이 작품은 HHMI 56,006,760에서 (GM45735, JDV, DMAW에 국립 보건원 (NIH) (2 TL1 RR 24158-6)와 엘리슨 의료 재단 (AG-SS-2465)와 NIH에서 수상에 의해 지원되었다 GM45735S1 및 GM096445) LP합니다. GM45735S1는 미국의 복구 및 2009 년 재투자 법 아래에있는 NIH에서 발행되었다. 이 연구에 사용 된 현미경은 NIH / NCI 부여 (5 P30 CA13696)를 통해 부분적으로 지원되었다.

1. 바이오 센서와 효모 세포의 변화 <ol><li> 리튬 아세테이트 방법 27을 사용하여 플라스미드 베어링 미토 roGFP 또는 mitGO-ATeam2하여 원하는 효모 균주를 변환 할 수 있습니다. </li><li> 플라스미드 매개 바이오 센서와 변환을 확인하고 플라스미드의 손실을 방지하기 위해 선택하고 적절한 선택적 합성 완전 배지 (미토 roGFP을위한 SC-우라, 또는 mitGo-ATeam2을위한 SC-레우)에 형질 전환을 유지한다. 형광 프로브가 여기에서 설명한 것보다 다른 플라스미드에 클로닝 된 경우, 적절한 선택 배지를 사용합니다. 그들은 형광 바이오 센서를 표현할 수 있는지 확인하고 정상 미토콘드리아 형태를 전시하는 형광 현미경에 의해 형질 전환을 시각화. </li></ol> 2. 이미징을위한 세포 및 준비의 성장 세포의 기능 및 약물 치료에 대한 반응은 세포 밀도와 대사 활동에 크게 의존하고 있습니다. 최상의 결과를 얻을 때 세포적극적으로 (- 1 × 10 7 세포 / ML 중반 로그 단계 ~ 0.5) 분할됩니다. 일관된 밀도의 중간 로그 상 문화를 생성하는 가장 신뢰할 수있는 방법은 고정 된 상 사전 문화에서 접종하는 것입니다. <ol><li> 정지 상 사전 문화를 준비 접시에서 변형 세포의 단일 식민지를 선택하고 선택 리퀴드 미디어 (50 ML 원뿔 바닥 튜브 5 mL를) 접종. 600 nm의 (OD 600)에서 문화의 광학 밀도가 고원 (24-48 시간)를 도달 할 때까지 225 rpm으로 진탕 30 ° C에서 성장. </li><li> 관찰 중반 로그 단계 문화를 준비 50 ML 원뿔 바닥 튜브 선택 배지 5 mL를 접종 사전 문화의 적절한 볼륨을 사용합니다. YPD 미디어 autofluorescent이며, 이러한 연구에 사용할 수 없습니다. 합성 전체 포도당을 기준 드롭 아웃 (SC-우라) 용지를 사용하십시오. 그들은 중반 로그 단계 (- 1 × 10 7 세포 / ㎖ ~ 0.5)에 도달 할 때까지, 4-16 시간 동안 225 rpm으로 흔들어, 30 ° C에서 세포를 성장. 세포 밀도를 결정할 수 있습니다OD 600을 측정하여, 정확한 OD 600 독서를 결정하는 분광 광도계를 보정합니다. 우리 베크 DU530 (IN Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날, 인디애나 폴리스, 인디애나)에서 중반 로그 단계는 0.1-0.3의 OD 600에 해당합니다. </li></ol> 미토 roGFP1 신진 대사 변화에 대응 소기관의 감각 변동. 예를 들어,이 분석 미토콘드리아의 산화 환원 상태 변경 효모 발효 탄소 소스 (예를 들어 포도당, SC 매체에서와 같이) 대 비 발효 탄소 소스 (예 : 글리세롤과 같은 SGlyc 미디어)에서 자랄 때, 심지어 같은 다른 일괄 미디어. 따라서 모든 실험에 대한 미디어의 동일한 배치를 사용합니다. <ol start="3"><li> 아무 처리를 수행중인 경우 세포 농도 준비 (단계 2.4 참조) 영상입니다. 세포가 치료되는 경우, 적절한 치료와 세포를 배양하고 다음 단계를 계속합니다. </li><li> 15 초 동안 6,000 XG에서 원심 분리하여 배양 1 ㎖를 집중하고미디어 20 μL의 세포 펠렛의 부유. 이러한 조건은 시야에서 구별 세포의 수를 극대화 할 수 있습니다. </li><li> 슬라이드에 재 부유 세포의 2 μL를 적용합니다. coverslip을 (제 1.5, 바람직 고성능 170 ± 5 μm의 두께)와 커버, 명확한 매니큐어 또는 valap (시약 참조) coverslip에의 가장자리를 밀봉하십시오. valap로 밀봉하는, 커버 슬립의 가장자리를 따라 작은 금액을 확산 후, 분젠 버너 불꽃을 통해 그것을 잡고 금속 주걱에 소량 용해. </li><li> 이미징 동안 30 ° C에서 세포를 유지합니다. 영상에 사용 된 100X 기름 침지 렌즈 객관적인 히터이 응용 프로그램에 적합합니다. 이러한 조건에서, 미토콘드리아 형태, 산화 환원 상태와 ATP 수준은 10-15 분 영상 중에 변경되지 않습니다. </li></ol> 3. 이미지 설정 <ol><li> 넓은 필드 형광 현미경 이미지 미토 roGFP1에 대한 설정 여기 단계는 AxioObse에 맞는rver.Z1 현미경 콜리 LED 여기 소스, 넓은 필드 오르카 ER 카메라와 Axiovision 수집 소프트웨어를 탑재. 