Bourse internationale Marie Curie sortant (Union européenne des accords de subvention FP/2007-2013 # 221834 et 254780), JD McDonnell Foundation, NSF Grant SBE 0542013, National Institutes of Health Grant NS034994, National Institute of Mental Health Grant MH5467 et le Howard Hughes Medical Institute (Janelia Research Farm Campus de subvention).

1. La construction de la microdrive Tous les disques sont fabriqués à partir des mêmes éléments de base: une partie mobile, qui porte l&#39;électrode et une partie fixe, qui est ancré par rapport au crâne. Un microdrive idéale permet lisse, mais à long voyage assez de l&#39;électrode dans de multiples petites étapes, est suffisamment robuste pour prévenir tout mouvement accidentel de l&#39;électrode, facile à manipuler par l&#39;expérimentateur sans interférer avec le comportement de l&#39;animal, de petite taille et de poids léger. En raison de ces exigences concurrentes, différente suite de disques différentes applications. Seuls les 4 parties sont nécessaires pour construire notre disque de base: une vis à tête plate en laiton, un écrou correspondant, un pont en plastique préparés à partir d&#39;un en-tête broches seule rangée et deux plaques de laiton sur mesure coupées. <ol><li> Casser un morceau à 3 broches de l&#39;en-tête </li><li> Tirez doucement sur la broche du milieu. </li><li> Agrandir le trou en perçant à travers elle avec une taille de foret N ° 55. </li><li> Coupez un elu à l&#39;aide du robinet de 00 à 90. </li><li> Coupez deux morceaux de la plaque en laiton. </li><li> Limer les bords des plaques avec un Dremmel. </li><li> Percez un trou au milieu des deux morceaux en utilisant une taille de foret N ° 65. </li><li> Assembler les pièces d&#39;entraînement de telle sorte que les plaques de cuivre se touchent les repères. Pour ce faire, insérez la vis en laiton à travers, successivement, la plaque de laiton, le trou tige filetée en-tête, la plaque de laiton seconde, et l&#39;écrou. Serrer la vis doucement afin que l&#39;ensemble devient stable. </li><li> Souder la goupille se termine sur les plaques en laiton. </li><li> Déposer l&#39;extrémité en saillie de la vis. </li><li> Souder l&#39;écrou à la vis. Veillez à ne pas souder l&#39;écrou de la plaque de laiton. </li><li> Testez le mouvement de l&#39;entraînement: tourner la vis aiguilles d&#39;une montre pour élever le pont en plastique. </li></ol> 2. Préparation de la sonde de silicium Avant de fixer la sonde sur le disque, ajouter de l&#39;isolant supplémentaire pour la zone de liaison de la sonde pour éviter cerebrfluide ospinal (LCR) ou l&#39;humidité de la production de courts-circuits: <ol><li> Peser et mélanger les composants en élastomère Sylgard dans un rapport de 10:1. </li><li> Utilisation d&#39;un applicateur de coton aiguisé, appliquer le Sylgard à l&#39;extrémité supérieure de la sonde. </li><li> Laisser sécher dans un four préchauffé à 60 ° C pendant 2 heures. </li></ol> Afin de s&#39;assurer que les sites d&#39;enregistrement sont dépourvues de tout débris, les pointes de sonde doivent être nettoyés: <ol start="4"><li> Préparer une dilution de 4% de détergent CONTRAD. </li><li> Laissez tremper la sonde dans le détergent à 63 ° C pendant au moins 2 heures. </li><li> Rincez le détergent hors par trempage de la sonde à plusieurs reprises dans de l&#39;eau distillée. </li></ol> Avant de fixer la sonde sur le disque, l&#39;impédance de chaque site d&#39;enregistrement doivent être vérifiés: <ol start="7"><li> Plonger la sonde dans une solution saline à 0,9%, et le connecter à une impédance-mètre. Si les sites d&#39;enregistrement trop grand nombre ont une impédance incorrecte, répétez les étapes 2.4-2.6 ou envisager d&#39;utiliser une sonde différente.Ici, nous utilisons un module de conditionnement Impédance de Frederick Haer, Co. (FHC), combiné avec un sélecteur de canal maison. Alternativement, un niPOD par NeuroNexus, Inc ou NanoZ par Neuralynx, Inc permet la surveillance de l&#39;impédance de tous les canaux simultanément la sonde. </li></ol> 3. Apposition de la sonde pour le microdrive <ol><li> Une lame de rasoir, découper des rainures multiples dans le pont pour créer une surface