Ce travail a été soutenu par des prix de HHMI 56006760 à JDV, les National Institutes of Health (NIH) (2 TL1 RR 24158-6) pour DMAW, et de la Fondation Médicale Ellison (AG-SS-2465) et le NIH (GM45735, GM45735S1 et GM096445) à LP. GM45735S1 a été émis par le NIH dans le cadre du Reinvestment Act de 2009 American Recovery and. Les microscopes utilisés pour ces études ont été soutenues en partie par une subvention du NIH / NCI (5 P30 CA13696).

1. Transformation des cellules de levure avec les biocapteurs <ol><li> Transformer la souche de levure désirée avec plasmide portant mito-roGFP ou mitGO-ATeam2 selon la méthode de l&#39;acétate de lithium 27. </li><li> Pour confirmer transformation avec le biocapteur plasmidique et pour éviter la perte du plasmide, sélectionner et maintenir transformants sur milieu complet synthétique sélectif approprié (SC-Ura pour mito-roGFP, ou SC-Leu pour mitGo-ATeam2). Si la sonde fluorescente a été sous-cloné dans un plasmide différent de ceux décrits ici, utiliser le milieu sélectif approprié. Visualisez transformants par microscopie à fluorescence pour confirmer qu&#39;ils expriment le biocapteur fluorescent et de morphologie mitochondrial normal. </li></ol> 2. La croissance des cellules et la préparation pour l&#39;imagerie fonction cellulaire et la réponse au traitement de la toxicomanie sont fortement tributaires de la densité cellulaire et l&#39;activité métabolique. Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque les cellulessont en division active (phase mid-log, ~ 0.5 - 1 x 10 7 cellules / ml). Le moyen le plus fiable pour produire des cultures en phase mi-log de densité uniforme est d&#39;inoculer à partir d&#39;une pré-culture en phase stationnaire. <ol><li> Préparer une pré-culture en phase stationnaire: choisir une seule colonie de cellules transformées à partir d&#39;une plaque et inoculer des milieux liquides sélectifs (5 ml dans un tube conique à fond 50 ml). Croître à 30 ° C sous agitation à 225 rpm jusqu&#39;à ce que la densité optique de la culture à 600 nm (DO600) a atteint un plateau (24-48 h). </li><li> Préparer une culture en phase semi-logarithmique pour l&#39;observation: utiliser le volume approprié de pré-culture pour inoculer 5 ml de milieux sélectifs dans un tube conique à fond 50 ml. Médias YPD est autofluorescente et ne doit pas être utilisé pour ces études. Utilisez, glucose, sur la base abandon des supports synthétiques complètes (SC-Ura). Cultiver des cellules à 30 ° C, en agitant à 225 rpm, pendant 4-16 heures, jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent la phase semi-log (~ 0.5 - 1 x 10 7 cellules / ml). La densité cellulaire peut être déterminéepar mesure de la DO 600; calibrer le spectrophotomètre pour déterminer la bonne DO600 lecture. Sur notre Beckman DU530 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN), la phase semi-logarithmique correspond à une DO600 de 0,1-0,3. </li></ol> Mito-roGFP1 détecte les fluctuations de l&#39;organite en réponse à des changements métaboliques. Par exemple, dans cet essai mitochondriales changements d&#39;état redox lorsque la levure pousse pas sur les sources de carbone fermentescibles (par exemple le glucose, comme dans les médias SC) et de sources de carbone non fermentescibles (par exemple le glycérol, comme dans les médias SGlyc), et même dans les différents lots de la même médias. Par conséquent, utiliser le même lot de médias pour toutes les expériences. <ol start="3"><li> Les cellules sont prêtes pour la concentration (voir l&#39;étape 2.4) et l&#39;imagerie si aucun traitement n&#39;est effectué. Si les cellules sont traitées, incuber les cellules avec le traitement approprié et passez à l&#39;étape suivante. </li><li> Concentrez 1 ml de culture par centrifugation à 6000 g pendant 15 sec etremise en suspension du culot cellulaire dans 20 ul de médias. Ces conditions de maximiser le nombre de cellules distincts dans le champ de vision. </li><li> Appliquer 2 pl des cellules remises en suspension à une diapositive. Couvrir avec une lamelle (n ° 1,5, de préférence à haute performance 170 ± 5 um d&#39;épaisseur), et sceller les bords de la lamelle avec vernis à ongles ou valap (voir réactifs). Pour sceller avec valap, faire fondre une petite quantité sur une spatule métallique en le tenant sur une flamme du bec Bunsen, puis étaler une petite quantité sur les bords de la lamelle. </li><li> Maintenir les cellules à 30 ° C pendant l&#39;imagerie. Un chauffe-objectif sur l&#39;objectif à immersion d&#39;huile 100x utilisés pour l&#39;imagerie fonctionne bien pour cette application. Dans ces conditions, la morphologie mitochondriale, état redox et les niveaux d&#39;ATP restent inchangés lors de l&#39;imagerie pendant 10-15 min. </li></ol> 3. Configuration Imaging <ol><li> Configuration pour l&#39;imagerie mito-roGFP1 sur un microscope de fluorescence à champ large Les étapes sont ici adaptées à la AxioObserver.Z1 microscope