déplacement de sonde. </li></ol>

<ol>
	<li>Polikov, V., Tresco, P., Reichert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+brain+tissue+to+chronically+implanted+neural+electrodes.">Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 148, 1-18 (2005).</li><li>Lee, Y. T., Hitchcock, R. W., Bridge, M. J., Tresco, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+response+of+adult+rat+brain+tissue+to+implants+anchored+to+the+skull.">Chronic response of adult rat brain tissue to implants anchored to the skull.</a> Biomaterials. 25 (12), 2229-2237 (2004).</li><li>Subbaroyan, J., Martic, D. C., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+finite-element+model+of+the+mechanical+effects+of+implantable+microelectrodes+in+the+cerebral+cortex.">A finite-element model of the mechanical effects of implantable microelectrodes in the cerebral cortex.</a> Journal of Neural Engineering. 2, 103-113 (2005).</li><li>Lacour Sun, Y., S, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+biocompatibility+of+photosensitive+polyimide+for+implantable+medical+device+use.">Assessment of the biocompatibility of photosensitive polyimide for implantable medical device use.</a> Journal of Biomedical Materials Research A. 90 (3), 648-655 (2009).</li><li>Kipke, D. R., Pellinen, D. S., Vetter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+neural+implants+using+thin-film+polymers.">Advanced neural implants using thin-film polymers.</a> IEEE International Symposium on Circuits and Systems. 4, 173-176 (2002).</li><li>Mercanzini, A., Cheung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+cortical+recording+using+novel+flexible+polymer+neural+probes.">Demonstration of cortical recording using novel flexible polymer neural probes.</a> Sensors and Actuators A. 143, 90-96 (2008).</li><li>Stieglitz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+biomedical+microdevices+with+double-sided+electrode+arrangements+for+neural+applications.">Flexible biomedical microdevices with double-sided electrode arrangements for neural applications.</a> Sensor and Actuators A. 90, 203-211 (2001).</li><li>Tooker, A., Tolosa, V., Shah, K. G., Sheth, H., Felix, S., Delima, T., Pannu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+neural+interface+with+dual-sided+electrodes+for+neural+stimulation+and+recording.">Polymer neural interface with dual-sided electrodes for neural stimulation and recording.</a> Proceedings of the International Conference of the Engineering in Medicine and Biology Society. , 5999-6002 (2012).</li><li>Egert, D., Peterson, R. L., Najafi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parylene+microprobes+with+engineered+stiffness+and+shape+for+improved+insertion.">Parylene microprobes with engineered stiffness and shape for improved insertion.</a> , (2011).</li><li>Lee, K. -. K., He, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyimide-based+intracortical+neural+implant+with+improved+structural+stiffness.">Polyimide-based intracortical neural implant with improved structural stiffness.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 14, 32-37 (2004).</li><li>Takeuchi, S., Ziegler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parylene+flexible+neural+probes+integrated+with+microfluidic+channels.">Parylene flexible neural probes integrated with microfluidic channels.</a> Lab On A Chip. 5, 519-523 (2005).</li><li>Singh, A., Zhu, H., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+mechanical+stiffness+of+coated+benzocyclobutene+(bcb)+based+neural+implant.">Improving mechanical stiffness of coated benzocyclobutene (bcb) based neural implant.</a> , 4298-4301 (2004).</li><li>Lewitus, D., Smith, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+resorbing+polymers+for+use+as+carriers+for+cortical+neural+probes.">Ultrafast resorbing polymers for use as carriers for cortical neural probes.</a> Acta Biomaterialia. 7, 2483-2491 (2011).</li><li>Gilgunn, P. J., Khilwani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-compliant,+scalable+neural+probe+with+molded+biodissolvable+delivery+vehicle.">An ultra-compliant, scalable neural probe with molded biodissolvable delivery vehicle.</a> , 56-59 (2012).</li><li>Ware, T., Simon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+responsive,+softening+neural+interfaces.">Fabrication of responsive, softening neural interfaces.</a> Advanced Functional Materials. 22 (16), 3470-3479 (2012).</li><li>Harris, J. P., Capadona, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+adaptive+intracortical+implants+improve+the+proximity+of+neuronal+cell+bodies.">Mechanically adaptive intracortical implants improve the proximity of neuronal cell bodies.</a> Journal of Neural Engineering. 8, 1-13 (2011).</li><li>Kozai, T. D. Y., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+shuttle+with+carboxyl+terminated+self-assembled+monolayer+coatings+for+implanting+flexible+polymer+neural+probes+in+the+brain.">Insertion shuttle with carboxyl terminated self-assembled monolayer coatings for implanting flexible polymer neural probes in the brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 199-205 (2009).</li><li>Bjugstad, K. B., Lampe, D. S., Kern, D. S., Mahoney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+of+poly(ethylene+glycol)-based+hydrogels+in+the+brain:+An+analysis+of+the+glial+response+across+space+and+time.">Biocompatibility of poly(ethylene glycol)-based hydrogels in the brain: An analysis of the glial response across space and time.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 95 (1), 79-91 (2010).</li><li>Greenwalk, R. B., Choe, Y. H., McGuire, J., Conover, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+drug+delivery+by+pegylated+drug+conjugates.">Effective drug delivery by pegylated drug conjugates.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (2), 217-250 (2003).</li><li>Sommakia, S. S., Rickus, J. L., Otto, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+adsorbed+proteins+and+an+antifouling+agent+on+the+impedance+of+silicon-based+neural+microelectrodes.">Effects of adsorbed proteins and an antifouling agent on the impedance of silicon-based neural microelectrodes.</a> , 7139-7142 (2009).</li><li>Gage, G. J., Stoetzner, C. R., Richner, T., Brodnick, S. K., Williams, J. C., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+Implantation+of+Chronic+Neural+Electrodes+for+Recording+Single+Unit+Activity+and+Electrocorticographic+Signals.">Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals.</a> J. Vis. Exp. (60), e3565 (2012).</li><li>Chen, Z. -. J., Gillies, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+realistic+brain+tissue+phantom+for+intraparenchymal+infusion+studies.">A realistic brain tissue phantom for intraparenchymal infusion studies.</a> Journal of Neurosurgery. 101 (2), 314-322 (2004).</li><li>Felix, S., Shah, K. G., George, D., Tolosa, V., Tooker, A., Sheth, H., Delima, T., Pannu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+silicon+insertion+stiffeners+for+neural+probes+using+polyethylene+glycol+as+a+biodissolvable+adhesive.">Removable silicon insertion stiffeners for neural probes using polyethylene glycol as a biodissolvable adhesive.</a> , 871-874 (2012).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