rugueuse. </li><li> Apposer la sonde à l&#39;arête du disque. Cette procédure est préférable de faire en vertu d&#39;un microscope opératoire, en tenant le lecteur avec une pince et d&#39;ajuster la sonde par un micromanipulateur de sorte que les tiges sont parfaitement parallèles avec la vis d&#39;entraînement. Cela garantit que pendant l&#39;avancement, le passage de sonde tiges dans le tissu cérébral, sans &quot;couper&quot; à travers elle. La profondeur exacte des extrémités de la sonde par rapport à la base de l&#39;entraînement doit être déterminée, à ce stade, en prenant en considération la profondeur de la structure cible à partir de la surface ducrâne. </li><li> La sonde est ensuite fixée sur le pont de ciment adhérence. </li><li> Facultatif: pour la visualisation de la piste de sonde dans le cerveau, la solution DiI (1-2% diluée dans de l&#39;éthanol) peut être appliquée sur le dos de la sonde à ce stade. </li></ol> 4. Préparation du crâne Avant la chirurgie, les électrodes de référence et au sol, et les parties de la cage de Faraday sur la tête sont préparés: <ol><li> Découper deux pièces 2 &quot;-longues de fil de cuivre, et à souder une extrémité de chaque fil de cuivre isolé pendant environ 1 mm. </li><li> En utilisant une aiguille, gratter la tête d&#39;un 00-90, 1/8 &quot;vis en acier inoxydable et de la soudure d&#39;une seule pièce de fil de cuivre à lui. À souder ces aciers inoxydables au sol vis-électrodes nécessite un flux approprié (par exemple, N-3 tout usage de flux de La-Co) et des températures de bout de soudure. soigneusement empêcher toute soudure de s&#39;écouler dans la gorge de la vis. ce sera utilisé comme électrode de masse. Répéter avec une autre vis et un fil de cuivre pour préparerl&#39;électrode de référence. </li><li> Découpez des morceaux de filet trapézoïdale cuivre. Ces pièces seront assemblées pour protéger la headstage. </li></ol> Les instruments chirurgicaux et la préparation sont les mêmes que ceux utilisés dans de nombreuses chirurgies pour petits animaux. La chirurgie est entièrement réalisée sous anesthésie profonde isoflurane, en utilisant des conditions aseptiques, selon NIH lignes directrices approuvées. S&#39;il vous plaît noter que la chirurgie (maquette) montré dans cette vidéo est à des fins de démonstration uniquement. Pour des raisons de visibilité et de tournage appropriés, plusieurs étapes préparatoires, les précautions et procédures chirurgicales postopératoires ne sont pas affichées / visible ou discuté. Avant la chirurgie, tous les composants et les fournitures doivent être stérilisés, en suivant les procédures appropriées (voir les Lignes directrices pour la chirurgie des rongeurs de survie; http://oacu.od.nih.gov/ARAC/surguide.pdf~~HEAD=NNS). Pendant la chirurgie, un champ stérile sur le crâne est préparé et isolé par des champs stériles. A la fin de la chirurgie, un antibiotique à large spectre est unpplied localement et un analgésique à action prolongée est administré par voie intramusculaire (par exemple, la buprénorphine, [Buprenex] 0,05 mg / kg). En outre, analgésique (par exemple, l&#39;ibuprofène) est fourni dans l&#39;eau potable à environ 60 mg/kg/24 heures pendant 5 jours. Pour appropriés des interventions chirurgicales et d&#39;anesthésie, de consulter des sources appropriées 12. <ol start="4"><li> Installez l&#39;animal dans l&#39;appareil de stéréotaxie, de se raser et nettoyer le cuir chevelu 13. </li><li> Couper la peau le long de la ligne médiane et repousser le cuir chevelu. Retirez le périoste, nettoyer et sécher le crâne. </li><li> Mesurez l&#39;emplacement et la distance entre bregma et lambda, et de déterminer les coordonnées x et y du site d&#39;implantation de sonde en conséquence l&#39;aide d&#39;un atlas stéréotaxique 14. Marquez le site en grattant une croix sur le crâne avec un scalpel. </li><li> Percer le crâne à l&#39;aide un peu à tête ronde de forage (taille ¼) et les vis de support d&#39;entraînement (en acier inoxydable, 000-120, 1/16 &quot;) à mi-chemin dans l&#39;os, sur des plaques osseuses différentes sur le sommet d&#39;unee sur le côté du crâne. Les vis fournir des ancres de manière sécurisée lier le casque sur le crâne. </li><li> Percez