미토 roGFP1 산화의 두 채널과 광 변환의 photobleaching에하는 수은 아크 램프 조명 (아래)에 비해 LED 조명을 사용하여 현저하게 줄어 듭니다. 신호 해상도를 극대화하기 위해, 목적에 가장 높은 수치 조리개, 충분한 공간 해상도를 제공하는 가장 낮은 배율을 사용합니다. 또한, 미토 roGFP 이미징, 목표는 365 nm에서 잘 전송되는지 확인합니다. 100x/1.3NA EC PlanNeofluar 목적 (혈구)이 응용 프로그램에 적합합니다. 산화와 감소 미토 roGFP1 종을 캡처 수집 소프트웨어를 구성합니다. 우리는 다음과 같은 조건을 사용합니다. <ol><li> 포함 excitatio으로, 미토 roGFP 그런 그가 (혈구) 집합을 필터링 38로 365 nm의 (100 % 전원 LED)와 GFP에 적합한 배출 필터에 여기를 사용하는 산화에 대한 채널을 구성N 필터는 큐브에서 제거됩니다. 여기 필터 제거함으로써 달성 시간 해상도를 증가 필터를 전환 할 필요없이 365 nm의 470 nm의 모두에서 구동 할 수 있습니다. </li><li> 위에서 언급 한 바와 같이 470 nm의 (100 % 전원 LED)에 여기를 사용하는 감소 미토 roGFP의 채널을 구성, 동일한 방출 필터 큐브 산화 미토 roGFP에 사용됩니다. 공간 해상도를 최적화하기 위해 1X1 비닝 (binning) 카메라를 설정합니다. </li><li> 각 Z 위치에서 채널을 모두 수집, 0.5 μm의 간격이 11 조각으로 구성된 AZ 스택을 확보하기 위해 소프트웨어를 설정합니다. 취득이 모드는 차례로 각각의 Z 스택을 인수보다 느리지 만, 산화와 감소 채널의 취득과 미토콘드리아의 움직임에서 발생하는 아티팩트를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 이미지를 여러 세포는 강한하지만 포화 신호를 생성, 적절한 노출 시간을 결정합니다. 그것은 모든 실험 산화 미토 roGFP1 감소에 대한 노출 시간의 비율을 유지하는 것이 중요합니다의. 예를 들어,에 대한 노출 시간은 산화 미토 roGFP1 미토 - roGFP1 산화에 대한 노출 시간 후, 각각 300 및 100 밀리 초이다 줄어들 경우 3 번해야하는 모든 실험 미토 roGFP 감소합니다. </li></ol></li><li> 스펙트럼 공 촛점 현미경 이미징 mitGO-ATeam2에 대한 설정 mitGO-ATeam2, GFP (방출 최대 510 nm의)에서 형광을 사용하여 ATP 수준을 정량화하는 OFP (배출 최대 560 nm의)에서 해당 구별해야합니다. 이러한 형광 물질에서 방출되는 형광을 해결 형광 필터 세트가 있습니다. 그러나, 우리는 공 촛점 현미경 스캐닝 많은 레이저에서 사용할 수있는 스펙트럼 검출기,이 응용 프로그램에 가장 적합한 것을 찾을 수 있습니다. 스펙트럼 검출기는 파장에 따라 많은 구성 요소 (일반적으로 32 또는 그 이상)로 형광 방출을 분리합니다. 인접한 여러 파장 대역은 하나의 이미지 채널로 결합 할 수 있습니다. 결합되는 파장은 경험적으로 그렇게 G에서 신호를 최대화하기 위해로 선택혼동 할 신호의 크로스 오버를 피하면서 FP와 OFP는 측정을 무서워. 가장 높은 수치 조리개 렌즈를 사용합니다. 우리는 100x/1.49 또는 60x/1.49 아포 TIRF 렌즈를 사용합니다. 우리는 NIS 요소 소프트웨어를 실행하는 니콘의 A1R 공 촛점 현미경을 사용합니다. ATP 바인딩 및 ATP-언 바운드 mitGO-ATeam2 종을 캡처 수집 소프트웨어를 구성합니다. 우리는 다음과 같은 조건을 사용합니다. <ol><li> 우리의 시스템에 대한 0.42 ㎛의 애리조나 해상도에 해당하는 1.0 에어리 단위 (AU)로 핀홀을 설정합니다. </li><li> 이미지의 공간 정보를 극대화 할 나이 퀴 스트 (Nyquist) 샘플링 제한을 접근하는 스캔 줌을 설정합니다. 우리의 시스템에 픽셀 크기는 0.12 μm의 수 있습니다. </li><li> 미토콘드리아 이미징 동안 이동할 수 있기 때문에, 512 X 256 픽셀로 필드를 잘라내어 이미지의 속도를 증가 도움이 될 수 있습니다. 우리의 시스템 이미지를 한 프레임에 필요한 총 시간은 2 배 검사 평균을 포함, 1.0 초입니다. 원하는 공간 해상도에 따라 필드가 더 increas에 잘릴 수 있습니다전자 시간 해상도를. </li><li> 488 nm에서 흥분, 500의 방출을 수집 - GFP에 대한 520 nm의 550에서 - OFP 580 nm의. 실제 최적의 값은 이미징 시스템의 특성에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 우리의 시스템에 대한 최적의 레이저 파워는 6.0과 6.4 % 사이입니다. 