La méthode décrite ici fournit un processus bien contrôlé pour fixer les sondes de polymère en couches minces à raidisseurs séparés avec un adhésif biodissolvable. On présente également la procédure chirurgicale recommandée pour mettre en œuvre ces raidisseurs amovibles et une technique pour valider la procédure in vitro pour une configuration de sonde raidisseur donné. Etant donné que le raidisseur peut être rendue arbitrairement rigide, le procédé peut faciliter l&#39;insertion de sondes r...

réseaux de microélectrodes sont un outil essentiel en neurosciences ainsi que des applications cliniques émergents tels que les prothèses. En particulier, des sondes de pénétration de micro-électrodes permettent une stimulation et l&#39;enregistrement de l&#39;activité neuronale par contact étroit avec les cellules dans le cerveau, la moelle épinière et les nerfs périphériques. Un défi majeur pour les sondes de neurones implantés est la stabilité et la longévité des fonctions de stimulation et d&#39;enregistrement. Modélisation et études expérimentales de l&#39;interaction entre les sondes de micro-électrodes et le tissu neural ont suggéré que l&#39;un des mécanismes de dégradation est micro-déchirure du tissu nerveux en raison d&#39;un léger mouvement relatif entre la sonde et le tissu 3.1. Une solution consiste à fabriquer des sondes flexibles qui correspondent de plus près les propriétés de rigidité en vrac de tissu neural afin de minimiser les micromouvements relative. En tant que tel, biocompatibles minces polymères tels que le polyimide et le parylène a été adopté en tant que substrats pour la microélectronique favorablestrode sondes 4-8. Un compromis de sondes souples est qu&#39;ils sont difficiles à insérer dans le tissu neural. Les chercheurs ont pris diverses approches pour faciliter l&#39;insertion de sondes souples tout en conservant les propriétés mécaniques souhaitables. Une classe de conceptions modifie la géométrie de la sonde de polymère pour augmenter la rigidité dans certaines sections ou des axes tout en maintenant le respect dans d&#39;autres régions. Ceci a été accompli en incorporant des nervures ou des couches d&#39;autres matériaux 9,10. Une autre approche intègre un canal 3-D dans la conception de la sonde de polymère qui est rempli d&#39;un matériau biodégradable 11. Cette sonde peut être rigidifiée temporairement, et après l&#39;insertion du matériau dans les dissout et s&#39;évacue par canal. Cependant, de tels procédés qui modifient en permanence la géométrie du dispositif final implanté peuvent compromettre certaines des caractéristiques souhaitables de la sonde flexible. Une méthode qui fait not modifier la géométrie de la sonde finale consiste à encapsuler le dispositif de polymère avec un matériau biodégradable pour rigidifier temporairement le dispositif 12-14. Toutefois, des matières biodégradables typiques ont des modules de Young des ordres de grandeur plus petite que celle du silicium et seraient par conséquent nécessiter plus grande épaisseur pour obtenir la même rigidité. Revêtement suffisamment la sonde peut entraîner une pointe plus arrondie ou brutale, faisant insertion plus difficile. En outre, puisque les revêtements solubles sont exposés, il existe un risque de les dissoudre immédiatement au contact, ou encore à proximité, avec le tissu. Une autre classe de méthodes utilise des matériaux de substrat roman de sondes qui permettent de réduire la rigidité après avoir été implanté dans le tissu. Ces matières comprennent des polymères à mémoire de forme 15 et un nanocomposite mécaniquement adaptatif 16. Ces matériaux sont capables de diminuer de façon significative dans le module élastique après l&#39;insertion, et peuvent donner lieu à des sondes qui CTMA plus étroitementh les propriétés mécaniques du tissu neural. Cependant, la gamme possible de rigidité est encore limitée, de sorte qu&#39;ils peuvent ne pas être en mesure de fournir très élevé, équivalent de la rigidité de fils de silicium ou de tungstène. Ainsi, dans le cas de sondes flexibles qui sont très longues (par exemple,&gt; 3 mm) ou qui ont une raideur très faible, un procédé de fixation temporaire d&#39;un raidisseur