des trous au-dessus du cervelet et insérez le terrain et les électrodes de référence préparés à l&#39;étape 4.2. Pour enregistrer les potentiels de champ locaux (LFP), le choix du site de référence est essentiel. Ce site est choisi en raison LFP cérébelleuse est la plus petite de toutes les régions corticales et des artefacts musculaires sont minimes à cet endroit la ligne médiane. </li><li> Appliquer dentine activateur (Metabond Kit) en utilisant une brosse minuscule sur toute la surface du crâne. Rincez avec une solution saline à 0,9%. </li><li> Appliquer le ciment dentaire (Metabond kit; suivre les instructions du fabricant pour le mélange) sur le crâne, couvrant soigneusement les vis d&#39;ancrage et le sol et les électrodes de référence, mais en laissant le site d&#39;implantation de sonde clair. </li><li> Fixez les volets quatre mailles de cuivre (préparé à l&#39;étape 4.3) à la boîte crânienne. Pour cela, cimenter la base étroite de chacun d&#39;entre eux au niveau antérieur, les côtés gauche, droit, et postérieure du crâne. Thcuivre e ne doit jamais être en contact direct avec l&#39;os, mais toujours séparés par une couche de ciment. </li></ol> 5. Préparation de la surface du cerveau <ol><li> Aide d&#39;un foret à tête ronde, percer à travers le site d&#39;implantation en plusieurs étapes, bien que fréquemment l&#39;irrigation de l&#39;os avec une solution saline. </li><li> Retirez délicatement le volet osseux et d&#39;irriguer la surface du cerveau. </li><li> Pour insérer une sonde multi-tige, une large bande de dure-mère est enlevée. Deux outils sont nécessaires pour éliminer la dure-mère: un scalpel et d&#39;un crochet préparé à partir d&#39;une aiguille d&#39;insectes (alternativement, une microélectrode de tungstène standard). Pliez la pointe de l&#39;aiguille en poussant contre une surface dure (p. ex lame de microscope en verre), et l&#39;attacher à une poignée (ici, un morceau de bois Q-tip, ou alternativement un porte-aiguille microdissecting). </li><li> Soulevez la dure-mère avec le crochet, et le couper avec un scalpel. Une attention particulière est prise pour éviter d&#39;endommager la pie-mère, les navires et la surface du néocortex. Petits saignements peuvent être résoluspar une irrigation saline. Si le saignement majeur se produit ou le néocortex est compromise de quelque façon, on devrait envisager de mettre fin de la chirurgie et la préparation d&#39;un autre animal. </li></ol> 6. Implanter la sonde A ce stade, la densité et l&#39;orientation des bâtiments de surface corticales sont soigneusement évalués. Coordonnées stéréotaxiques doit être ajustée, car la sonde doit pénétrer dans le cerveau dans une zone libre de plus grands navires. Pour l&#39;implantation, l&#39;ensemble d&#39;entraînement peut avoir lieu avec une pince crocodile fixé au support stéréotaxique. La visibilité ininterrompue de la surface du cerveau et les conseils de la sonde sont indispensables pour la pénétration réussie. <ol><li> Abaissez lentement la sonde jusqu&#39;à environ 1 mm au-dessus de la cible visée, tandis que l&#39;irrigation en permanence la craniotomie avec une solution saline. Pour l&#39;enregistrement du néocortex, les pointes de sonde sont descendus dans le cortex d&#39;environ 0,5 mm et a levé en arrière près de la surface. </li&gt; <li> Sceller la craniotomie en appliquant un mélange chaud fondu d&#39;huile cire et paraffine par le biais d&#39;une aiguille (10-20g de cire dans 10 ml d&#39;huile de paraffine, chauffé à 65 ° C). Avant l&#39;application, refroidir le mélange à 30 ° C et de tester la densité. Il doit être suffisamment souple pour permettre le mouvement de sonde facile). Pour faciliter la couverture complète, le mélange peut être fondu in situ par l&#39;approche de la cire durcie avec la pointe d&#39;un micro-cauterizer. </li><li> Fixez le bas de la route sur le crâne avec du ciment adhérence, ayant soin de laisser l&#39;écrou libre de tourner. Il est d&#39;une importance capitale pour éviter tout accident &quot;bosse&quot; de l&#39;entraînement à ce stade, sinon la sonde pourrait endommager le cortex. Après le lecteur est fixé sur le crâne, un mouvement régulier de la sonde doit être