최적의 레이저 전력이 각 현미경 시스템에 따라 다를 것입니다,하지만 여전히 해석 이미지를 생성 이상적으로 최대한 낮아야합니다. 모든 광학 시스템 시간이 지남에 일반적으로 발생하는 레이저 출력의 변화를 모니터링하기 위해 내부 또는 외부 전원 측정기를 사용합니다. </li><li> 픽셀 값의 감지 범위를 최대화하지만, 가능한 한 많은 세포와 같은 위해, 포화에게 신호를 방지하기 위해 검출기 이득 및 조명 빛의 강도를 조정합니다. 1 % 이상 포화 픽셀을 포함하는 모든 세포를 분석하지 않습니다. 같은 목표, 레이저 출력, 스캔 줌, 픽셀 크기, 게인 및 오프셋을 사용하여 이미지를 모든 샘플. </li></ol></li></ol> 4. 이미지 수집 <ol><li> 초점 괞 찮아를 찾습니다<html> 형광 프로브를 표백 최소화하기 위해 전송 된 빛을 사용하여 그 세포의 북동쪽. </li><li> 그 하나 이상의 셀을 찾은 후, 0.5 ㎛의 스텝 크기를 사용하여 일반적인 세​​포 (약 7 μm의)의 전체 깊이를 통해 Z 시리즈를 수집합니다. </li><li> 이미지를 다른 슬라이드에 관심 세포하지만, 이미지를 15 분 이상에 대한 하나의 슬라이드를하지 않습니다. 슬라이드에 15 분 후, 세포 생존 능력을 잃게됩니다. </li></ol> 5. 분석 미토콘드리아의 ATP 수준은 510 nm에서 그 560 nm에서 mitGO-ATeam2 방출의 비율을 측정하여 결정되는 27 소기관의 산화 환원 상태 미토 roGFP의 (R / O) 산화 비율로 감소로 측정된다. 즉 365 nm의 여기에 따라 510 nm에서 방출로 나눈 470 nm의 여기에 따라 510 nm에서 방출. 비율을 계산하기 전에, 우리는 배경을 빼고 형광 미토콘드리아에 속하는 픽셀 임계 값을 결정합니다. 십t &quot;&gt; 퍼블릭 도메인 (예를 들어 ImageJ에 30) 또는 소프트웨어 미토 roGFP1 또는 mitGO-ATeam2 분석. 이미지 수집을 위해 사용되는 소프트웨어에 따라서는 분석을 위해 사용될 수있다 (예를 들면 Volocity, 퍼킨 - 엘머) 시판 이미지 첫 번째 분석 소프트웨어를 열기 전에, 같은 TIFF와 같은 다른 형식으로 변환해야 할 수 있습니다. 이미지를 변환하는 경우, 픽셀 값을 변환하는 동안 변경되지 않습니다 있는지 확인하는 것이 필수적입니다. 미토 roGFP1 데이터를 분석하여 두 프로그램은 아래에 설명되어 있습니다. 각 메뉴에서 선택 프로그램 메뉴 및 옵션이 굵은 이탤릭체로 강조 표시됩니다. 5.1 ImageJ에 분석 <ol><li> 이미지 열기 및 변경 유형 32 비트 : 이미지 → 유형 → 32 비트. </li><li> 어떤 세포가없는 지역에 대한 관심 (ROI)의 영역을 그립니다. 이 투자 수익 (ROI)의 평균 농도를 계산 → 측정을 분석합니다. </li><li> 스택에서 계산 된 평균 배경 빼기 : 프로세스 → 수학 → 뺍니다. </li><li> 차감 Z-스택을 사용하여, 미토콘드리아의 중앙 조각과 임계 값을 찾습니다 이미지 → 조정 → 임계 값을 임계 값 창에서 적용을 클릭합니다. 스택의 모든 슬라이스에 적용됩니다. NaN으로 배경 픽셀로 설정하십시오. </li><li> 비율을 만들 Z 스택 : 프로세스 → 이미지 계산기 미토 roGFP1 분석을위한 산화 Z 스택에서 감소 스택을 나눈다. mitGO-ATeam2 분석 (ATP 언 바운드) 이미지 510 nm의에 의해 560 nm의 (ATP 바운드) 이미지를 나눕니다. </li><li> 그 주변 투자 수익 (ROI)을 그립니다. → 도구 → 투자 수익 (ROI) 관리자를 분석 선택하고 ROI를 기록하려면 추가를 클릭합니다. 여러 영역은 관리자에 저장할 수 있습니다. 투자 수익 (ROI) 관리자에서 모든 로아을 선택한 다음 M을 선택광석 → 모든 스택 슬라이스를 측정하는 멀티 측정. 분석을 위해 스프레드 시트로 데이터를 내보낼 수 있습니다. </li></ol> 5.2 Volocity 분석 <ol><li> Volocity 라이브러리에 이미지를 가져 오기 및 2 채널 이미지 시퀀스를 만들 수 있습니다. </li><li> 어떤 세포가없는 지역에 대한 관심 (ROI)의 영역을 그립니다. 선택 도구 → 비율. </li><li> ROI에서 가져 오기 : 배경을 계산하는 Volocity를 사용합니다. </li><li> 미토콘드리아 구조를 포함하도록 임계 값을 조정합니다. </li><li> 비 채널에 무지개 LUT를 적용 할 옵션을 선택합니다. 강도 변조 채널 프리젠 테이션 조작시에 적은 노이즈 이미지를 생성 할 수 있지만 평균 비율의 정량을 위해 사용해서는 안됩니다. </li><li> 측정 탭을 선택하고, 비율 채널을 선택하고 그 주변 투자 수익 (ROI)을 그립니다. 0 값은 제외 비율 채널을 측정한다. 여러 영역을 선택하고 측정 할 수있다동시에. 분석을 위해 스프레드 시트로 데이터를 내보낼 수 있습니다. </li></ol>