plus rigide peut encore être nécessaire. Encore un autre procédé prometteur rapporté consiste à revêtir une navette de raidissement avec une monocouche d&#39;auto-assemblage permanent (SAM) pour personnaliser l&#39;interaction de surface entre la navette et la sonde flexible 17. Une fois sec, la sonde adhère à la navette enduit électrostatique. Après l&#39;insertion, l&#39;eau migre sur la surface hydrophile, la séparation de la sonde à partir de la navette de sorte que la navette peut être extrait. extraction de navette à une réduction de déplacement de la sonde a été démontrée (85 um). Cependant, avec seulement des interactions électrostatiques de maintien de la sonde à til navette, il existe un risque de glissement sonde par rapport à la navette avant et pendant l&#39;insertion. Nous avons mis au point un procédé dans lequel la sonde flexible est fixé à un renfort avec un matériau adhésif temporaire biodissolvable qui tient solidement la sonde pendant l&#39;insertion. Les sondes utilisées étaient faites de polyimide, qui a un module d&#39;élasticité de l&#39;ordre de 4.2 GPa. Le raidisseur est fabriqué à partir de silicium, avec un module d&#39;élasticité de 200 GPa ~. Lorsqu&#39;il est fixé, la raideur du silicium domine, ce qui facilite l&#39;insertion. Une fois inséré dans le tissu, la matière adhésive se dissout et le raidisseur est extrait à restaurer la sonde à sa souplesse initiale. Nous avons choisi le polyéthylène glycol (PEG) comme le matériau adhésif biodissolvable. PEG a été utilisé dans des applications telles que les sondes implantées neuronaux, l&#39;ingénierie tissulaire, et l&#39;administration de médicaments 11,18,19. Certains éléments de preuve ont suggéré que le PEG peut atténuer la réponse neuro-inflammatoire dans le cerveautissus 18,20. Par rapport à d&#39;autres matériaux possibles, y compris le saccharose,-co lactique-glycolique de l&#39;acide poly (PLGA), et l&#39;alcool polyvinylique (PVA), le PEG a un temps de dissolution dans les liquides biologiques qui est d&#39;une dimension appropriée pour de nombreuses chirurgies d&#39;implants (de l&#39;ordre de dizaines de minutes, en fonction de la masse moléculaire). En outre, il est solide à température ambiante et liquide à des températures allant de 50 à 65 ° C. Cette propriété rend particulièrement adapté à notre processus d&#39;assemblage de précision. En outre, similaire à la SAM décrite dans 17, le PEG dissous est hydrophile, ce qui facilite l&#39;extraction du raidisseur. Cette approche avantageuse est activé par une nouvelle conception de raidisseur et processus d&#39;assemblage méthodique qui assurent la couverture de colle uniforme et un alignement précis et reproductible. En plus du procédé d&#39;assemblage, on présente le procédé de mise en oeuvre du raidisseur amovible au cours de la chirurgie, ainsi que d&#39;un procédé in vitro pour évaluer l&#39;extraction de la stiffener. Le protocole présenté ici suppose que l&#39;utilisateur possède une sonde de micro-électrodes de polymère flexible. La partie du protocole relatif de la fabrication de l&#39;armature et de l&#39;assemblage de cette sonde à un raidisseur suppose l&#39;accès à des outils communs trouvés dans une installation de microfabrication. Le protocole relatif à l&#39;insertion et l&#39;extraction serait probablement effectué dans un laboratoire orienté vers les neurosciences.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Polyethylene glycol, 10,000 g/mol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>309028</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Flexible Sub-micron Die Bonder</td>
			<td>Finetech</td>
			<td>Fineplacer lambda</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1760-61</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digital Microscope</td>
			<td>Hirox</td>
			<td>KH-7700</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dual Illumination Revolver Zoom Lens</td>
			<td>Hirox</td>
			<td>MXG-2500REZ</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Precision Motorized Actuator</td>
			<td>Newport</td>
			<td>LTA-HS</td>
			<td>w/ CONEX-CC controller</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