vérifiée. </li><li> Cimenter la partie de connecteur de la sonde par rapport au crâne. </li></ol> 7. Construction de la tête sur la cage de Faraday <ol><li> Tirez vers le haut et d&#39;assembler les rabats maille de cuivre dans un cylindre de protection autour de la sonde et drive. Le cylindre sert également un blindage électrique contre le bruit ambiant et les artefacts onde lente produits par les trichites chargées dans l&#39;animal de se comporter. </li><li> Réglez la hauteur du cylindre en coupant les excès de matériau de sorte que le treillis de cuivre est de niveau avec le haut du connecteur de la sonde. </li><li> Souder les fils de la référence et vis de terre sur les broches appropriées du connecteur. Aussi soudure rabats adjacents maille de cuivre ainsi que d&#39;assurer leur continuité électrique, et souder le fil de terre à la maille de cuivre. </li><li> Appliquer une couche de ciment emprise sur le treillis de cuivre pour le renforcer et à éviter tout contact direct entre le métal et la peau de l&#39;animal. Eventuellement, appliquer une couche de résine époxy pour renforcer encore la chapellerie. </li><li> Tester le mouvement de la vis d&#39;entraînement. </li><li> Couvrez le dessus du casque avec une pièce à couper à partir d&#39;un gant en caoutchouc. </li></ol> 8. Enregistrement chez l&#39;animal se déplaçant librement <ol><li> Après appromangé soins post-opératoires, l&#39;animal se connecter au système d&#39;enregistrement en utilisant un headstage haute impédance et un poids léger, ultrasouple multi-brins du câble. Contrebalancer le poids du casque. </li><li> Testez la qualité d&#39;enregistrement chaque jour dans le homecage. La position des sites d&#39;enregistrement est jugé par les deux modes de tir unité et la forme des potentiels de champs locaux. Abaisser la sonde progressivement en tournant la vis par petits incréments (généralement 1/8-1/4 de tour par jour, soit 35-70 micromètres) jusqu&#39;à ce que la structure cible est atteinte. </li></ol> 9. Les résultats représentatifs Signaux électrophysiologiques (potentiel de champ local et unité d&#39;activité) varient en fonction de la structure enregistrée et le comportement actuel de l&#39;animal. La figure 1 montre des exemples de 32 canaux CA1 enregistrements hippocampe tandis que le rat est d&#39;explorer un champ ouvert. Notez l&#39;éminent 8 Hz (thêta bande) oscillation du potentiel de champ local lors de l&#39;exploration avec superimposed dopage sur tiges et des sites multiples (des exemples de pointes indiquées par des flèches). Pour analyser l&#39;activité neuronale unitaire, les pointes sont détectés et triés en unités simples en utilisant l&#39;analyse de cluster de leurs formes d&#39;onde 15-16. <img src="/files/ftp_upload/3568/3568fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. CA1 enregistrements hippocampe chez le rat en utilisant un comportement 4 jarrets de la sonde de silicium x 8 sites. Les enregistrements sont à large bande et échantillonné à 20 000 Hz, ce qui permet d&#39;étudier les deux oscillations du champ locaux potentiels (par exemple &quot;thêta&quot; bande de 8 Hz rythme) et de l&#39;activité neuronale de dopage. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3568/3568table1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3568/3568table1.jpg" alt="Tableau une" /></a> Tableau 1. Alternatives aux réactifs et le matériel utilisés.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Ce film illustre la procédure d&#39;implantation des sondes de silicium pour des affections chroniques à grande échelle des enregistrements chez le rat se comporter. Les étapes critiques afin d&#39;assurer des enregistrements de qualité de l&#39;activité neuronale proviennent de la fragilité à la fois biologique (tissu cérébral) et techniques (silicium sonde) matériaux. Une attention particulière doit être prise lors de la manipulation de la sonde pour éviter tout contact de la queue avec tout à distance ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Type </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Silicon sonde Buzsaki32, 4 x tiges 8 sites. Emballage: câble en polyamide flexible </td><td> Matériel </td><td> NeuroNexus </td><td> Sonde: buzsaki32 Emballage: HC32 </td><td> La sonde d&#39;enregistrement </td></tr><tr><td> Vis en laiton ronde, 00-90 x 1/2 vis en laiton rondes </td><td> Matériel </td><td> JIMorris </td><td> R0090B500 </td><td> Partie d&#39;entraînement </td></tr><tr><td> Écrou hexagonal en laiton, 00-90 </td><td> Matériel </td><td> JIMorris </td><td> N0090B </td><td> Partie d&#39;entraînement </td></tr><tr><td> Brass C260 bande, ASTM-B36 Épaisseur: 0.025 &quot;, Longueur: 12&quot;, Largeur: 1/2 &quot; </td><td> Matériel </td><td> Petites pièces </td><td> B000FMYU72 </td><td> Partie d&#39;entraînement </td></tr><tr><td> Connecteur tête, pas de 2mm, male, seule rangée, straigt, 36 postes </td><td> Matériel </td><td> Digikey </td><td> 2163S-36-ND </td><td> Partie d&#39;entraînement </td></tr><tr><td> 2-partie Sylgard élastomère silicone </td><td> Matériel </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> SYLG184 </td><td> Pour isoler les extra-la sonde </td></tr><tr><td> Decon CONTRAD 70 Détergent liquide </td><td> Réactif </td><td> Fisher Scientific </td><td> 04-355 Decon Laboratories N °: 1002 </td><td> Pour nettoyer les sites d&#39;enregistrement </td></tr><tr><td> Module de conditionnement Impédance </td><td> Équipement </td><td> FHC Inc </td><td> 55-70-0 </td><td> Impédancemètre </td></tr><tr><td> niPOD - 32 canaux </td><td> Équipement </td><td> NeuroNexus </td><td> niPOD -32 </td><td> Impédancemètre </td></tr><tr><td> Ciment Grip Industrial Grade </td><td> Matériel </td><td> Caulk Dentsply </td><td> 675571 (en poudre) 675572 (solvant) </td><td> Grip CEment </td></tr><tr><td> 1,1 &#39;-dioctadécyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate («DiI &#39;; DiIC18 (3)) </td><td> Réactif </td><td> Invitrogen </td><td> D282 </td><td> Pour colorer la piste sonde dans le cerveau </td></tr><tr><td> Vis inox machine en acier, à tête bombée, d&#39;entraînement fendue, # 00-90, 1/8 &quot; </td><td> Matériel </td><td> Petites pièces </td><td> MX-0090-02B </td><td> Au sol et vis de référence </td></tr><tr><td> Fil de bobinage, 20G, le nylon-polyuréthane enduit, MW80 </td><td> Matériel </td><td> Petites pièces </td><td> B000IJYRP2 </td><td> Terre et le fil de référence </td></tr><tr><td> Vis inox machine en acier, à tête bombée fendue Drive, # 000-120, 1/16 &quot; </td><td> Matériel </td><td> Petites pièces </td><td> MX-000120-01B </td><td> Vis d&#39;ancrage </td></tr><tr><td> N-3 Tout liquide Flux but </td><td> Réactif </td><td> La-Co (Markal) </td><td> 23512 </td><td> Permet de souder en acier inoxydable </td></tr><tr><td> MicroGrid précision élargi de cuivre </td><td> Matériel </td><td> Dexmet </td><td> 3 CU6-050 FA </td><td> Treillis de cuivre pour le tête cage de Faraday </td></tr><tr><td> C &amp; B-Metabond rapide! Ciment système - la dentine Activator </td><td> Matériel </td><td> Parkell </td><td> S380 </td><td></td></tr><tr><td> C &amp; B-Metabond rapide! Système de ciment - ciment dentaire </td><td> Matériel </td><td> Parkell </td><td> S380 </td><td></td></tr><tr><td> Forte aiguille de tungstène point et porte- </td><td> Outil </td><td> Instruments chirurgicaux Roboz </td><td> RS-6064 et RS-6061 </td><td> Pour rendre le crochet pour soulever la dure-mère </td></tr><tr><td> Fraise en carbure de HP 1/4 </td><td> Outil </td><td> Henry Schein </td><td> 9990013 </td><td></td></tr><tr><td> Paraffine (granulés) </td><td> Matériel </td><td> Fisher Scientific </td><td> P31-500 </td><td></td></tr><tr><td> Huile minérale légère (NF / FCC) </td><td> Matériel </td><td> Fisher Scientific </td><td> O121-1 </td><td></td></tr><tr><td> GC ELECTRONICS 10-114 adhésif époxy 2-Partie </td><td> Matériel </td><td> Newark </td><td> 00Z416 </td><td></td></tr><tr><td> Type 1 LITZ 21 AWG 40/36 Red polyuréthane mono-Nylon (MW80-C) à 0,041 &quot;+ / -0.002&quot; OD </td><td> Matériel </td><td> La Nouvelle-Angleterre Technologies Corporation fil </td><td> N28-36E-400-2 </td><td> Pour rendre le câble entre le headstage et l&#39;amplificateur </td></tr><tr><td> 32-canaux headstage Very Large Scale Integration, 20x de gain </td><td> Équipement </td><td> Plexon </td><td> HST/32V-G20 </td><td> Headstage </td></tr></tbody></table>