équipé d&#39;une source Colibri LED d&#39;excitation, un grand champ Orca caméra ER et le logiciel d&#39;acquisition Axiovision. Photoblanchiment des deux canaux et photoconversion de oxydés mito-roGFP1 est considérablement réduite en utilisant un éclairage à LED par rapport au mercure arc lampe d&#39;éclairage (voir ci-dessous). Pour maximiser signal et résolution, utilisez l&#39;ouverture numérique plus possible de l&#39;objectif, et le plus faible grossissement qui offre une résolution spatiale suffisante. En outre, pour l&#39;imagerie mito-roGFP, vérifiez que l&#39;objectif transmet ainsi à 365 nm. Le 100x/1.3NA CE PlanNeofluar objectif (Zeiss) fonctionne bien pour cette application. Configurez le logiciel d&#39;acquisition pour capturer les espèces mito-roGFP1 oxydé et réduit. Nous utilisons les conditions suivantes. <ol><li> Configurez le canal pour oxydé mito-roGFP à utiliser excitation à 365 nm (100% LED de puissance) et un filtre d&#39;émission approprié pour la GFP, comme le 38 HE set (Zeiss), avec la excitatio inclusFiltre n retiré du cube. L&#39;élimination du filtre à l&#39;excitation permet l&#39;excitation à la fois 365 nm et 470 nm, sans avoir à changer les filtres, augmentant ainsi la résolution de temps réalisables. </li><li> Configurer le canal pour réduire mito-roGFP utiliser excitation à 470 nm (100% LED de puissance) et, comme mentionné ci-dessus, le même cube filtre d&#39;émission utilisé pour la oxydé mito-roGFP. Réglez l&#39;appareil photo 1x1 binning pour optimiser la résolution spatiale. </li><li> Réglez le logiciel à acquérir az pile constituée de 11 tranches avec un espacement de 0,5 um, la collecte de deux canaux à chaque position z. Ce mode d&#39;acquisition est plus lente que l&#39;acquisition de chaque pile z, à son tour, mais il empêche les artefacts provenant de mouvement mitochondrial entre l&#39;acquisition des chaînes oxydées et réduites. </li><li> plusieurs cellules d&#39;image pour déterminer un temps d&#39;exposition approprié, produire un signal de saturation forte mais pas. Il est important de maintenir le ratio de temps d&#39;exposition pour oxydé et réduit mito-roGFP1 pour tout expérimenters. Par exemple, si les temps d&#39;exposition pour oxydé et réduit mito-roGFP1 sont 300 et 100 msec, respectivement, le temps d&#39;exposition pour oxydé mito-roGFP1 devrait être 3 fois plus que pour réduire mito-roGFP pour toutes les expériences. </li></ol></li><li> Configuration pour l&#39;imagerie mitGO-ATeam2 sur un microscope confocal spectral Pour quantifier les niveaux d&#39;ATP en utilisant mitGO-ATeam2, la fluorescence de la GFP (émission maximale 510 nm) doit être distinguée de celle de OFP (maximum d&#39;émission 560 nm). Il ya des jeux de filtres de fluorescence qui résolvent la fluorescence émise par ces fluorophores. Cependant, nous constatons qu&#39;un détecteur spectral, disponible sur de nombreux balayage laser microscopie confocale, qui fonctionne le mieux pour cette application. Un détecteur spectral sépare l&#39;émission de fluorescence en plusieurs composantes (généralement 32 ou plus) selon la longueur d&#39;onde. Plusieurs bandes de longueurs d&#39;onde adjacents peuvent être combinés en une voie d&#39;image. Les longueurs d&#39;onde à combiner sont choisis de manière empirique afin de maximiser signal GFP et OFP tout en évitant croisement de signal qui serait confondre la mesure de FRET. Utilisez l&#39;objectif d&#39;ouverture numérique élevée disponible. Nous utilisons un 100x/1.49 ou 60x/1.49 objectif Apo-FRBR. Nous utilisons le Nikon A1R microscope confocal exécutant le logiciel NIS Elements. Configurez le logiciel d&#39;acquisition pour capturer les espèces mitGO-ATeam2 liée à l&#39;ATP et ATP-lié. Nous utilisons les conditions suivantes. <ol><li> Set sténopé à 1,0 unités Airy (UA), qui sur notre système correspond à la résolution az d&#39;environ 0,42 um. </li><li> Réglez le zoom de numérisation d&#39;approcher la limite de Nyquist, ce qui permettra de maximiser l&#39;information spatiale dans l&#39;image. Sur notre système, la taille du pixel est de 0,12 um. </li><li> Parce que les mitochondries peuvent se déplacer lors de l&#39;imagerie, il peut être utile d&#39;augmenter la vitesse d&#39;imagerie en recadrant le champ à 512 x 256 pixels. Le temps total nécessaire à l&#39;image d&#39;une image dans notre système est de 1,0 sec, y compris un moyen de balayage de 2 fois. Selon la résolution spatiale souhaitée, le domaine peut encore être recadrée pour de pluse de résolution temporelle. </li><li> Excite à 488 nm, et de recueillir des émissions de 500 à 520 nm pour la GFP, et de 550 à 580 nm pour OFP. Valeurs optimales réels peuvent varier selon les caractéristiques du système d&#39;imagerie. </li><li> La puissance du laser optimale pour notre système est compris entre 6,0 et 6,4%. La puissance du laser optimale variera pour chaque système de microscope, mais idéalement être aussi bas