insertion of flexible neural probes using rigid stiffeners attached with biodissolvable adhesive

réseaux de microélectrodes pour les appareils d&#39;interface de neurones qui sont faits de polymère mince film biocompatible sont censés avoir prolongé la durée de vie fonctionnelle parce que le matériau flexible peut réduire la réponse des tissus négatifs causés par des micromouvements. Cependant, leur flexibilité les empêche d&#39;être inséré avec précision dans le tissu neural. Cet article montre une méthode pour fixer temporairement une sonde de micro-électrodes souples à l&#39;aide d&#39;un contrefort rigide biodissolvable polyéthylène glycol (PEG) pour faciliter précise, l&#39;insertion chirurgicale de la sonde. Une conception de raidisseur unique permet une distribution uniforme de l&#39;adhésif PEG sur la longueur de la sonde. Liaison flip-chip, un outil couramment utilisé en microélectronique emballage, permet un alignement précis et reproductible et fixation de la sonde sur le contrefort. La sonde et raidisseur sont implantés chirurgicalement ensemble, puis le PEG est autorisé à dissoudre afin que le raidisseur peut être extrait en laissant la sondeen place. Enfin, une méthode d&#39;essai in vitro est utilisé pour évaluer l&#39;extraction du raidisseur dans un modèle sur gel d&#39;agarose du tissu cérébral. Cette approche de l&#39;implantation s&#39;est avéré particulièrement avantageux pour les sondes plus flexibles (&gt; 3 mm). Il fournit également un procédé réalisable pour implanter des sondes double face flexibles. À ce jour, la technique a été utilisée pour obtenir diverses données in vivo d&#39;enregistrement à partir du cortex de rat.