large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents

Un défi majeur en neurosciences est lien entre le comportement à l&#39;activité collective des assemblées de neurones. Compréhension des relations d&#39;entrée-sortie de neurones et les circuits nécessite des méthodes avec la sélectivité spatiale et la résolution temporelle appropriée pour l&#39;analyse mécaniste des ensembles de neurones chez l&#39;animal se comporter, de l&#39;enregistrement soit d&#39;échantillons représentative de grandes isolés neurones isolés. Ensemble de surveillance de l&#39;activité neuronale a progressé de manière remarquable dans la dernière décennie chez les animaux à la fois petits et grands-cerveau, y compris des sujets humains 1-11. Multiple-site d&#39;enregistrement avec le silicium à base de dispositifs sont particulièrement efficaces en raison de leur évolutivité, faible volume et la conception géométrique. Ici, nous décrivons des méthodes pour enregistrer plusieurs neurones isolés et potentiels de champ local à se comporter les rongeurs, en utilisant des sondes disponibles dans le commerce de silicium micro-usinées, avec des composants accessoires faits sur mesure. Il ya deux options de base fou l&#39;interfaçage des sondes de silicium pour préamplificateurs: cartes de circuits imprimés et les câbles flexibles. Entreprises de la sonde d&#39;alimentation ( <a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a> ; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a> ; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a> ) fournissent généralement le service de liaison et de fournir des sondes liées aux cartes de circuits imprimés ou câbles flexibles. Ici, nous décrivons l&#39;implantation d&#39;un 4-tige, 32 place sonde attachée à souple de polyimide par câble, et monté sur un microdrive mobile. Chaque étape de la préparation de la sonde, la construction et de la chirurgie microdrive est illustrée de façon que l&#39;utilisateur final peut facilement reproduire le processus.

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Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

Nous décrivons les méthodes à grande échelle d&#39;enregistrement de plusieurs unités simples et le potentiel de champ local à se comporter les rongeurs avec des sondes de silicium. Disque de fabrication, de fixation de sonde sur le disque et les processus d&#39;implantation de la sonde sont illustrés dans des détails suffisants pour faciliter la reproduction.

À grande échelle d&#39;enregistrement des neurones par des sondes de silicium mobiles à se comporter Rongeurs

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

large-scale-recording-neurons-movable-silicon-probes-behaving

Research

JoVE Journal

Neuroscience

34.5K vues.  University of New Jersey. Nous décrivons les méthodes à grande échelle d'enregistrement de plusieurs unités simples et le potentiel de champ local à se comporter les rongeurs avec des sondes de silicium. Disque de fabrication, de fixation de sonde sur le disque et les processus d'implantation de la sonde sont illustrés dans des détails suffisants pour faciliter la reproduction.