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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+of+glutathione+redox+potential+in+living+plant+cells.">Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells.</a> Journal of Microscopy. 231 (2), 299-316 (2008).</li><li>Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++regulation+of+mitochondrial+ATP+synthesis+visualized+at+the+single+cell+level.">Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level.</a> ACS Chem Biol. 6 (7), 709-715 (2011).</li><li>Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+of+ATP:ADP+Ratio.">A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio.</a> Nature Methods. 6 (2), 161-166 (2009).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science (New York, N.Y.). 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Dairaku, N., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomycin+and+antimycin+A+prevent+nitric+oxide-induced+apoptosis+by+blocking+cytochrome+c+leakage.">Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage.</a> J. Lab. Clin. Med. 143 (3), 141-153 (2004).</li><li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-engineering+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+for+improved+response+rate.">Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate.</a> Protein Sci. , 45-57 (2006).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기, 우리는 효모 세포를 생활에 미토콘드리아 산화 환원 상태와 ATP 수준을 평가하기 위해 바이오 센서로 미토 roGFP1 및 mitGO - ATeam2를 사용하는 방법을 설명합니다. 우리는 양적 미토콘드리아의 형태 또는 배포 또는 세포 성장 속도에 대한 명백한 효과없이, 미토콘드리아에 표적의 플라스미드 매개 미토 roGFP1 또는 mitGO-ATeam 결과의 표현을 찾을 수 있습니다. 3 미토 roGFP1 매우에서 미토콘드...