Cette technique d&#39;insertion a été utilisé en conjonction avec LLNL sondes de polyimide à couche mince, qui sont passés à la norme ISO 10993 et ​​les normes de biocompatibilité sont destinés à une implantation chronique. Une sonde typique de polyimide film mince est illustré sur la figure 1 avec un raidisseur en silicium qui est d&#39;environ 10 mm de long dans la région étroite. Ce raidisseur possède un canal à effet de mèche s&#39;étendant le long de sa longueur, comme représen...

Watch this Scientific Journal Video about Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive at JoVE.com

Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

L&#39;insertion de sondes de micro-électrodes neurales flexibles est activée par la fixation des sondes de renforts rigides avec du polyéthylène glycol (PEG). Un processus d&#39;assemblage unique assure uniforme et l&#39;attachement reproductible. Après insertion dans un tissu, le PEG se dissout et le raidisseur est extrait. Une méthode d&#39;essai in vitro évalue la technique en gel d&#39;agarose.

Insertion de flexible Neural sondes utilisant renforts rigides attachés avec Biodissolvable adhésif

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

insertion-flexible-neural-probes-using-rigid-stiffeners-attached-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.6K vues.  Lawrence Livermore National Laboratory.  L'insertion de sondes de micro-électrodes neurales flexibles est activée par la fixation des sondes de renforts rigides avec du polyéthylène glycol (PEG). Un processus d'assemblage unique assure uniforme et l'attachement reproductible. Après insertion dans un tissu, le PEG se dissout et le raidisseur est extrait. Une méthode d'essai in vitro évalue la technique en gel d'agarose. 

Vidéo: Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) technique), make use of various surface modification techniques, that can, for example, prevent surface fouling, tune the hydrophobicity / hydrophilicity of the surface, adapt to a variety of electronic environments, and most frequently, induce specificity towards a target of interest.1-5 These techniques extend the functionality of otherwise highly sensitive biosensors to real-world applications in complex environments, such as blood, urine, and wastewater analysis.2,6-7 While commercial biosensing platforms, such as Biacore, have well-understood, standard techniques for performing such surface modifications, these techniques have not been translated in a standardized fashion to other label-free biosensing platforms, such as Whispering Gallery Mode (WGM) optical resonators.8-9
WGM optical resonators represent a promising technology for performing label-free detection of a wide variety of species at ultra-low concentrations.6,10-12 The high sensitivity of these platforms is a result of their unique geometric optics: WGM optical resonators confine circulating light at specific, integral resonance frequencies.13 Like the SPR platforms, the optical field is not totally confined to the sensor device, but evanesces; this "evanescent tail" can then interact with species in the surrounding environment. This interaction causes the effective refractive index of the optical field to change, resulting in a slight, but detectable, shift in the resonance frequency of the device. Because the optical field circulates, it can interact many times with the environment, resulting in an inherent amplification of the signal, and very high sensitivities to minor changes in the environment.2,14-15
To perform targeted detection in complex environments, these platforms must be paired with a probe molecule (usually one half of a binding pair, e.g. antibodies / antigens) through surface modification.2 Although WGM optical resonators can be fabricated in several geometries from a variety of material systems, the silica microsphere is the most common. These microspheres are generally fabricated on the end of an optical fiber, which provides a "stem" by which the microspheres can be handled during functionalization and detection experiments. Silica surface chemistries may be applied to attach probe molecules to their surfaces; however, traditional techniques generated for planar substrates are often not adequate for these three-dimensional structures, as any changes to the surface of the microspheres (dust, contamination, surface defects, and uneven coatings) can have severe, negative consequences on their detection capabilities. Here, we demonstrate a facile approach for the surface functionalization of silica microsphere WGM optical resonators using silane coupling agents to bridge the inorganic surface and the biological environment, by attaching biotin to the silica surface.8,16 Although we use silica microsphere WGM resonators as the sensor system in this report, the protocols are general and can be used to functionalize the surface of any silica device with biotin.