que possible tout en produisant une image interprétable. Utilisez un mesureur de puissance interne ou externe à suivre l&#39;évolution de la puissance du laser, qui se produisent normalement au fil du temps dans tout système optique. </li><li> Régler le gain du détecteur et l&#39;intensité de la lumière d&#39;éclairage afin de maximiser l&#39;intervalle de valeurs de pixel détecté mais ne pas saturer le signal, pour autant de cellules que possible. Ne pas analyser toutes les cellules contenant plus de 1% pixels saturés. Image Tous les échantillons en utilisant le même objectif, la puissance du laser, balayage zoom, la taille des pixels, le gain et offset. </li></ol></li></ol> 4. Image Acquisition <ol><li> Localisez le pla focal<html> n des cellules d&#39;intérêt à l&#39;aide de la lumière transmise afin de minimiser le blanchiment de la sonde fluorescente. </li><li> Après localiser une ou plusieurs cellules d&#39;intérêt, de recueillir une série Z à travers toute la profondeur d&#39;une cellule typique (à 7 um) en utilisant une taille de pas de 0,5 pm. </li><li> Image d&#39;autres cellules d&#39;intérêt sur la diapositive, mais ne pas l&#39;image d&#39;une diapositive pendant plus de 15 min. Après 15 minutes, sur la diapositive, les cellules perdent leur viabilité. </li></ol> 5. Analyse Taux d&#39;ATP mitochondriale est déterminée en mesurant le rapport de l&#39;émission mitGO-ATeam2 à 560 nm à celle à 510 nm 27 l&#39;état redox de l&#39;organelle est mesurée par la diminution de oxydée (R / S) Rapport de mito-roGFP;. Soit émission à 510 nm après excitation à 470 nm divisée par une émission à 510 nm après excitation à 365 nm. Avant de calculer le rapport, nous soustrayons fond et déterminer une valeur seuil pour les pixels appartenant aux mitochondries fluorescent. tente &quot;&gt; Domaine public (par exemple ImageJ 30) ou disponibles dans le commerce (par exemple Volocity, Perkin-Elmer) logiciel peut être utilisé pour l&#39;analyse des mito-roGFP1 ou mitGO-ATeam2. Selon le logiciel utilisé pour l&#39;acquisition d&#39;images et d&#39;analyse, les images peut d&#39;abord être converti en un autre format, tel que TIFF, avant de les ouvrir dans le logiciel d&#39;analyse. Si les images sont converties, il est essentiel de vérifier que les valeurs de pixels ne sont pas modifiés au cours de la conversion. L&#39;analyse des données mito-roGFP1, à l&#39;aide deux programmes sont décrits ci-dessous. menus du programme et des options à choisir au sein de chaque menu sont marquées en italique gras. 5.1 analyse ImageJ <ol><li> Ouvrir les images et le type de changement à 32 bits: image → → type 32 bits. </li><li> Dessiner une région d&#39;intérêt (ROI) dans une zone où il n&#39;y a pas de cellules. Calculer l&#39;intensité moyenne dans ce ROI: Analyser → Mesure. </li><li> Soustraire le fond de la moyenne calculée à partir de la pile: Processus → Math → Soustraire. </li><li> En utilisant le z-stack soustrait, trouver la tranche moyenne et le seuil sur les mitochondries: image → Ajuster → Seuil et cliquez sur Appliquer dans la fenêtre de seuil. Appliquer à toutes les tranches de la pile. Cochez la case Définir des pixels de fond à NaN. </li><li> Créer le rapport z pile: Processus → Calculatrice de l&#39;image Diviser la pile réduite par le z pile oxydé pour l&#39;analyse mito-roGFP1. Diviser la nm image de 560 (ATP bound) par les 510 nm d&#39;image (ATP non liée) pour l&#39;analyse mitGO-ATeam2. </li><li> Dessinez un retour sur investissement autour de la zone d&#39;intérêt. Choisissez Analyser → Outils → ROI Manager et cliquez sur Ajouter pour enregistrer le retour sur investissement. Plusieurs régions peuvent être stockés dans le gestionnaire. Dans ROI gestionnaire, sélectionnez toutes les ROI, puis choisissez Mminerai → Multi-mesures pour mesurer toutes les tranches de la pile. Exporter des données vers un tableur pour analyse. </li></ol> 5.2 Analyse des Volocity <ol><li> Importer des images dans une bibliothèque de Volocity et créer une séquence d&#39;images avec deux canaux. </li><li> Dessiner une région d&#39;intérêt (ROI) dans une zone où il n&#39;y a pas de cellules. Choisissez Outils → Ratio. </li><li> Utilisez Volocity pour calculer le fond: Recevez De retour sur investissement. </li><li> Réglez le seuil d&#39;inclure structures mitochondriales. </li><li> Cochez l&#39;option d&#39;appliquer une LUT arc en ciel sur le canal de ratio. Le canal à modulation d&#39;intensité peut produire une image moins bruyant pour présentation, mais il ne doit pas être utilisé pour la quantification de ratio moyen. </li><li> Sélectionnez l&#39;onglet mesure, sélectionnez le canal de rapport et d&#39;en tirer un retour sur investissement autour de la zone d&#39;intérêt. Mesurer le canal de rapport, à l&#39;exception des valeurs nulles. Plusieurs régions peuvent être choisies et doséesdans le même temps. Exporter des données vers un tableur pour analyse. </li></ol>