미토콘드리아는 아미노산, 지방산, 헴, 철, 황 클러스터 및 피리 미딘의 ATP 생산 생합성에 필수적인 세포 소기관이다. 미토콘드리아는 칼슘 항상성에 중요한 역할을하고, 세포 사멸 조절합니다. 파킨슨 병, 알츠하이머 병, 루게릭 병, 헌팅턴의 질병 등 노화 및 노화 관련 질병에 미토콘드리아 1 증가 증거 링크 2. 개인이 자신의 전체 삶을 살 수 있지만 퇴행성 신경 질환과 관련된 미토콘드리아 단백질에 돌연변이가 질병의 증상은 생활에서 나중에 발생합니다. 이것은 변경이 등장하는 병리 질환을 허용 연령 미토콘드리아에서 발생 나타냅니다. 사실, 미토콘드리아 피트니스은 전체 세포의 건강과 수명 효모와 포유 동물 세포와 연관되어 있습니다. 여기서 3,4, 우리는 mitoc의 두 가지 중요한 기능을 평가하기 위해 유전자 인코딩, 비례 형광 바이오 센서를 사용하는 방법에 대해 설명합니다효모 세포를 살아있는 hondria : 산화 환원 상태와 ATP 수준. 유산소 에너지 동원 미토콘드리아의 기능이 제대로 설정됩니다. 미토콘드리아의 산화 환원 상태는 NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, 글루타티온 / 글루타티온 아황산 (GSH / GSSG)와 활성 산소 종 (reactive oxygen species, ROS) 등 세포 기관에 종을 감소시키고 산화의 제품입니다. 미토콘드리아 또는 저산소증 연결을 풀기는 미토콘드리아의 호흡 활동에 영향을 미치는 NAD의 비율 + 세포 소기관에서 NADH로 변경합니다. 미토콘드리아 막에있는 전자 수송 사슬의 복합체뿐만 아니라, 아민의 탈 아미노 반응에서 외부 미토콘드리아 막에있는 모노 아민 산화 효소를 통해 5, 손상 지질, 단백질, 핵산 간의 비효율적 인 전자 전달에서 생산이됩니다 ROS, 6,7,8 노화 및 노화 관련 퇴행성 신경 질환에 연결되었습니다. ROS는 M의 신호 전달에 중요한 역할을itochondria, GSH의 산화를 통해. 예를 들어, NADH 탈수소 효소는 ROS 생산에 기여뿐 아니라 글루타티온 풀 9,10와의 상호 작용을 통해 조절된다. α-Ketoglutarate 탈수소 효소와 aconitase, TCA 사이클의 구성 요소는 환경에게 11,12 산화 감소 활동을 나타냅니다. 사실, aconitase 활동의 산화 환원에 의존 규제 박테리아 포유류 13,14에 보존됩니다. 따라서, 산화 환원 상태와 미토콘드리아의 ATP 수준을 모니터링하는 것은 질병 병리에서의 기능과 역할을 이해하는 데 매우 중요합니다. 생화학 적 방법은 산화 환원 상태 또는 전체 세포의 ATP 수준을 평가하는 데 사용 또는 미토콘드리아 고립되었다. 전체 세포 또는 산화 환원 상태를 평가하기 위해 널리 사용되는 방법은 미토콘드리아 격리는 산화 환원 쌍 GSH / GSSG 15의 수준을 측정하는 기준으로합니다. 루시페린 - 루시퍼 시스템은 일반적으로 미토콘드리아 측정하는 데 사용됩니다미토콘드리아 투과 전체 세포 또는 고립 된 하나의 ATP 수준. 16,17,18,19,20이 분석에서, 루시 페라 제는 양에 비례 ATP에 바인딩과의 산화 루시페린에서 발광을 촉진. 21 방출되는 빛의 강도 반응 혼합물에서 ATP. 22 이러한 방법은 알츠하이머 질환과 같은 퇴행성 신경 질환을 가진 환자는 비정상적으로 낮은 ATP 수준을 가지고 찾는 등의 미토콘드리아 기능에 대한 기본적인 정보를 공개했다. 23 그러나 그들은 이미지의 생활 그대로 셀에 사용할 수 없습니다. 또한, 전체 세포 분석에 근거한 방법은 산화 환원 상태 나 세포의 구획 ATP 수준의 평균을 제공합니다. 미토콘드리아의 산화 환원 상태 나 ATP 수준은 세포 내 분획 중 변경 될 수 있기 때문에 고립 된 세포 소기관의 측정은 잠재적 인 문제가 있습니다. 마지막으로, 우리의 실험실과 다른 사람들로부터 최근의 연구 나타냅니다 그각각의 세포 내 미토콘드리아는 다시 어머니와 딸 세포의 수명에 영향을 미치는 기능, 이기종입니다. 3 따라서, 세포 내 해상도로 살아있는 세포의 미토콘드리아 ATP 수준과 산화 환원 상태를 측정 할 필요가있다. 모두 GFP를 기반으로하는 미토콘드리아 기능에 대한 바이오 센서는 여기에 설명. 산화 환원에 민감한 GFP (roGFP) 24,25 표면 노출 시스테인이 분자에 추가되는 GFP의 변형입니다. roGFP는 야생 형 GFP와 같은 두 개의 여기 피크 (~ 400 nm의 ~ 480 nm의)와 ~ 510 nm에서 하나의 발광 피크가 있습니다. ~ 400 nm에서 여기에서 증가 roGFP 결과 시스테인의 산화. 그 시스테인의 감소는 ~ 480 nm의 여기를 하시 더군요. 따라서, 480 nm의 400 nm에서 roGFP의 흥분에 따라 510 nm의 방출의 비율은 형광 환경의 산화 환원 상태를 반영 감소 산화 roGFP의 상대적인 양을 보여준다. 두 적이roGFP의 이온이 널리 사용됩니다 roGFP1 및 roGFP2. 모두 동일한 시스테인 삽입이 포함되어 있습니다. roGFP1는 야생형 GFP 기반으로하고 roGFP2는 wtGFP 24에 비해 400 nm에서 480 nm의 효율성이 여기에서 더 효율적 여기가 S65T GFP를 기반으로합니다. roGFP1는 roGFP2 및 동적 범위가 축소 된 범위로 더욱 확장보다 민감한 작은 산도있다. 따라서, roGFP1 더 감소와 같은 미토콘드리아로 구획 또는 세포질, 그리고 엔도 등의 변수 산도와 구획을 모니터링에 더 유용 할 수 있습니다. roGFP2은 밝은 신호, 일부 연구에서, roGFP1 24,26보다 더 큰 동적 범위를 제공합니다. 애기 장대의 연구는 산화 환원 상태의 변화에 대응하는 데 필요한 시간은 두 센서 (t ½ 산화, 65, 95 초와 T ½ 각각 roGFP1 및 roGFP2 감면, 272 및 206 초, 분)에 대해 유사한 것을 나타냅니다. 26 MitGO-ATeam2은 최소로 침략적인, 믿을 수있다신진 효모 인 Saccharomyces cerevisiae의에 미토콘드리아 ATP를 측정하는 센서. GO-ATeam 기증자와 수용체 형광 단백질 (GFP와 오렌지 (OFP) 단백질의 형광, 각각) FRET F O 사이에 F 1-ATP 합성 효소의 ε 소단위로 구성된 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 프로브. 27 를 가지고있는 단백질의 구조적 변화 ε 소단위 결과로 ATP의 결합은 수용체에 근접 기증자를 무서워하고 기증자의 수용체에 에너지 전달을 허용합니다. GO-ATeam, GO-ATeam1과 GO-ATeam2의 두 가지 변형이 있습니다. GO-ATeam2은 일반적으로 낮은 미토콘드리아에서 세포질에 비해 [ATP]. 27를 측정하는 것이 더 적합하다, GO-ATeam1보다 MgATP에 대한 높은 친화력을 가지고 미토콘드리아의 산화 환원 상태를 조사하기 위해, 우리는 ATP9 리더 시퀀스 융합 roGFP1로 구성된 융합 단백질 (미토 roGFP1) 구축ND는 강한 글리 세르 알데히드 -3 - 인산 탈수소 효소 (GPD) 발기인 (p416GPD, Addgene)의 제어하에 플라스미드 중심체 기반 (낮은 사본 번호) 효모 식에 표현했다. 우리는 모델 곰팡이 사카 cerevisiae의 노화의 맥락에서 미토콘드리아의 산화 환원 상태를 조사하는 roGFP1를 사용했습니다. 우리는 roGFP1 노화 과정과 영양분 님의 질문에 답변 발생하지만, 효모 세포에 명백한 부정적인 영향을 미치지 않습니다 미토콘드리아의 산화 환원 상태의 변화를 감지 할 수있는 찾을 수 있습니다. 우리는 또한 개인 생활 효모 세포 내 미토콘드리아의 산화 환원 상태의 변화, 세포 내 공간 해상도를 가진 바이오 센서의 중요성을 강조 발견을 참조하십시오. MitGO-ATeam2은 GO-ATeam2의 아미노 말단에 삽입 시토크롬 C 산화 효소의 소단위 VIIIA의 미토콘드리아 신호 순서가 GO-ATeam2의 변형입니다. 27 우리는 mitGO-ATeam2 프로브를 (친절 H.의 연구실에서 제공하는 수정 노지, 연구소 오F 과학 및 낮은 복사 플라스미드는 효모 발현 벡터 pAG415GPD-ccdB (Addgene, 캠브리지, MA, USA)에 Xba1 및 HindIII 사이트를 통해 그것을 서브 클로닝하여 효모에있는 사용을위한 산업 연구, 오사카 대학, 일본), 강한 제정 GPD 프로모터를 포함. 우리는 신진 효모 mitGO-ATeam2을 표현하고 미토콘드리아의 ATP 수준의 생리적 변화를 측정 할 수있는 효과적인 프로브 역할은 미토콘드리아에 독점적 지역화 DNA-결합 염료 DAPI, 함께 counterstaining하여 찾을 수 있습니다. roGFP과 GO-ATeam은 유전자 인코딩됩니다 모두. 그 결과로, 그들은 도입 안정적으로 유지 그대로 세포 및 산화 환원 상태 나 개인, 살아있는 세포의 ATP 수준에 대한 정보를 제공 할 수 있습니다. 또한, 두 바이오 센서는 생리 학적 조건에서 산화 환원 상태 나 발생 ATP 수준의 변화를 모니터링합니다. 28 두 프로브도 비례합니다. 그 결과로,이 프로브로 만든 측정은 차에 의해 영향을받지 않습니다바이오 센서 농도​​ 또는 샘플의 조명이나 두께 nges. 마지막으로, 두 바이오 센서는 세포 내 공간 해상도를 제공합니다. 사실, roGFP은 미토콘드리아, ER을 대상으로하고 있으며, 엔도와 24 퍼 옥시 솜, 그리고 pH를 거의 독립적으로 이러한 세포 소기관의 각각의 산화 환원 상태의 변화를 감지 할 수 있습니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>1397-94-0</td>
			<td>Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. 
			 
			Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glycerol 
			0.05% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valap</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 &deg;C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: 
			Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment and Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides</td>
			<td>Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)</td>
			<td>3050</td>
			<td>Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY)</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td>These are less variable in thickness (170&plusmn;5 &mu;m) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td>
			<td>12-545E</td>
			<td>Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 &mu;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective</td>
			<td>Nikon (Melville, NY)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 3D Image Analysis software</td>
			<td>Perkin Elmer (Waltham, MA)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health (Bethesda, MD)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ratiometric biosensors that measure mitochondrial redox state and atp in living yeast cells

미토콘드리아는 에너지 대사와 세포의 수명과 프로그램 된 세포의 죽음으로 제어하는​​ 칼슘 항상성에서 많은 세포 과정에있는 역할을한다. 이러한 프로세스는 영향의 산화 환원 상태와 미토콘드리아 ATP 생산에 의해 영향을받습니다. 여기, 우리는 효모 세포를 생활에 세포 내 해상도에서 미토콘드리아의 산화 환원 상태와 ATP 수준을 감지 할 수있는 두 개의 비례, 유전자 인코딩 바이오 센서의 사용을 설명합니다. 미토콘드리아의 산화 환원 상태는 미토콘드리아의 매트릭스를 대상으로 산화 환원에 민감한 녹색 형광 단백질 (roGFP)를 사용하여 측정됩니다. 미토 roGFP 차례로 단백질의 여기 스펙트럼을 변경 가역 및 환경에 따라 산화와 환원을 거쳐 위치 147과 GFP의 204의 시스테인이 포함되어 있습니다. MitGO-ATeam은 F 오의 ε 소단위가 F 1-ATP 합성 효소를 사이에 끼워 넣으면되는 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 프로브는 기증자와 수용체 플루오을 무서워rescent 단백질. 을 가지고 단백질의 형태 변화 ε 소단위 결과로 ATP의 결합은 가까운 곳에서 기증자와 수용체를 무서워하고 기증자의 수용체에 형광 공명 에너지 전달을 허용합니다.