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Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

Enregistrement à grande échelle ensembles neuronaux avec des sondes en silicone chez le rat anesthésié

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

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Neurosciences

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Marquage fluorescent rétrograde Permet ciblée extracellulaire seule unité d&#39;enregistrement de neurones identifiés<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, including rats, hamsters, and mice, are active during the night and relatively inactive during the day. Many other behavioral and physiological measures also exhibit daily rhythms, but in rodents, running-wheel activity serves as a particularly reliable and convenient measure of the output of the master circadian clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. In general, through a process called entrainment, the daily pattern of running-wheel activity will naturally align with the environmental light-dark cycle (LD cycle; e.g. 12 hr-light:12 hr-dark). However circadian rhythms are endogenously generated patterns in behavior that exhibit a ~24 hr period, and persist in constant darkness. Thus, in the absence of an LD cycle, the recording and analysis of running-wheel activity can be used to determine the subjective time-of-day. Because these rhythms are directed by the circadian clock the subjective time-of-day is referred to as the circadian time (CT). In contrast, when an LD cycle is present, the time-of-day that is determined by the environmental LD cycle is called the zeitgeber time (ZT).
Although circadian rhythms in running-wheel activity are typically linked to the SCN clock6-8, circadian oscillators in many other regions of the brain and body9-14 could also be involved in the regulation of daily activity rhythms. For instance, daily rhythms in food-anticipatory activity do not require the SCN15,16 and instead, are correlated with changes in the activity of extra-SCN oscillators17-20. Thus, running-wheel activity recordings can provide important behavioral information not only about the output of the master SCN clock, but also on the activity of extra-SCN oscillators. Below we describe the equipment and methods used to record, analyze and display circadian locomotor activity rhythms in laboratory rodents.

Circadian rhythms in voluntary wheel-running activity in mammals are tightly coupled to the molecular oscillations of a master clock in the brain. As such, these daily rhythms in behavior can be used to study the influence of genetic, pharmacological, and environmental factors on the functioning of this circadian clock.

Enregistrement et analyse des rythmes circadiens dans la course roue-activité chez les rongeurs

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the centrolateral/parafascicular; Cl/Pf nucleus). The activation of either the PPN or Cl/Pf nuclei in vivo has been described to induce the arousal of the animal and an increment in gamma band activity in the cortical electroencephalogram (EEG). The cellular mechanisms for the generation of gamma band oscillations in Reticular Activating System (RAS) neurons are the same as those found to generate gamma band oscillations in other brains nuclei. During current-clamp recordings of PPN neurons (from parasagittal slices from 9 - 25 day-old rats), the use of depolarizing square steps rapidly activated voltage-dependent potassium channels that prevented PPN neurons from being depolarized beyond -25 mV.
Injecting 1 - 2 sec long depolarizing current ramps gradually depolarized PPN membrane potential resting values towards 0 mV. However, injecting depolarizing square pulses generated gamma-band oscillations of membrane potential that showed to be smaller in amplitude compared to the oscillations generated by ramps. All experiments were performed in the presence of voltage-gated sodium channels and fast synaptic receptors blockers. It has been shown that the activation of high-threshold voltage-dependent calcium channels underlie gamma-band oscillatory activity in PPN neurons. Specific methodological and pharmacological interventions are described here, providing the necessary tools to induce and sustain PPN subthreshold gamma band oscillation in vitro.

The pedunculopontine nucleus (PPN) is located in the brainstem and its neurons are maximally activated during waking and rapid eye movement (REM) sleep brain states. This work describes the experimental approach to record in vitro gamma band subthreshold membrane oscillation in PPN neurons.

Enregistrement Gamma Band Oscillations dans pédonculopontin Nucleus Neurones

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the ...

Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a comprehensive survey of the morphological characteristics observed among a selective neuronal population. Combination of these techniques constitutes a novel approach for the collection and analysis of neuroanatomical data. Together, these techniques enable large-scale, and therefore more comprehensive, sampling of selective neuronal populations and establish unbiased quantitative methods for describing morphologically unique neuronal classes within a population.
The protocol outlines the use of modified rabies virus to selectively label neurons. G-deleted rabies virus acts like a retrograde tracer following stereotaxic injection into a target brain structure of interest and serves as a vehicle for the delivery and expression of EGFP in neurons. Large numbers of neurons are infected using this technique and express GFP throughout their dendrites, producing &#34;Golgi-like&#34; complete fills of individual neurons. Accordingly, the virus-mediated retrograde tracing method improves upon traditional dye-based retrograde tracing techniques by producing complete intracellular fills.
Individual well-isolated neurons spanning all regions of the brain area under study are selected for reconstruction in order to obtain a representative sample of neurons. The protocol outlines procedures to reconstruct cell bodies and complete dendritic arborization patterns of labeled neurons spanning multiple tissue sections. Morphological data, including positions of each neuron within the brain structure, are extracted for further analysis. Standard programming functions were utilized to perform independent cluster analyses and cluster evaluations based on morphological metrics. To verify the utility of these analyses, statistical evaluation of a cluster analysis performed on 160 neurons reconstructed in the thalamic reticular nucleus of the thalamus (TRN) of the macaque monkey was made. Both the original cluster analysis and the statistical evaluations performed here indicate that TRN neurons are separated into three subpopulations, each with unique morphological characteristics.

This protocol describes large-scale reconstructions of selective neuronal populations, labeled following retrograde infection with a modified rabies virus expressing fluorescent markers, and independent, unbiased cluster analyses that enable comprehensive characterization of morphological metrics among distinct neuronal subclasses.

Reconstructions à grande échelle et indépendante, impartiale Clustering Basé sur Metrics morphologiques à Classifier Neurones dans les Populations sélectives

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantification des molécules d&#39;endosome et de lysosome dans les neurones cultivés utilisant des sondes fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced electrodes for large-scale electrophysiological recording of neuronal activity, but the procedures for their chronic implantation are still underdeveloped. The activity of hippocampal place cells is known to correlate with an animal&#39;s position in the environment, but the underlying mechanisms are still unclear. To investigate place cells, here we describe a set of techniques which range from the fabrication of devices for chronic silicon probe implants to the monitoring of place field activity in a cue-enriched treadmill apparatus. A micro-drive and a hat are built by fitting and fastening together 3D-printed plastic parts. A silicon probe is mounted on the micro-drive, cleaned, and coated with dye. A first surgery is performed to fix the hat on the skull of a mouse. Small landmarks are fabricated and attached to the belt of a treadmill. The mouse is trained to run head-fixed on the treadmill. A second surgery is performed to implant the silicon probe in the hippocampus, following which broadband electrophysiological signals are recorded. Finally, the silicon probe is recovered and cleaned for reuse. The analysis of place cell activity in the treadmill reveals a diversity of place field mechanisms, outlining the benefit of the approach.

We describe the diverse steps to implant chronic silicon probes and to record place cells in mice that are running head-fixed on a cue-enriched treadmill apparatus.

Implantation des sondes de silicium chronique et enregistrement des cellules hippocampiques Place dans un appareil de tapis roulant enrichi

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Imagerie ratiométrique Calcium des neurones individuels en comportement Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Construction of an Improved Multi-Tetrode Hyperdrive for Large-Scale Neural Recording in Behaving Rats

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems neuroscience. One key component of this technique consists of the precise placement of multiple electrodes into desired brain regions and the maintenance of their stability. Here, we describe a protocol for the construction of a 3D-printable hyperdrive, which includes eighteen independently adjustable tetrodes, and is specifically designed for in vivo extracellular neural recording in freely behaving rats. The tetrodes attached to the microdrives can either be individually advanced into multiple brain regions along the track, or can be used to place an array of electrodes into a smaller area. The multiple tetrodes allow for simultaneous examination of action potentials from dozens of individual neurons, as well as local field potentials from populations of neurons in the brain during active behavior. In addition, the design provides for simpler 3D drafting software that can easily be modified for differing experimental needs.

We present the construction of a 3D-printable hyperdrive with eighteen independently adjustable tetrodes. The hyperdrive is designed to record brain activity in freely behaving rats over a period of several weeks.

Construction d’un Hyperdrive tétrode multi amélioré pour un enregistrement neuronaux à grande échelle en comportement des Rats

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

Préparations et protocoles pour toute cellule Patch Clamp enregistrement des neurones Tectal Xenopus laevis

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...