<ol>
	<li>Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+sensors+and+regulators+of+calcium+signalling.">Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+during+inheritance+is+associated+with+lifespan+and+mother-daughter+age+asymmetry+in+budding+yeast.">Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast.</a> Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).</li><li>Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+oxidative+damage+to+DNA+increase+with+age.">Does oxidative damage to DNA increase with age.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).</li><li>Cadenas, E., Davies, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+free+radical+generation,+oxidative+stress,+and+aging.">Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 29 (3-4), 222 (2000).</li><li>Mammucari, C., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+mitochondrial+dysfunction+and+aging.">Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131 (7-8), 536-543 (2010).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Schon, E. A., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+the+next+(neurode)generation.">Mitochondria: the next (neurode)generation.</a> Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).</li><li>Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -. K., Hirst, J., Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+glutathionylation+of+complex+I+increases+mitochondrial+superoxide+formation.">Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19603-19610 (2003).</li><li>Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaredoxin+2+catalyzes+the+reversible+oxidation+and+glutathionylation+of+mitochondrial+membrane+thiol+proteins:+implications+for+mitochondrial+redox+regulation+and+antioxidant+defense.">Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (46), 47939-47951 (2004).</li><li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Krebs+cycle+enzymes+by+hydrogen+peroxide:+A+key+role+of+[alpha]-ketoglutarate+dehydrogenase+in+limiting+NADH+production+under+oxidative+stress.">Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (24), 8972-899 (2000).</li><li>Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mitochondrial+function+by+hydrogen+peroxide.">Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (26), 23357-23361 (2001).</li><li>Gardner, P. R., Fridovich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+glutathione+on+aconitase+in+Escherichia+coli.">Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 301 (1), 98-102 (1993).</li><li>Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+radical+and+iron+modulate+aconitase+activity+in+mammalian+cells.">Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (22), 13399-13405 (1995).</li><li>Schafer, F., Buettner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+environment+of+the+cell+as+viewed+through+the+redox+state+of+the+glutathione+disulfide/glutathione+couple.">Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (11), 1191-1212 (2001).</li><li>Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+monitoring+of+ATP+levels+in+living+insulin+secreting+cells+expressing+cytosolic+firefly+luciferase.">Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase.</a> FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).</li><li>Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP+synthesis+in+permeabilized+cells:+Assessment+of+the+ATP/O+values+in+situ.">Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ.</a> Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).</li><li>Strehler, B. L., Totter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luminescence+in+the+study+of+energy+transfer+mechanism+in+substrates+and+enzymes+determinations.">Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations.</a> Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).</li><li>Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphate:+Continuous+measurement+in+mitochondrial+suspension+by+firefly+luciferase+luminescence.">Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).</li><li>Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+measuring+ATP+formation+in+rat+muscle+mitochondria.">A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).</li><li>Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A., Pon, L. A., Schon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+Mitochondrial+ATP+Synthesis+in+Animal+Cells.">Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells.</a> Methods in Cell Biology, Mitochondria. 65, 133-145 (2001).</li><li>DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase.">Firefly luciferase.</a> Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).</li><li>Atamna, H., Frey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitochondrial+dysfunction+and+energy+deficiency+in+Alzheimer's+disease.">Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease.</a> Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).</li><li>Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li><li>Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Schwarzl&#228;nder, M., Fricker, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+of+glutathione+redox+potential+in+living+plant+cells.">Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells.</a> Journal of Microscopy. 231 (2), 299-316 (2008).</li><li>Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++regulation+of+mitochondrial+ATP+synthesis+visualized+at+the+single+cell+level.">Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level.</a> ACS Chem Biol. 6 (7), 709-715 (2011).</li><li>Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+of+ATP:ADP+Ratio.">A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio.</a> Nature Methods. 6 (2), 161-166 (2009).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science (New York, N.Y.). 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Dairaku, N., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomycin+and+antimycin+A+prevent+nitric+oxide-induced+apoptosis+by+blocking+cytochrome+c+leakage.">Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage.</a> J. Lab. Clin. Med. 143 (3), 141-153 (2004).</li><li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-engineering+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+for+improved+response+rate.">Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate.</a> Protein Sci. , 45-57 (2006).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Ici, nous décrivons les méthodes à utiliser mito-roGFP1 et mitGO-ATeam2 comme biocapteurs pour évaluer l&#39;état redox mitochondrial et les niveaux d&#39;ATP dans les cellules de levure vivante. Nous constatons que l&#39;expression du plasmide d&#39;origine mito-roGFP1 ou mitGO-ATeam résultats dans le ciblage quantitatif aux mitochondries, sans aucun effet évident sur ​​la morphologie ou la distribution mitochondrial ou sur les taux de croissance cellulaire. 3 Mito-roGFP1 peut détecter des change...