미토 roGFP와 미토콘드리아의 산화 환원 상태를 측정 여기, 우리는 미토 roGFP1 효모 세포의 성장 또는 미토콘드리아의 형태에 영향을주지 않고, 효모 살아있는 세포에서 감소하는 완전 산화에서 미토콘드리아의 산화 환원 상태의 변화를 감지하는 동적 범위를 가지고 것을 보여줍니다. 첫째, 우리는 미토콘드리아 대상 GFP 및 roGFP1을 표현하는 세포가 정상 요금 (그림 1A)에서<...

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Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

우리는 살아있는 효모 세포에서 세포 내 해상도에서 미토콘드리아의 산화 환원 상태와 ATP 수준을 모니터링하기 위해, GFP를 기반으로하는 두 개의 비례, 유전자 인코딩 바이오 센서의 사용을 설명합니다.

생활 효모 세포에서 미토콘드리아 산화 환원 상태와 ATP를 측정 비례 바이오 센서

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

ratiometric-biosensors-that-measure-mitochondrial-redox-state-atp

Research

JoVE Journal

Bioengineering

21.0K 조회수.  Columbia University. 우리는 살아있는 효모 세포에서 세포 내 해상도에서 미토콘드리아의 산화 환원 상태와 ATP 수준을 모니터링하기 위해, GFP를 기반으로하는 두 개의 비례, 유전자 인코딩 바이오 센서의 사용을 설명합니다.

비디오: Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Measuring Yeast Mitochondrial Respiration While Maintaining Cellular Context

Mitochondrial Respiration Quantification in Yeast Whole Cells

Metabolism is mainly coordinated by cellular energy availability and environmental conditions. Assays for knowing how cells adapt energetic metabolism to different nutritional and environmental conditions give valuable information to elucidate molecular mechanisms. Oxidative phosphorylation is the primary source of ATP in most cells, and mitochondrial respiration activity is a key component of oxidative phosphorylation, maintaining mitochondrial membrane potential for ATP synthesis. Mitochondrial respiration is often studied in isolated mitochondria that are missing the cellular context. Here, we present a method for quantifying mitochondrial respiration in yeast-intact cells. This method applies to any yeast species, although it has been generally used for Saccharomyces cerevisiae cells. First, the yeast growth in specific conditions is tested. Then, cells are washed and resuspended in deionized water with a 1:1 ratio (w/v). Cells are then placed in an oximeter chamber with constant stirring, and a Clark electrode is used to quantify oxygen consumption. Some molecules are sequentially placed into the chamber and selected according to this effect on the electron transport chain or ATP synthesis. ATPase inhibitor oligomycin is first added to measure respiration coupled to ATP synthesis. Afterward, an uncoupler is used to measure the maximal respiratory capacity. Finally, a mix of electron transport chain inhibitors is added to discard oxygen consumption unrelated to mitochondrial respiration. Data are analyzed using a linear regression to obtain the slope, representing the oxygen consumption rate. The advantage of this method is that it is specific for yeast mitochondrial respiration, maintaining the cellular context. It is essential to highlight that inhibitors used in mitochondrial respiration quantification could vary between yeast species.

Author Spotlight: Assessing Mitochondrial Respiration in Intact Yeast Cells Using an Oximeter Chamber Method

Mitochondrial respiration in yeast whole cells is a valuable indicator of cell bioenergetics. Here, we present a protocol to quantify this phenotype applicable to different yeast species.