Biosensors interface with complex, biological environments and perform targeted detection by combining highly sensitive sensors with highly specific probes attached to the sensor via surface modification. Here, we demonstrate the surface functionalization of silica optical sensors with biotin using silane coupling agents to bridge the sensor and the biological environment.

Fixation des sondes biologiques à des biocapteurs optiques de silice à l&#39;aide d&#39;agents de couplage au silane

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Recherche

Bio-ingénierie

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration and cell-cell interactions. The two key parameters of cellular biomechanics are cellular deformability or stiffness and the ability of the cells to contract and generate force. Here we describe a quick and simple method to estimate cell stiffness by measuring the degree of membrane deformation in response to negative pressure applied by a glass micropipette to the cell surface, a technique that is called Micropipette Aspiration or Microaspiration.
Microaspiration is performed by pulling a glass capillary to create a micropipette with a very small tip (2-50 &mu;m diameter depending on the size of a cell or a tissue sample), which is then connected to a pneumatic pressure transducer and brought to a close vicinity of a cell under a microscope. When the tip of the pipette touches a cell, a step of negative pressure is applied to the pipette by the pneumatic pressure transducer generating well-defined pressure on the cell membrane. In response to pressure, the membrane is aspirated into the pipette and progressive membrane deformation or "membrane projection" into the pipette is measured as a function of time. The basic principle of this experimental approach is that the degree of membrane deformation in response to a defined mechanical force is a function of membrane stiffness. The stiffer the membrane is, the slower the rate of membrane deformation and the shorter the steady-state aspiration length.The technique can be performed on isolated cells, both in suspension and substrate-attached, large organelles, and liposomes.
Analysis is performed by comparing maximal membrane deformations achieved under a given pressure for different cell populations or experimental conditions. A "stiffness coefficient" is estimated by plotting the aspirated length of membrane deformation as a function of the applied pressure. Furthermore, the data can be further analyzed to estimate the Young's modulus of the cells (E), the most common parameter to characterize stiffness of materials. It is important to note that plasma membranes of eukaryotic cells can be viewed as a bi-component system where membrane lipid bilayer is underlied by the sub-membrane cytoskeleton and that it is the cytoskeleton that constitutes the mechanical scaffold of the membrane and dominates the deformability of the cellular envelope. This approach, therefore, allows probing the biomechanical properties of the sub-membrane cytoskeleton.

Here we describe a quick and simple method to measure cell stiffness. The general principle of this approach is to measure membrane deformation in response to well-defined negative pressure applied through a micropipette to the cell surface. This method provides a powerful tool to study biomechanical properties of substrate-attached cells.

Aspiration par micropipette des cellules au substrat joints pour estimer la rigidité cellulaire

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Création de dégradés et adhésifs solubles pour la migration des cellules d&#39;imagerie par microscopie à fluorescence