Les mitochondries sont des organites essentiels pour la production d&#39;ATP, la biosynthèse des acides aminés, des acides gras, l&#39;hème, clusters fer-soufre et pyrimidines. Les mitochondries jouent également un rôle essentiel dans l&#39;homéostasie du calcium, et dans la régulation de l&#39;apoptose. 1 en plus de preuves des liens mitochondries au vieillissement et aux maladies liées au vieillissement, y compris la maladie de Parkinson, la maladie d&#39;Alzheimer, la sclérose latérale amyotrophique et la maladie de Huntington. 2 Bien que les individus vivent leur vie entière avec des mutations dans des protéines mitochondriales qui sont associés à des maladies neurodégénératives, les symptômes de la maladie se produisent seulement plus tard dans la vie. Cela indique que les changements se produisent dans les mitochondries avec l&#39;âge qui permet maladie pathologie à émerger. En effet, fitness mitochondrial est corrélée à la santé globale de la cellule et la durée de vie de la levure et des cellules de mammifères 3,4 Ici., Nous décrivons comment utiliser biocapteurs fluorescents génétiquement codés, ratiométriques d&#39;évaluer deux caractéristiques essentielles de Mitochondria dans les cellules de levure vivantes: état redox et les niveaux d&#39;ATP. La fonction mitochondriale dans la mobilisation de l&#39;énergie aérobie est bien établie. L&#39;état d&#39;oxydo-réduction des mitochondries est un produit de réduction et d&#39;oxydation des espèces dans l&#39;organite, comprenant du NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, le glutathion / glutathion disulfure (GSH / GSSG) et les espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS). Découplage mitochondries ou hypoxie affecte l&#39;activité respiratoire mitochondriale et modifie le rapport de NAD + en NADH dans l&#39;organite. ROS, qui sont produits à partir de transfert d&#39;électrons inefficace entre les complexes de la chaîne de transport des électrons dans la membrane mitochondriale interne, ainsi que de la désamination des amines par la monoamine oxydase dans la membrane mitochondriale externe 5, les lipides des dommages, des protéines et des acides nucléiques et avoir été lié au vieillissement et les maladies neurodégénératives liées à l&#39;âge 6,7,8. ROS jouent également un rôle dans la transduction du signal en mitochondria, par oxydation du GSH. Par exemple, le NADH déshydrogénase contribue non seulement à la production de ROS, mais aussi est régulée par des interactions avec la piscine glutathion 9,10. déshydrogénase α-cétoglutarate et aconitase, les composantes du cycle de Krebs, présentent une activité réduite en environnements oxydants 11,12. En effet, la régulation redox dépendant de l&#39;activité aconitase est conservée, des bactéries aux mammifères 13,14. Ainsi, la surveillance de l&#39;état redox et les niveaux d&#39;ATP des mitochondries est cruciale pour comprendre leur fonction et leur rôle dans la pathologie de la maladie. Méthodes biochimiques ont été utilisés pour évaluer l&#39;état d&#39;oxydoréduction ou les niveaux d&#39;ATP des cellules entières ou des mitochondries isolées. Méthodes largement utilisée pour évaluer l&#39;état redox des cellules entières ou des mitochondries isolées sont basés sur la mesure des niveaux de la paire redox GSH / GSSG 15. Le système luciférine-luciférase est couramment utilisé pour mesurer mitochondrialLes niveaux d&#39;ATP dans les deux cellules entières perméabilisées ou les mitochondries isolées. 16,17,18,19,20 Dans cet essai, la luciférase se lie à l&#39;ATP et catalyse l&#39;oxydation de chimiluminescence et de luciférine. 21 L&#39;intensité de la lumière émise est proportionnelle à la quantité de l&#39;ATP dans le milieu réactionnel. 22 Ces méthodes ont révélé des informations fondamentales sur la fonction mitochondriale, y compris la constatation que les patients atteints de maladies neurodégénératives telles que la maladie d&#39;Alzheimer, ont des niveaux anormalement bas d&#39;ATP. 23 Toutefois, ils ne peuvent être utilisés à l&#39;image vivants, des cellules intactes. En outre, les méthodes basées sur l&#39;analyse de cellules entières fournissent une moyenne de l&#39;état d&#39;oxydoréduction ou les niveaux d&#39;ATP dans tous les compartiments de la cellule. Mesures en organites isolés sont potentiellement problématique car l&#39;état redox mitochondrial ou les niveaux d&#39;ATP peuvent changer au cours du fractionnement subcellulaire. Enfin, des études récentes de notre laboratoire et d&#39;autres indiquent quemitochondries dans les cellules individuelles sont hétérogènes en fonction, ce qui influe sur la durée de vie des cellules de la mère et la fille. 