Metabolism is mainly coordinated by cellular energy availability and environmental conditions. Assays for knowing how cells adapt energetic metabolism to ...

연구

생화학

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Vacuolar and cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in overall pH homeostasis. We describe protocols for ratiometric measurement of pH in vivo using pH-sensitive fluorophores localized to the vacuole or cytosol. Vacuolar pH is measured using BCECF, which localizes to the vacuole in yeast when introduced into cells in its acetoxymethyl ester form. Cytosolic pH is measured with a pH-sensitive GFP expressed under control of a yeast promoter, yeast pHluorin. Methods for measurement of fluorescence ratios in yeast cell suspensions in a fluorimeter are described. Through these protocols, single time point measurements of pH under different conditions or in different yeast mutants have been compared and changes in pH over time have been monitored. These methods have also been adapted to a fluorescence plate reader format for high-throughput experiments. Advantages of ratiometric pH measurements over other approaches currently in use, potential experimental problems and solutions, and prospects for future use of these techniques are also described.

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Vacuolar and cytosolic pH can be measured in live yeast (S. cerevisiae) cells using ratiometric fluorescent dyes localized to specific cellular compartments. We describe procedures for measuring vacuolar pH with BCECF-AM, which localizes to the vacuole in yeast, and cytosolic pH with a cytosolic ratiometric pH-sensitive GFP (yeast pHluorin).

액포와 세포질의 pH 측정<em&gt; 생체 내</em&gt; 효모 세포 현탁액의

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

생물학

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant thiol-disulfide redox buffer glutathione is considered a central player in antioxidant defenses. Therefore, measuring the mitochondrial glutathione redox potential provides useful information about mitochondrial redox status and oxidative stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) is a genetically encoded, green fluorescent protein (GFP)-based ratiometric indicator of the glutathione redox potential that has two redox-state-sensitive excitation peaks at 400 nm and 490 nm with a single emission peak at 510 nm. This article describes how to perform confocal live microscopy of mitochondria-targeted Grx1-roGFP2 in primary hippocampal and cortical neurons. It describes how to assess steady-state mitochondrial glutathione redox potential (e.g., to compare disease states or long-term treatments) and how to measure redox changes upon acute treatments (using the excitotoxic drug N-methyl-D-aspartate (NMDA) as an example). In addition, the article presents co-imaging of Grx1-roGFP2 and the mitochondrial membrane potential indicator, tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), to demonstrate how Grx1-roGPF2 can be multiplexed with additional indicators for multiparametric analyses. This protocol provides a detailed description of how to (i) optimize confocal laser scanning microscope settings, (ii) apply drugs for stimulation followed by sensor calibration with diamide and dithiothreitol, and (iii) analyze data with ImageJ/FIJI.

This article describes a protocol to determine differences in basal redox state and redox responses to acute perturbations in primary hippocampal and cortical neurons using confocal live microscopy. The protocol can be applied to other cell types and microscopes with minimal modifications.

비율 표시기를 사용하여 1 차 신경에 있는 미토콘드리아 글루타티온 Redox 상태의 살아있는 화상 진찰

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

신경과학

Measurement of Mitochondrial Membrane Potential In Vivo using a Genetically Encoded Voltage Indicator

Mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is critical for mitochondrial functions, including ATP synthesis, ion transport, reactive oxygen species (ROS) generation, and the import of proteins encoded by the nucleus. Existing methods for measuring &#916;&#936;m typically use lipophilic cation dyes, such as Rhodamine 800 and tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM), but these are limited by low specificity and are not well-suited for in vivo applications. To address these limitations, we have developed a novel protocol utilizing genetically encoded voltage indicators (GEVIs). Genetically encoded voltage indicators (GEVIs), which generate fluorescent signals in response to membrane potential changes, have demonstrated significant potential for monitoring plasma membrane and neuronal potentials. However, their application to mitochondrial membranes remains unexplored. Here, we developed protein-based mitochondrial-targeted GEVIs capable of detecting &#916;&#936;m fluctuations in cells and the motor cortex of living animals. The mitochondrial potential indicator (MPI)offers a non-invasive approach to study &#916;&#936;m dynamics in real-time, providing a method to investigate mitochondrial function under both normal and pathological conditions.

This protocol describes the application of mitochondria-targeted genetically encoded voltage indicators (GEVIs). These GEVIs offer a significant advantage over traditional mitochondrial membrane potential dyes by enabling specific, in vivo, and real-time monitoring of mitochondrial membrane potential.

유전적으로 인코딩된 전압 표시기를 사용한 생체 내 미토콘드리아 막 전위 측정

Mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is critical for mitochondrial functions, including ATP synthesis, ion transport, reactive oxygen ...

mtHyper7을 사용한 살아있는 효모 세포의 미토콘드리아 과산화물 이미징

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

저자 스포트라이트: 미토콘드리아 연구의 발전 - 세포 내 분석을 위한 mtHyper7 바이오센서 

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

살아있는 효모 세포에서 미토콘드리아 과산화물을 위한 비율계량 바이오센서인 mtHyPer7의 이미징

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...