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an area of productive research with over 1,400 published animal studies in just the last 5 years. Numerous techniques have been developed for quantifying smooth muscle activity of the stomach, small intestine, and colon. In vitro and ex vivo techniques offer powerful tools for mechanistic studies of GI function, but outside the context of the integrated systems inherent to an intact organism. Typically, measuring in vivo smooth muscle contractions of the stomach has involved an anesthetized preparation coupled with the introduction of a surgically placed pressure sensor, a static pressure load such as a mildly inflated balloon or by distending the stomach with fluid under barostatically-controlled feedback. Yet many of these approaches present unique disadvantages regarding both the interpretation of results as well as applicability for in vivo use in conscious experimental animal models. The use of dual element strain gages that have been affixed to the serosal surface of the GI tract has offered numerous experimental advantages, which may continue to outweigh the disadvantages. Since these gages are not commercially available, this video presentation provides a detailed, step-by-step guide to the fabrication of the current design of these gages. The strain gage described in this protocol is a design for recording gastric motility in rats. This design has been modified for recording smooth muscle activity along the entire GI tract and requires only subtle variation in the overall fabrication. Representative data from the entire GI tract are included as well as discussion of analysis methods, data interpretation and presentation.

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

The in vivo measurement of smooth muscle contractions along the gastrointestinal tract of laboratory animals remains a powerful, though underutilized, technique. Flexible, dual element strain gages are not commercially available and require fabrication. This protocol describes the construction of reliable, inexpensive strain gages for acute or chronic implantation in rodents.

Fabrication et implantation de miniatures à double élément jauges de contrainte pour mesurer<em&gt; In Vivo</em&gt; Gastro contractions chez les rongeurs.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Utilisation de l&#39;adhésif Patterning de construire papier dispositifs microfluidiques 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing the complicated multi-bracket appliances to a simple two-bracket system for the purpose of force system evaluation will be the first step in this direction. However, much of the orthodontic biomechanics in this regard is confined to 2D experimental studies, computer modeling/analysis or theoretical extrapolation of existing models. The objective of this protocol is to design, construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the forces and moments generated by an archwire with a V-bend placed between two brackets. Additional objectives are to compare the force system generated by different types of archwires among themselves and to previous models. For this purpose, a 2 x 4 appliance representing a molar and an incisor has been simulated. An orthodontic wire tester (OWT) is constructed consisting of two multi-axis force transducers or load cells (nanosensors) to which the orthodontic brackets are attached. The load cells are capable of measuring the force system in all the three planes of space. Two types of archwires, stainless-steel and beta-titanium of three different sizes (0.016 x 0.022 inch, 0.017 x 0.025 inch and 0.019 x 0.025 inch), are tested. Each wire receives a single vertical V-bend systematically placed at a specific position with a predefined angle. Similar V-bends are replicated on different archwires at 11 different locations between the molar and incisor attachments. This is the first time an attempt has been made in vitro to simulate an orthodontic appliance utilizing V-bends on different archwires.

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

The method presented here is designed to construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the force system generated by different archwires with V-bends placed between two brackets. Additional objectives are to compare this force system with different types of archwires and to previous models.

Forcer le système V-coude Vertical : une évaluation 3D In Vitro des arcs rectangulaire élastiques et rigides

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing ...

Rat Model of Adhesive Capsulitis of the Shoulder

This proposal aims to create an in vivo rat model of adhesive capsulitis for researching potential treatment options for this condition and other etiologies of comparable arthrofibrosis. The model includes extra-articular fixation of the shoulder in rats via scapular to humeral suturing, resulting in a secondary contracture without invading the intra-articular space and resulting in decreased rotational ROM and increased joint stiffness.
We used 10 Sprague-Dawley rats for the purpose of this study. Baseline ROM measurements were taken before glenohumeral immobilization. The rats were subjected to 8 weeks of immobilization before the fixation sutures were removed and changes in ROM and joint stiffness were evaluated. To evaluate whether immobilization resulted in a significant reduction in ROM, changes in kinematics were calculated. ROM was measured at each time point in the follow-up period and was compared to the baseline internal and external ROM measurements. In order to evaluate the stiffness, joint kinetics were calculated by determining the differences in torque (text and tint ) needed to reach the initial external rotation of 60&#176; and initial internal rotation of 80&#176;.
After the removal of the extra-articular suture fixation on follow-up day 0, we found a 63% decrease in total ROM compared to baseline. We observed continuous improvement until week 5 of follow-up, with the progress slowing down around a 19% restriction. On week 8 of follow-up, there was still an 18% restriction of ROM. Additionally, on follow-up day 0, we found the torque increased by 13.3 Nmm when compared to baseline. On week 8, the total torque was measured to be 1.4 &#177; 0.2 Nmm higher than initial measurements. This work introduces a rat model of shoulder adhesive capsulitis with lasting reduced ROM and increased stiffness.