3 Ainsi, il est nécessaire de mesurer les niveaux d&#39;ATP mitochondriale et de l&#39;état d&#39;oxydo-réduction dans les cellules vivantes avec une résolution subcellulaire. Les biocapteurs pour la fonction mitochondriale décrites ici sont toutes deux basées sur la GFP. GFP redox sensible (roGFP) 24,25 est un variant de la GFP dans lequel cystéines exposées à la surface sont ajoutés à la molécule. roGFP, comme GFP de type sauvage, présente deux pics d&#39;excitation (à ~ 400 nm et ~ 480 nm) et une pointe d&#39;émission à ~ 510 nm. L&#39;oxydation des résidus cystéine dans les résultats roGFP par une augmentation de l&#39;excitation à ~ 400 nm. La réduction de ces cystéines favorise excitation à ~ 480 nm. Ainsi, le rapport entre l&#39;émission de 510 nm lors d&#39;une excitation de roGFP à 480 nm et 400 nm révèle la quantité relative de roGFP réduite et oxydée, qui reflète l&#39;état d&#39;oxydo-réduction de l&#39;environnement du fluorophore. Deux versions de roGFP sont largement utilisés: roGFP1 et roGFP2. Les deux contiennent les mêmes insertions de cystéine. roGFP1 sont basées sur le GFP de type sauvage et roGFP2 est basée sur S65T GFP, qui a une excitation efficace à 480 nm et inférieure d&#39;excitation efficace à 400 nm par rapport à wtGFP 24. roGFP1 est moins sensible au pH que roGFP2 et sa gamme dynamique s&#39;étend plus loin dans la plage réduite. Ainsi, roGFP1 peut être plus utile pour surveiller les compartiments plus réducteurs tels que les mitochondries ou le cytosol, et des compartiments dont le pH est variable, comme les endosomes. roGFP2 propose signaux lumineux et, dans certaines études, une gamme dynamique supérieure à roGFP1 24,26. Des études chez Arabidopsis thaliana indiquent que le temps nécessaire pour une réponse à des changements dans l&#39;état d&#39;oxydo-réduction est similaire pour les deux capteurs (t ½ pour l&#39;oxydation, 65 et 95 secondes et t ½ de la réduction, 272 et 206 secondes, par roGFP1 et roGFP2, respectivement) 26. MitGO-ATeam2 est un mini-invasive, fiablecapteur qui mesure ATP mitochondrial chez la levure Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam est un transfert d&#39;énergie par résonance de Förster (FRET) de la sonde qui se compose de la sous-unité ε du F o F 1-ATP synthase en sandwich entre donneur de FRET et protéines fluorescentes accepteurs (GFP et orange fluorescent protein (OFP), respectivement). 27 La liaison de l&#39;ATP de la ε résultats des sous-unités dans des changements conformationnels de la protéine qui apportent le FRET donneur à proximité immédiate de l&#39;accepteur et pour permettre un transfert d&#39;énergie du donneur à l&#39;accepteur. Il existe deux variantes de GO-ATeam, GO-GO-ATeam1 et ATeam2. GO-ATeam2 a une plus grande affinité pour MgATP que GO-ATeam1, le rendant plus adapté pour mesurer le typiquement inférieure [ATP] dans les mitochondries par rapport au cytosol. 27 Afin de sonder l&#39;état redox mitochondrial, nous avons construit une protéine de fusion (mito-roGFP1) composé de roGFP1 fusionnée à la séquence leader ATP9 unend exprimé à partir d&#39;une expression de levure centromere basé (faible nombre de copies) plasmide sous le contrôle de la forte glycéraldéhyde-3-phosphate (GPD) promoteur (p416GPD, Addgene). Nous avons utilisé roGFP1 pour sonder l&#39;état d&#39;oxydo-réduction des mitochondries dans le contexte de vieillissement du modèle champignon Saccharomyces cerevisiae. Nous constatons que roGFP1 peut détecter des changements dans l&#39;état redox mitochondrial qui se produisent au cours du vieillissement et en réponse à la disponibilité des nutriments mais n&#39;a aucun effet néfaste apparent sur des cellules de levure. Nous voyons aussi une variabilité dans l&#39;état redox des mitochondries dans les cellules de levure de vie individuels, une constatation qui souligne l&#39;importance d&#39;un biocapteur avec une résolution spatiale subcellulaire. MitGO-ATeam2 est une variante du GO-ATeam2, qui a la séquence signal mitochondrial du cytochrome c oxydase sous-unité VIII inséré à l&#39;extrémité amino-terminale de GO-ATeam2 27. Nous avons modifié la sonde mitGO-ATeam2 (aimablement fourni par le laboratoire de H. Noji, Institut of recherche scientifique et industrielle, Université d&#39;Osaka, Japon) pour une utilisation dans la levure par sous-clonage, via les sites HindIII Xba1 et, dans le vecteur d&#39;expression de levure pAG415GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, USA), qui est un faible nombre de copies de plasmide contenant le promoteur constitutif fort GPD. Nous avons exprimé mitGO-ATeam2 dans la levure bourgeonnante, et de trouver, par la contre avec la liaison à l&#39;ADN colorant DAPI, qu&#39;il localise exclusivement vers les mitochondries, où il sert comme une sonde efficace pour mesurer les changements physiologiques dans les niveaux d&#39;ATP mitochondrial. roGFP et GO-ATeam sont à la fois codées génétiquement. En conséquence, ils peuvent être introduits et maintenus de façon stable dans des cellules intactes, et fournissent des informations sur l&#39;état d&#39;oxydoréduction ou ATP dans les cellules vivantes, individuels. En outre, les deux biocapteurs surveiller les changements dans l&#39;état d&#39;oxydoréduction ou les niveaux d&#39;ATP qui se produisent dans des conditions physiologiques. 28 Les deux sondes sont également quotientométrique. En conséquence, les mesures faites avec ces sondes ne sont pas affectés par changes de concentration biocapteur ou un éclairage ou une épaisseur échantillon. Enfin, les deux biocapteurs offrent une résolution spatiale subcellulaire. En effet, roGFP a été ciblé à la mitochondrie, ER, les endosomes et les peroxysomes 24, et peut détecter des changements dans l&#39;état redox de chacun de ces organites, largement indépendantes du pH.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>1397-94-0</td>
			<td>Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. 
			 
			Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glycerol 
			0.05% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valap</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 &deg;C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: 
			Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment and Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides</td>
			<td>Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)</td>
			<td>3050</td>
			<td>Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY)</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td>These are less variable in thickness (170&plusmn;5 &mu;m) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td>
			<td>12-545E</td>
			<td>Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 &mu;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective</td>
			<td>Nikon (Melville, NY)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 3D Image Analysis software</td>
			<td>Perkin Elmer (Waltham, MA)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health (Bethesda, MD)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ratiometric biosensors that measure mitochondrial redox state and atp in living yeast cells

Les mitochondries jouent un rôle dans de nombreux processus cellulaires, du métabolisme énergétique et l&#39;homéostasie du calcium au contrôle de la durée de vie cellulaire et la mort cellulaire programmée. Ces processus affectent et sont affectés par l&#39;état redox et la production d&#39;ATP par les mitochondries. Ici, nous décrivons l&#39;utilisation de deux ratiométriques, biocapteurs génétiquement codés qui peuvent détecter l&#39;état redox mitochondrial et les niveaux d&#39;ATP à une résolution subcellulaire dans les cellules de levure vivante. État redox mitochondrial est mesurée à l&#39;aide Green Fluorescent Protein redox-sensibles (roGFP) qui est destiné à la matrice mitochondriale. Mito-roGFP contient résidus cystéine en positions 147 et 204 de la GFP, qui subissent une oxydation et une réduction réversible et dépendant de l&#39;environnement, qui à son tour modifie le spectre d&#39;excitation de la protéine. MitGO-ATeam est un transfert d&#39;énergie par résonance de Förster (FRET) de la sonde, dans lequel la sous-unité de l&#39;ε o F F 1-ATP synthase est prise en sandwich entre donneur et l&#39;accepteur FRET fluoprotéines centes. La liaison de l&#39;ATP de la ε résultats des sous-unités dans des changements de conformation de la protéine qui apportent le donneur et l&#39;accepteur de FRET à proximité immédiate et de permettre un transfert d&#39;énergie de fluorescence par résonance à partir du donneur à l&#39;accepteur.

Mesurer l&#39;état redox mitochondrial avec mito-roGFP Ici, nous montrons que mito-roGFP1 a la plage dynamique pour détecter des changements dans l&#39;état redox mitochondrial totalement oxydé à réduit dans les cellules de levure vivante, sans affecter la croissance des cellules de levure ou de la morphologie mitochondriale. Tout d&#39;abord, nous trouvons les cellules exprimant la GFP mitochondries ciblée et roGFP1 croître à des taux normaux (figure 1A). Le taux de c...

Watch this Scientific Journal Video about Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells at JoVE.com

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Nous décrivons l&#39;utilisation de deux ratiométriques, biocapteurs génétiquement codés, qui sont fondés sur la GFP, pour surveiller l&#39;état redox mitochondrial et les niveaux d&#39;ATP à une résolution subcellulaire dans les cellules de levure vivantes.

Biosensors Ratiométrique qui mesurent l&#39;état redox mitochondrial et de l&#39;ATP dans les cellules vivantes de levure

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

ratiometric-biosensors-that-measure-mitochondrial-redox-state-atp

Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.9K vues.  Columbia University. Nous décrivons l'utilisation de deux ratiométriques, biocapteurs génétiquement codés, qui sont fondés sur la GFP, pour surveiller l'état redox mitochondrial et les niveaux d'ATP à une résolution subcellulaire dans les cellules de levure vivantes.

Vidéo: Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

La fabrication des électrochimique de l&#39;ADN des Biocapteurs pour la détection sans réactif d&#39;acides nucléiques, protéines et petites molécules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Recherche

Bio-ingénierie

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

Imagerie de vie de fluorescence des rotors moléculaires dans les cellules vivantes

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular functions and events1, 2. Their spatiotemporally dynamic nature has been revealed by visualization of their activity and localization in real time3. In order to gain deeper understanding of their roles in diverse cellular functions at the molecular level, the next step should be perturbation of protein activities at a precise subcellular location and timing. 
To achieve this goal, we have developed a method for light-induced, spatio-temporally controlled activation of small GTPases by combining two techniques: (1) rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and (2) a photo-caging method of rapamycin. With the use of rapamycin-mediated FKBP-FRB heterodimerization, we have developed a method for rapidly inducible activation or inactivation of small GTPases including Rac4, Cdc424, RhoA4 and Ras5, in which rapamycin induces translocation of FKBP-fused GTPases, or their activators, to the plasma membrane where FRB is anchored. For coupling with this heterodimerization system, we have also developed a photo-caging system of rapamycin analogs. A photo-caged compound is a small molecule whose activity is suppressed with a photocleavable protecting group known as a caging group. To suppress heterodimerization activity completely, we designed a caged rapamycin that is tethered to a macromolecule such that the resulting large complex cannot cross the plasma membrane, leading to virtually no background activity as a chemical dimerizer inside cells6. Figure 1 illustrates a scheme of our system. With the combination of these two systems, we locally recruited a Rac activator to the plasma membrane on a timescale of seconds and achieved light-induced Rac activation at the subcellular level6.

A method for spatio-temporal control of small GTPase activity by light is described. This method is based on rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and photo-caging systems. Optimization of light-irradiation enables the spatio-temporally controlled activation of small GTPases at the subcellular level.

Spatio-temporelle de manipulation de l&#39;activité GTPase Petit au niveau subcellulaire et sur des échelles de secondes dans les cellules vivantes

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

MICRO-creux à base de capteur pour multiplexée transdermique Sensing électrochimique

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Détection optique de<em&gt; E. coli</em&gt; Bactérie par mésoporeux Silicon biocapteurs

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Contrôle optique des cellules vivantes activité électrique par conjugués polymères

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Un protocole pour l&#39;utilisation Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force biocapteurs pour mesurer les forces mécaniques à travers le complexe nucléaire LINC

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

Utilisation de la biologie synthétique à l&#39;ingénieur cellules vivantes Interface avec les matériaux programmables

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Mesure de la dynamique des protéines sensibles à la Force dans les cellules vivantes à l’aide d’une combinaison de Techniques Fluorescent

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...