This protocol presents an in vivo rat model of adhesive capsulitis. The model includes an internal fixation of the glenohumeral joint with extra-articular suture fixation for an extended time, resulting in a decreased rotational range of motion (ROM) and increased joint stiffness.

Modèle de rat de capsulite rétractile de l’épaule

This proposal aims to create an in vivo rat model of adhesive capsulitis for researching potential treatment options for this condition and other ...

Increasing Durability of Dissociated Neural Cell Cultures Using Biologically Active Coralline Matrix

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high cell isolation and a controlled environment. However, the survival of hippocampal cells in vitro is compromised: most cells die during the first week of culture. It is therefore of great importance to identify ways to increase the durability of neural cells in culture.
Calcium carbonate in the form of crystalline aragonite derived from the skeleton of corals can be used as a superior, active matrix for neural cultures. By nurturing, protecting, and activating glial cells, the coral skeleton enhances the survival and growth of these cells in vitro better than other matrices.
This protocol describes a method for cultivating hippocampal cells on a coralline matrix. This matrix is generated by attaching grains of coral skeletons to culture dishes, flasks, and glass coverslips. The grains assist in improving the environment of the cells by introducing them to a fine three-dimensional (3D) environment to grow on and to form tissue-like structures. The 3D environment introduced by the coral skeleton can be optimized for the cells by grinding, which enables control over the size and density of the grains (i.e., the matrix roughness), a property that has been found to influence glial cells activity. Moreover, the use of grains makes the observation and analysis of the cultures easier, especially when using light microscopy. Hence, the protocol includes procedures for generation and optimization of the coralline matrix as a tool to improve the maintenance and functionality of neural cells in vitro.

Dissociated hippocampal cell culture is a pivotal experimental tool in neuroscience. Neural cell survival and function in culture is enhanced when coralline skeletons are used as matrices, due to their neuroprotective and neuromodulative roles. Hence, neural cells grown on coralline matrix show higher durability, and thereby are more adequate for culturing.

Augmentation de la durabilité des cultures de cellules neurales dissociées à l’aide d’une matrice coralline biologiquement active

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high ...

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

Analyse spatio-temporelle bidimensionnelle automatisée de sondes FRET mobiles à molécule unique

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many biological and biomedical applications. However, long-term time-lapse SRS imaging of live cells has not been widely adopted. SRS microscopy often uses a high numerical aperture (NA) water-immersion objective and a high NA oil-immersion condenser to achieve high-resolution imaging. In this case, the gap between the objective and the condenser is only a few millimeters. Therefore, most commercial stage-top environmental chambers cannot be used for SRS imaging because of their large thickness with a rigid glass cover. This paper describes the design and fabrication of a flexible chamber that can be used for time-lapse live-cell imaging with transmitted SRS signal detection on an upright microscope frame. The flexibility of the chamber is achieved by using a soft material - a thin natural rubber film. The new enclosure and chamber design can be easily added to an existing SRS imaging setup. The testing and preliminary results demonstrate that the flexible chamber system enables stable, long-term, time-lapse SRS imaging of live cells, which can be used for various bioimaging applications in the future.

We report a stage-top, flexible environmental chamber for time-lapse imaging of live cells using upright stimulated Raman scattering microscopy with transmitted signal detection. Lipid droplets were imaged in SKOV3 cells treated with oleic acid for up to 24 h with a 3 min time interval.

Une chambre flexible pour l’imagerie de cellules vivantes en accéléré avec microscopie à diffusion Raman stimulée

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...